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Immunology and Infection

डबल लेबलिंग Immunofluorescence मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति से एंटीबॉडी का उपयोग कर

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62219
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil
* These authors contributed equally

Summary

यहां, प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस कैसे किया जाए। इसके अलावा, यह इस प्रोटोकॉल में एक अलग मेजबान से तीसरे एंटीबॉडी को शामिल कर सकता है। यह दृष्टिकोण किसी भी सेल प्रकार और रोगजनकों में किया जा सकता है।

Abstract

आजकल, परजीवी-मेजबान सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध आणविक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला को ढूंढना संभव है। हालांकि, वाणिज्यिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए कुछ सीमाएं मौजूद हैं जो परजीवी में विशिष्ट कोशिका संरचनाओं और प्रोटीन को पहचानती हैं। इसके अलावा, ट्रिपैनोसोमैटिड लेबल करने के लिए कुछ वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। आमतौर पर, परजीवी के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी को घर में तैयार किया जाता है और एक ही प्रजाति में उत्पादित अन्य एंटीबॉडी के साथ संयोजन में उपयोग करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यहां, प्रोटोकॉल दर्शाता है कि मेजबान सेल और रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस करने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कैसे किया जाए। डबल लेबलिंग immunofluorescence प्राप्त करने के लिए, पहले माउस polyclonal एंटीबॉडी incubate और फिर द्वितीयक माउस IgG एंटीबॉडी किसी भी fluorochrome के लिए संयुग्मित के साथ इनक्यूबेशन का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। उसके बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी के किसी भी निशान को अगले माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाने से रोकने के लिए एक अतिरिक्त अवरुद्ध चरण आवश्यक है। फिर, एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और इसके विशिष्ट आईजीजी उपवर्ग माध्यमिक एंटीबॉडी एक अलग फ्लोरोक्रोम के लिए संयुग्मित उचित समय पर नमूने में जोड़े जाते हैं। इसके अतिरिक्त, एक अलग प्रजाति में उठाए गए तीसरे एंटीबॉडी का उपयोग करके ट्रिपल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस करना संभव है। इसके अलावा, नाभिक और एक्टिन जैसी संरचनाओं को बाद में उनके विशिष्ट यौगिकों या लेबल के साथ दाग दिया जा सकता है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत इन दृष्टिकोणों को किसी भी सेल के लिए समायोजित किया जा सकता है जिसके प्राथमिक एंटीबॉडी के स्रोत सीमित हैं।

Introduction

सेलुलर स्तर पर मेजबान सेल के साथ रोगज़नक़ की बातचीत का अध्ययन करने के लिए रोग के अंतर्निहित कारणों पर आवश्यक जानकारी प्रदान करता है क्योंकि वायरस, बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ जैसे विभिन्न समूह, अधिकांश मेजबान सेल प्रकारों को संक्रमित कर सकते हैं1,2,3,4। यह संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को विकसित करने और पहचानने में भी मदद कर सकता है जो रोगज़नक़ के विकास को धीमा या बाधित कर सकते हैं। जीवित परिस्थितियों में, उत्पादित एंटीबॉडी स्व-घटकों, वायरस, जीवाणु घटकों या उत्पादों, कवक, परजीवी और अन्य 5 से एंटीजन को पहचानने के लिए जिम्मेदार हैं।

इस उद्देश्य के लिए, एंटीबॉडी व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं, मुख्य रूप से सेलुलर संरचनाओं और प्रोटीन के स्थान और कार्य को समझने के लिए। एकाधिक एंटीबॉडी लेबलिंग का उपयोग करने वाले कई अध्ययनों से पता चलता है कि अतिरिक्त ब्लॉकिंग चरण इम्युनोलोकलाइजेशन की विशिष्टता में योगदान करते हैं। इसके अलावा, अधिकांश वर्णित प्रोटोकॉल विशिष्ट वाणिज्यिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, जिसमें एक ही मेजबान प्रजातियों के एंटीबॉडी शामिल हैं6,7,8,9,10,11,12,13,14।

आमतौर पर, डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस विभिन्न प्रजातियों में उठाए गए दो एंटीबॉडी का उपयोग ब्याज की कोशिका संरचनाओं या रोगजनकों और मेजबान कोशिकाओं को उनके बीच बातचीत को देखने के लिए दागने के लिए करता है। हालांकि, यह एक समस्या हो सकती है जब कुछ रोगजनकों के लिए विशिष्ट कोई वाणिज्यिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी डबल लेबलिंग करने के लिए उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी संयुग्मन किट हैं, और प्राथमिक एंटीबॉडी को सीधे फ्लोरोफोर में एक सुकिनिमिडिल एस्टर प्रतिक्रिया 15 द्वारा संयुग्मित करना संभव है। समस्या यह है कि ये किट अक्सर महंगे होते हैं, और उन्हें लेबल करने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी होना आवश्यक है। यह जानते हुए, हमने ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी 16 में प्रोटीन स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए दो अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके सफलतापूर्वक एक डबल इम्युनोफ्लोरेसेंस विधि विकसित की। हालांकि, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी सहित इंट्रासेल्युलर परजीवी के लिए, इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन नहीं किया गया है। यहां, हम दिखाते हैं कि इंट्रासेल्युलर टी क्रूज़ी परजीवी और मेजबान कोशिका का अध्ययन करने के लिए डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस कैसे किया जाए, जो क्रॉस-प्रतिक्रियाओं के बिना एक ही प्रजाति में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इस विधि के अलावा, एक ट्रिपल इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग को एक अलग प्रजाति से तीसरे एंटीबॉडी के अलावा स्थापित किया गया है। ये दृष्टिकोण मदद करते हैं जब एंटीबॉडी का स्रोत सीमित होता है और किसी भी सेल प्रकार में उपयोग किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेल और परजीवी संस्कृतियों

  1. एलएलसी-एमके 2 (रीसस मंकी किडनी एपिथेलियल) कोशिकाओं को अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (सीसीएल -7) से 25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम) और एंटीबायोटिक दवाओं (100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक आरपीएमआई माध्यम में 5% सीओ 2 17 में 37 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करें।
  2. पिछले प्रोटोकॉल 18 के अनुसार ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (वाई स्ट्रेन) के साथ एलएलसी-एमके 2 कोशिकाओं को संक्रमित करें।
  3. एक 15 mL सेल संस्कृति शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में LLC-MK2 संक्रमित कोशिकाओं (5 mL) के supernatant ले लीजिए और 10 मिनट के लिए 500 x g पर centrifuge और 22 डिग्री सेल्सियस कम सेल मलबे के लिए. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूब रखें ताकि ट्रिपोमास्टिगोट्स को सुपरनेटेंट पर तैरने की अनुमति मिल सके।
  4. 22 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2500 x जी पर एक नई शंक्वाकार ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में supernatant ले लीजिए। supernatant त्यागें और एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गिनती द्वारा सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए पूर्ण RPMI माध्यम में परजीवी युक्त गोली resuspend.

2. नियंत्रण immunofluorescence प्रोटोकॉल

नोट: एक बार तय होने के बाद, एक सप्ताह के लिए 1x PBS (pH 7.2) में 4 °C पर coverslips युक्त प्लेटों को स्टोर करना संभव है। संग्रहीत करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं permeabilization चरण के माध्यम से नहीं गई हैं।

  1. 16 घंटे के लिए RPMI मीडिया में यूवी sterilized गोल coverslips युक्त 24 अच्छी तरह से प्लेटों में LLC-MK2 कोशिकाओं (2 x 104) को व्यवस्थित करें।
  2. संक्रमित कोशिकाओं के लिए, अनुपात में प्रत्येक अच्छी तरह से टी क्रूज़ी (आइटम 1.4) युक्त एक supernatant जोड़ें (MOI 10: 1) और संक्रमण के 6 ज के लिए छोड़ दें। पीबीएस समाधान के साथ पांच बार संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं वाले वॉश कवरलिप्स और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस (पीएच 7.2) में 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ तय किया गया है।
  3. कवरस्लिप को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं प्रत्येक 1x PBS (pH 7.2) के साथ।
  4. RT में 10 मिनट के लिए 1x PBS (PH 7.2) में 0.2% IGEPAL CA-630 के साथ coverslips permeabilize।
  5. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  6. ब्लॉकिंग समाधान के साथ आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट कवरलिप्स (1x PBS, pH 7.2 में 2% BSA)।
  7. इनक्यूबेट या तो माउस मोनोक्लोनल विरोधी hnRNPA1 (कमजोर पड़ने 1: 200) के साथ या माउस polyclonal विरोधी TcFAZ (कमजोर पड़ने 1: 100) एंटीबॉडी के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए कवरlips या तो अवरुद्ध समाधान में पतला.
  8. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  9. बकरी विरोधी माउस IgG एफ (ab')2 (एच + एल) एलेक्सा फ्लोर 488 (1: 600) के लिए संयुग्मित के साथ RT पर 30 मिनट के लिए coverslips incubate एक साथ phalloidin एलेक्सा 594 (1: 300) के लिए संयुग्मित करने के लिए मेजबान सेल में एक्टिन फिलामेंट्स (एफ-एक्टिन) को अवरुद्ध समाधान में पतला कर दिया।
  10. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBS (pH 7.2) के साथ तीन बार धोएं।
  11. स्लाइड की सतह पर DAPI माध्यम के साथ ProLong गोल्ड एंटीफ़ेड बढ़ते अभिकर्मक की एक छोटी राशि लागू करें।
  12. संदंश का उपयोग करते हुए, बुलबुले को बनाने से रोकने के लिए बढ़ते माध्यम में कवरस्लिप को धीरे से झुकाएं। एक बार सूखने के बाद, यदि वांछित हो तो कवरस्लिप को सील करें।

3. डबल लेबलिंग immunofluorescence प्रोटोकॉल मोनोक्लोनल और polyclonal एंटीबॉडी का उपयोग कर एक ही मेजबान में उठाया

  1. ऊपर वर्णित चरण 2.1 से 2.6 को दोहराएँ।
  2. इनक्यूबेट कवरलिप्स जिसमें संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाएं होती हैं, जिसमें इन-हाउस माउस पॉलीक्लोनल एंटी-टीसीएफएजेड एंटीबॉडी (1: 100) आरटी में 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला होता है।
  3. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  4. बकरी विरोधी माउस IgG एफ (ab')2 (एच + एल) एलेक्सा फ्लोर 647 (1: 600) ब्लॉकिंग समाधान में पतला करने के लिए संयुग्मित के साथ आरटी में 30 मिनट के लिए incubate coverslips.
  5. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  6. Rt पर 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में AffiniPure खरगोश विरोधी माउस IgG (H + L) पतला (0.12 मिलीग्राम / एमएल) के साथ दूसरा अवरुद्ध चरण निष्पादित करें।
  7. कवरस्लिप को 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBS (pH 7.2) के साथ तीन बार धोएं। फिर माउस मोनोक्लोनल एंटी-hnRNP A1 IgG2b एंटीबॉडी (1:200) के साथ आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  9. बकरी विरोधी माउस IgG2b एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 488 (1: 600) के लिए संयुग्मित और phalloidin एलेक्सा 594 (1: 300) ब्लॉकिंग समाधान में पतला करने के लिए संयुग्मित के साथ 30 मिनट के लिए coverslips incubate.
  10. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  11. ऊपर वर्णित चरण 2.8 से 2.10 को दोहराएँ।

4. ट्रिपल लेबलिंग immunofluorescence प्रोटोकॉल विभिन्न मेजबान प्रजातियों से तीसरे polyclonal एंटीबॉडी के अलावा के साथ

नोट: अतिरिक्त लेबलिंग के लिए, IgG subclasses, एंटीबॉडी आइसोटाइप पर ध्यान दें, और एंटीबॉडी के क्रम का पालन करें: 1. माउस पॉलीक्लोनल, 2. खरगोश पॉलीक्लोनल, 3. दूसरा ब्लॉक, और 4. माउस मोनोक्लोनल। सही फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी चुनने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में उपलब्ध लेजर के प्रकार पर विचार करें।

  1. ऊपर वर्णित चरण 2.1 से 2.6 को दोहराएँ।
  2. चरण 3.2 से 3.5 (धोने के चरण) के बाद, आरटी पर 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक नया इनक्यूबेशन शुरू करें।
  3. कवरस्लिप को 1x PBS (pH 7.2) के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं।
  4. बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी IgG एलेक्सा 647 (1: 600) के लिए संयुग्मित के साथ coverslips incubate 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में.
  5. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  6. Rt पर 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में AffiniPure खरगोश विरोधी माउस IgG (H + L) पतला (0.12 मिलीग्राम / एमएल) के साथ एक अवरुद्ध चरण निष्पादित करें।
  7. कवरलिप्स को 5 मिनट के लिए 1x PBS (pH 7.2) के साथ तीन बार धोएं और 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला किसी भी माउस मोनोक्लोनल आईजीजी सबक्लास एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  8. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  9. बकरी विरोधी माउस IgG subclass एंटीबॉडी की एक विशिष्ट जोड़ी एलेक्सा 594 (1: 600) के लिए संयुग्मित 30 मिनट के लिए coverlips incubate 30 मिनट के लिए ब्लॉकिंग समाधान में.
  10. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।

5. Confocal इमेजिंग अधिग्रहण

  1. एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर immunofluorescence नमूनों का विश्लेषण, एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ और एक photomultiplier ट्यूब (PMT) और हाइब्रिड डिटेक्टर (HyD) के साथ प्रतिदीप्ति का पता लगाने.
    नोट: हम Confocal माइक्रोस्कोपी के Multiuser प्रयोगशाला से सेटअप का इस्तेमाल किया - LMMC, Ribeirao Preto मेडिकल स्कूल, साओ पाउलो विश्वविद्यालय.
  2. अलग चैनलों के साथ सभी confocal छवियों का अधिग्रहण. एडोब फ़ोटोशॉप का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण करें।

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Representative Results

यहां, हम दिखाते हैं कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मेजबान-परजीवी इंटरैक्शन का अध्ययन कैसे किया जाए जब एंटीबॉडी का स्रोत वाणिज्यिक एंटीबॉडी की अनुपलब्धता के कारण सीमित होता है जो ट्रिपैनोसोमाटिड्स में विशिष्ट संरचनाओं और प्रोटीन को पहचानते हैं।

ट्रिपैनोसोमाटिड्स के बीच, टी क्रूज़ी में कशेरुक और अकशेरुकी मेजबानों के बीच विभिन्न विकास चरणों को शामिल करने वाले सबसे जटिल जीवन चक्रों में से एक है। टी क्रूज़ी जीवन चक्र के दौरान, स्तनधारी संक्रमण के शुरुआती चरण में, मेटासाइक्लिक ट्रिपोमास्टिगोट्स एक प्रक्रिया के माध्यम से कोशिकाओं पर आक्रमण करते हैं जिसमें परजीवी और कशेरुक मेजबान कोशिकाओं में मौजूद अणुओं की एक विस्तृत विविधता शामिल होती है 19,20। इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से टी क्रूज़ी, टी ब्रूसी और लीशमैनिया एसपी 16,21,22,23 के प्रोटीन के खिलाफ इन-हाउस पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन करती है ताकि वाणिज्यिक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और / या खरगोश एंटीबॉडी के साथ एक साथ उपयोग किया जा सके।

चित्रा 1 में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं के नियंत्रण प्रयोगों के साथ परिणाम दिखाती हैं, जो मेजबान सेल और आंतरिक परजीवी में एंटीबॉडी की विशिष्टता को उजागर करती हैं। माउस polyclonal एंटीबॉडी (विरोधी TcFAZ) हमारी प्रयोगशाला में उठाया परजीवी flagellum पर FAZ में केवल टी cruzi विशाल प्रोटीन को मान्यता दी है, लेकिन मेजबान सेल (चित्रा 1A) में नहीं. नाभिक में विषम परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन ए 124 का वितरण एक वाणिज्यिक माउस मोनोक्लोनल एंटी-एचएनआरएनपी ए 1 एंटीबॉडी का उपयोग करके देखा गया था जो केवल मेजबान स्तनधारी कोशिकाओं को पहचानता है लेकिन परजीवी को नहीं (चित्रा 1 बी)। इसके अलावा, मेजबान और परजीवी नाभिक और परजीवी किनेटोप्लास्ट को डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था, और मेजबान एफ-एक्टिन को एलेक्सा 594 (चित्रा 1) के संयुग्मित फेलोइडिन के साथ दाग दिया गया था। ये नियंत्रण परिणाम एंटीबॉडी की विशिष्टता दिखाते हैं, और फिर, हम डबल लेबलिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल (चित्रा 2) चला सकते हैं।

चित्रा 2 में, डबल लेबलिंग immunofluorescence मेजबान और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण परजीवी में प्रोटीन वितरण से पता चलता है। इस पद्धति का उपयोग करके एंटीबॉडी के बीच कोई क्रॉस-प्रतिक्रिया नहीं होती है। शुद्ध खरगोश विरोधी माउस IgG का उपयोग कर दूसरे अवरुद्ध कदम की दक्षता माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा nonspecific लेबलिंग को खराब करने के लिए पर्याप्त है। यह लेबलिंग परजीवी और मेजबान प्रोटीन के बीच बातचीत और संक्रमण के दौरान उनके व्यवहार का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: Confocal माइक्रोस्कोपी T. cruzi विशाल प्रोटीन (TcFAZ) और मेजबान hnRNP A1 के स्थानीयकरण को गैर-संक्रमित (NI) और संक्रमित (INF) LLC-MK2 कोशिकाओं में T. cruzi के साथ दिखा रहा है। (ए) टी cruzi विशाल प्रोटीन (TcFAZ) T. cruzi flagellum में स्थानीयकृत माउस polyclonal विरोधी TcFAZ एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है और बकरी विरोधी माउस IgG द्वितीयक एंटीबॉडी एलेक्सा 488 (हरे रंग) के लिए संयुग्मित के साथ कल्पना की है। (बी) एलएलसी-एमके 2 में मेजबान परमाणु एचएनआरएनपी ए 1 को माउस मोनोक्लोनल एंटी-एचएनआरएनपी ए 1 आईजीजी 2 बी एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है और बकरी एंटी-माउस आईजीजी 2 बी एंटीबॉडी द्वारा एलेक्सा 488 (हरे रंग) में संयुग्मित किया गया है। Phalloidin एलेक्सा 594 दाग एफ एक्टिन (लाल) के लिए संयुग्मित. नाभिक और किनेटोप्लास्ट DAPI (नीले) के साथ दागदार होते हैं। स्केल बार = 5 μm. सभी प्रयोग जैविक तीन प्रतियों में किए गए थे। सफेद तीर इंट्रासेल्युलर परजीवी को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डबल लेबलिंग immunofluorescence गैर संक्रमित (एनआई) और संक्रमित (INF) LLC-MK2 कोशिकाओं में एक ही मेजबान प्रजातियों में उठाए गए एंटीबॉडी के बीच नो-क्रॉस प्रतिक्रिया को दर्शाता है, जिसमें टी. क्रूज़ी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया है। फ्लैगेलम अनुलग्नक क्षेत्र (एफएजेड) में स्थानीयकृत विशाल प्रोटीन को माउस पॉलीक्लोनल एंटी-टीसीएफएजेड एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है और बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी द्वारा एलेक्सा 647 (लाल) के लिए संयुग्मित किया जाता है। मेजबान परमाणु hnRNP A1 माउस मोनोक्लोनल विरोधी hnRNP A1 IgG2b एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है और बकरी विरोधी माउस IgG2b एंटीबॉडी एलेक्सा 488 (हरे रंग) के लिए संयुग्मित द्वारा कल्पना की है। Phalloidin एलेक्सा 594 दाग एफ एक्टिन (ग्रे) करने के लिए संयुग्मित. नाभिक और किनेटोप्लास्ट DAPI (नीले) के साथ दागदार होते हैं। मर्ज की गई छवियों को संकेत के रूप में दिखाया गया है। इनसेट मेजबान नाभिक के बढ़े हुए क्षेत्र से मेल खाता है। बार = 5 μm. सभी प्रयोग जैविक तीन प्रतियों में किए गए थे। सफेद तीर मेजबान सेल नाभिक के पास परजीवी की उपस्थिति को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक ही प्रजाति से व्युत्पन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अनुक्रमिक डबल immunostaining के योजनाबद्ध चित्रण। आरेख इस प्रोटोकॉल की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एंटीबॉडी के क्रम को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम एक ही मेजबान प्रजातियों से दो अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं में डबल इम्युनोलेबलिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। अध्ययन करने के लिए, अधिक विस्तार के साथ, संक्रमण के निहितार्थ, नाभिक या साइटोसोलिक ऑर्गेनेल जैसे मेजबान सेल में संरचनाओं को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, इसका उपयोग पोस्ट-एम्बेडिंग पतले अनुभाग इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग विधि में किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण ट्रिपैनोसोमाटिड्स और अन्य परजीवियों का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध कुछ एंटीबॉडी होने की बाधा को दूर करने में मदद करता है।

इसके अतिरिक्त, हमारे प्रोटोकॉल से पता चला है कि एक इंट्रासेल्युलर परजीवी को मेजबान सेल के साथ लेबल किया जाता है, एक ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस में दो यूकेरियोट्स, विभिन्न प्रकार के ऊतकों में महसूस किए गए प्रोटोकॉल से अलग 7,8,9,10,11,12,13,14 . हमारे प्रोटोकॉल से पता चलता है कि प्राथमिक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के किसी भी एपिटोप को दूसरे माध्यमिक एंटीबॉडी (चरण 3.9) द्वारा पहचाना नहीं जा सकता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि एंटीबॉडी के बीच कोई क्रॉस-प्रतिक्रिया नहीं होती है (चित्रा 3)। इस पद्धति की सफलता शुद्ध खरगोश विरोधी माउस IgG का उपयोग कर अवरुद्ध कदम (चरण 3.6) की दक्षता के कारण है। Ansorg et al. (2015) द्वारा वर्णित एक समान प्रोटोकॉल में दो अतिरिक्त ब्लॉकिंग हैं, जहां पहला प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही मेजबान से सीरम का उपयोग करता है और दूसरा असंयुग्मित फैब-टुकड़े 6 के साथ महसूस किया जाता है। इसके अलावा, दूसरे ब्लॉकिंग के बिना, झूठी-सकारात्मक लेबलिंग हो सकती है, जैसा कि इन लेखकों द्वारा समझाया गया है।

इसके अलावा, ट्रिपल इम्युनोलेबलिंग के लिए, एक खरगोश मेजबान प्रजातियों के तीसरे एंटीबॉडी को प्रोटोकॉल (चरण 4.2) में ऊपर वर्णित दूसरे अवरुद्ध चरण से पहले जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, एक से अधिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करना संभव है क्योंकि उनके पास अलग-अलग आईजीजी उपवर्ग हैं। इसके लिए, उनके बीच क्रॉस-रिएक्टिविटी को कम करने के लिए संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी को अत्यधिक अधिशोषित किया जाना चाहिए। विभिन्न आईजीजी उपवर्गों का उपयोग क्रॉस-प्रतिक्रिया के बिना एक ही मेजबान एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति देता है। ये प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन झूठे-सकारात्मक परिणामों से बचने के लिए नियंत्रण समूह आवश्यक हैं। IgG subclasses और उनके गुणों की विशिष्टता डबल और ट्रिपल लेबलिंग करना संभव बनाती है। यह बताया गया है कि IgG subclasses पूरक सक्रियण और अंतर-भारी श्रृंखला डाइसल्फ़ाइड बांड, काज क्षेत्र अमीनो एसिड, आणविक द्रव्यमान (kDa), और सापेक्ष बहुतायत (प्रतिशत में) प्रोटीन, saccharides, और एलर्जी 25 के जवाब में में एफसी रिसेप्टर्स में भिन्न होते हैं। उनके पास काज संरचना अमीनो एसिड में मामूली अंतर है, जो प्रत्येक आईजीजी उपवर्ग की स्थिरता और लचीलेपन को प्रभावित करता है। IgG2 में एक एमिनो एसिड विलोपन और एक अतिरिक्त अंतर-भारी श्रृंखला डाइसल्फ़ाइड पुल 25 के साथ एक CH2 क्षेत्र के कारण सभी IgG उपवर्गों का सबसे छोटा और यहां तक कि अधिक कठोर काज है।

संक्षेप में, मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल एंटीबॉडी के किसी भी संयोजन के लिए अनुकूलित एक बुनियादी और विस्तृत तकनीक प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण इम्यूनोफ्लोरेसेंस को लागत प्रभावी बनाता है और एंटीबॉडी का स्रोत सीमित होने पर मदद कर सकता है। प्रोटोकॉल एक साथ संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में रोगजनकों और मेजबान सेल प्रोटीन का पता लगा सकता है; यह भी किसी भी सेल प्रकार और मुक्त रहने वाले जीवों के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी या वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) द्वारा MMAB तक समर्थित किया गया था, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA द्वारा MMAB और Coordenação de Aperfeçoamento de Pessoal de Nível -000 सीजी-सी ने CAPES से एक मास्टर और डॉक्टरेट फैलोशिप प्राप्त की और LAMT-S ने CNPq से डॉक्टरेट फैलोशिप प्राप्त की। हम Confocal माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए Elizabete आर मिलानी और LLC-MK2 कोशिकाओं (Ribeirao Preto मेडिकल स्कूल, यूएसपी) प्रदान करने के लिए डॉ Dario Zamboni धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody Life technologies, USA A21141 Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch, USA 315-005-003 Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A11017 Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody Life technologies, USA A21125 Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A21237 Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b Sigma-Aldrich, USA R4528 Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody Our lab In-house Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, USA A2153-10G Albumin protein
Detergent Igepal CA-630 Sigma-Aldrich, USA I3021 Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo fisher scientific, USA 12657-029 Serum
Penicillin Streptomycin Gibco, Thermo fisher scientific, USA 15140-122 Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594 Life technologies, USA A12381 Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI Life technologies, USA P36935 Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine Corning, USA 10-040-CV Cell culture media
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich, USA T4049-100ML Bioreagent

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 173 immunolabeling डबल लेबलिंग एक ही मेजबान एंटीबॉडी मेजबान रोगज़नक़ बातचीत
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Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. A. M., Baqui, M. M. A. Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (173), e62219, doi:10.3791/62219 (2021).

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