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Immunology and Infection

Doble etiquetado inmunofluorescencia utilizando anticuerpos de la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62219
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, el protocolo describe cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Además, puede incluir el tercer anticuerpo de un huésped diferente en este protocolo. Este enfoque se puede hacer en cualquier tipo de célula y patógenos.

Abstract

Hoy en día, es posible encontrar una amplia gama de herramientas moleculares disponibles para estudiar las interacciones parásito-célula huésped. Sin embargo, existen algunas limitaciones para obtener anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales que reconozcan estructuras celulares y proteínas específicas en los parásitos. Además, hay pocos anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar tripanosomátidos. Por lo general, los anticuerpos policlonales contra los parásitos se preparan internamente y podrían ser más difíciles de usar en combinación con otros anticuerpos producidos en la misma especie. Aquí, el protocolo demuestra cómo usar anticuerpos policlonales y monoclonales criados en la misma especie para realizar inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar las interacciones entre la célula huésped y el patógeno. Para lograr la inmunofluorescencia de doble etiquetado, es crucial incubar primero el anticuerpo policlonal de ratón y luego seguir la incubación con el anticuerpo IgG secundario de ratón conjugado a cualquier fluorocromo. Después de eso, es necesario un paso de bloqueo adicional para evitar que cualquier rastro del anticuerpo primario sea reconocido por el siguiente anticuerpo secundario. Luego, un anticuerpo monoclonal de ratón y su anticuerpo secundario de subclase IgG específico conjugado a un fluorocromo diferente se agregan a la muestra en los momentos apropiados. Además, es posible realizar un triple etiquetado de inmunofluorescencia utilizando un tercer anticuerpo criado en una especie diferente. Además, estructuras como los núcleos y la actina se pueden teñir posteriormente con sus compuestos o etiquetas específicas. Por lo tanto, estos enfoques presentados aquí se pueden ajustar para cualquier célula cuyas fuentes de anticuerpos primarios son limitadas.

Introduction

Estudiar la interacción del patógeno con la célula huésped a nivel celular proporciona información esencial sobre las causas subyacentes de la enfermedad, ya que diferentes grupos, como virus, bacterias y protozoos, pueden infectar a la mayoría de los tipos de células huésped1,2,3,4. También puede ayudar a desarrollar e identificar posibles objetivos terapéuticos que pueden retardar o inhibir el crecimiento del patógeno. En condiciones de vida, los anticuerpos producidos son responsables de reconocer autocomponentes, antígenos de virus, componentes o productos bacterianos, hongos, parásitos y otros5.

Para este propósito, los anticuerpos son herramientas ampliamente utilizadas, principalmente para comprender la ubicación y la función de las estructuras celulares y las proteínas. Varios estudios que utilizan el etiquetado de múltiples anticuerpos demuestran que los pasos de bloqueo adicionales contribuyen a la especificidad de la inmunolocalización. Además, la mayoría de los protocolos descritos utilizan anticuerpos monoclonales comerciales específicos, incluidos anticuerpos de la misma especie huésped6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Por lo general, la inmunofluorescencia de doble etiquetado utiliza dos anticuerpos criados en diferentes especies para teñir las estructuras celulares de interés o los patógenos y las células huésped para ver la interacción entre ellos. Sin embargo, esto puede ser un problema cuando no hay anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales específicos para algunos patógenos disponibles para realizar el doble etiquetado. Además, existen kits de conjugación de anticuerpos disponibles comercialmente, y es posible conjugar los anticuerpos primarios directamente al fluoróforo mediante una reacción de éster de succinimidil15. El problema es que estos kits suelen ser caros, y es necesario tener suficientes anticuerpos para etiquetarlos. Sabiendo esto, desarrollamos con éxito un método de doble inmunofluorescencia utilizando dos anticuerpos diferentes criados en la misma especie para estudiar la localización de proteínas en Trypanosoma brucei16. Sin embargo, para los parásitos intracelulares, incluido Trypanosoma cruzi, este enfoque no se ha demostrado. Aquí, mostramos cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar los parásitos intracelulares de T. cruzi y la célula huésped utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie sin reacciones cruzadas. Además de este método, se ha establecido un etiquetado de triple inmunofluorescencia con la adición del tercer anticuerpo de una especie diferente. Estos enfoques ayudan cuando la fuente de anticuerpos es limitada y se puede utilizar en cualquier tipo de célula.

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Protocol

1. Cultivos celulares y parasitarios

  1. Cultivar células LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de la American Type Culture Collection (CCL-7) en un matraz de cultivo celular de 25 cm2 que contiene en medio RPMI suplementado con FBS (Fetal Bovine Serum) inactivado por calor al 10% y antibióticos (100 U/mL penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C en 5% CO2 17.
  2. Infectar células LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (cepa Y) según un protocolo previo 18.
  3. Recoger el sobrenadante de las células infectadas con LLC-MK2 (5 mL) en un tubo de centrífuga cónica de cultivo celular de 15 mL y centrífuga a 500 x g durante 10 minutos y 22 °C para reducir los restos celulares. Mantenga el tubo durante 10 minutos a 37 °C para permitir que los tripomastigotes naden hasta el sobrenadante.
  4. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo cónico y centrifugar a 2500 x g durante 15 minutos a 22 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo que contiene los parásitos en medio RPMI completo para determinar la densidad celular contando las células en una cámara de Neubauer.

2. Protocolo de inmunofluorescencia de control

NOTA: Una vez fijado, es posible almacenar placas que contengan recubiertas a 4 °C en 1x PBS (pH 7.2) durante una semana. Para ser almacenadas, es importante que las células no hayan pasado por el paso de permeabilización.

  1. Asiente las células LLC-MK2 (2 x 104) en 24 placas de pocillos que contienen fundas redondeadas esterilizadas por UV en medios RPMI durante 16 horas.
  2. Para las células infectadas, añadir un sobrenadante que contenga T. cruzi (ítem 1.4) a cada pocillo en proporción (MOI 10:1) y dejar durante 6 h de infección. Lave las fundas que contienen células infectadas y no infectadas cinco veces con solución de PBS y fijada con paraformaldehído al 2% en 1x PBS (pH 7.2) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Lave los cubrehojas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS (pH 7.2).
  4. Permeabilizar las cubiertas con 0,2% IGEPAL CA-630 en 1x PBS (PH 7,2) durante 10 min a RT.
  5. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  6. Incubar los coverslips durante 30 min a RT con la solución de bloqueo (2% BSA en 1x PBS, pH 7.2).
  7. Incubar los recubiertos durante 30 min a RT, ya sea con anticuerpos monoclonales anti-hnRNPA1 (dilución 1:200) o con anticuerpos anti-TcFAZ policlonales de ratón (dilución 1:100) diluidos en solución bloqueante.
  8. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  9. Incubar los coverslips durante 30 min a RT con IgG F (ab')2 (H+L) anti-ratón de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (1:600) junto con faloidina conjugada a Alexa 594 (1:300) para teñir filamentos de actina (F-actina) en la célula huésped diluida en la solución de bloqueo.
  10. Lavar tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 min cada uno.
  11. Aplique una pequeña cantidad de reactivo de montaje antifade ProLong Gold con medio DAPI a la superficie de la corredera.
  12. Con fórceps, incline suavemente la cubierta en el medio de montaje para evitar que se formen burbujas. Una vez seco, selle el cubrehojas si lo desea.

3. Protocolo de inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales criados en el mismo huésped

  1. Repita los pasos 2.1 a 2.6 descritos anteriormente.
  2. Incubar cápsulas que contengan células infectadas y no infectadas con anticuerpos policlonales anti-TcFAZ policlonales de ratón internos (1:100) diluidos en solución bloqueadora durante 30 min a RT.
  3. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  4. Incubar los cobertores durante 30 min a RT con IgG F (ab')2 (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 647 (1:600) diluido en la solución de bloqueo.
  5. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  6. Realice el segundo paso de bloqueo con AffiniPure conejo anti-ratón IgG (H + L) diluido (0.12 mg / ml) en solución de bloqueo durante 30 min a RT.
  7. Lave los cubrehojas tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 min cada uno. Luego incubar con anticuerpos monoclonales anti-hnRNP A1 IgG2b (1:200) de ratón durante 30 min a RT.
  8. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  9. Incubar los coverslips durante 30 min con anticuerpo IgG2b anti-ratón de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (1:600) y con faloidina conjugada a Alexa 594 (1:300) diluido en la solución de bloqueo.
  10. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  11. Repita los pasos 2.8 a 2.10 descritos anteriormente.

4. Protocolo de inmunofluorescencia de triple etiquetado con la adición del tercer anticuerpo policlonal de diferentes especies huésped

NOTA: Para el etiquetado adicional, tenga en cuenta las subclases de IgG, los isotipos de anticuerpos y siga el orden de los anticuerpos: 1. policlonal de ratón, 2. policlonal de conejo, 3. segundo bloque y 4. monoclonal de ratón. Considere el tipo de láseres disponibles en el microscopio confocal para elegir el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo correcto.

  1. Repita los pasos 2.1 a 2.6 descritos anteriormente.
  2. Después de los pasos 3.2 a 3.5 (paso de lavado), comience una nueva incubación con anticuerpos policlonales de conejo en solución bloqueadora durante 30 minutos a RT.
  3. Lave los cubrehojas tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 minutos cada uno.
  4. Incubar los cobertores con anticuerpos igG anti-conejo de cabra conjugados a Alexa 647 (1:600) en solución de bloqueo durante 30 minutos.
  5. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  6. Realice un paso de bloqueo con AffiniPure conejo anti-ratón IgG (H + L) diluido (0.12 mg / ml) en solución de bloqueo durante 30 min a RT.
  7. Lave los cubrehojas tres veces con 1 pbS (pH 7.2) durante 5 minutos cada uno e incube con cualquier anticuerpo monoclonal igG de ratón diluido en solución de bloqueo durante 30 minutos.
  8. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.
  9. Incubar los cubrehojas durante 30 minutos con un par específico de anticuerpos de la subclase IgG anti-ratón de cabra conjugados a Alexa 594 (1:600) en solución de bloqueo durante 30 minutos.
  10. Lave las fundas tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS.

5. Adquisición de imágenes confocales

  1. Analizar las muestras de inmunofluorescencia utilizando un microscopio confocal, con un objetivo de inmersión en aceite 63X y detectar la fluorescencia con un tubo fotomultiplicador (PMT) y un detector híbrido (HyD).
    NOTA: Utilizamos la configuración del Laboratorio Multiusuario de Microscopía Confocal - LMMC, Facultad de Medicina Ribeirao Preto, Universidad de Sao Paulo.
  2. Adquiere todas las imágenes confocales con canales separados. Realice el procesamiento de imágenes con Adobe Photoshop.

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Representative Results

Aquí, mostramos cómo estudiar las interacciones huésped-parásito por inmunofluorescencia cuando la fuente de anticuerpos es limitada debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos comerciales que reconocen estructuras y proteínas específicas en tripanosomátidos.

Entre los tripanosomátidos, T. cruzi tiene uno de los ciclos de vida más complejos que involucran varias etapas de desarrollo entre vertebrados e invertebrados huéspedes 19. Durante el ciclo de vida de T. cruzi, en una etapa temprana de la infección de mamíferos, los tripomastigotes metacíclicos invaden las células a través de un proceso que involucra una amplia variedad de moléculas presentes en los parásitos y las células huésped de los vertebrados 19,20. Para estudiar estos procesos, nuestro laboratorio produce rutinariamente anticuerpos policlonales internos contra proteínas de T. cruzi, T. brucei y Leishmania sp16,21,22,23 para usar junto con anticuerpos monoclonales comerciales de ratón y/o con anticuerpos de conejo.

En la Figura 1, las imágenes de microscopía confocal muestran los resultados con los experimentos de control de células infectadas y no infectadas, destacando la especificidad de los anticuerpos en la célula huésped y el parásito internalizado. El anticuerpo policlonal de ratón (anti-TcFAZ) criado en nuestro laboratorio reconoció solo la proteína gigante T. cruzi en la FAZ en el flagelo del parásito, pero no en la célula huésped (Figura 1A). La distribución de la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A124 en los núcleos se observó utilizando un anticuerpo anti-hnRNP A1 monoclonal de ratón comercial que reconoce solo las células de mamíferos huésped pero no el parásito (Figura 1B). Además, los núcleos del huésped y del parásito y los cinetoplastos del parásito se tiñeron con DAPI, y la F-actina del huésped se tiñó con faloidina conjugada a Alexa 594 (Figura 1). Estos resultados de control muestran la especificidad de los anticuerpos, y luego, podemos ejecutar el protocolo de inmunofluorescencia de doble etiquetado (Figura 2).

En la Figura 2, la inmunofluorescencia de doble etiquetado muestra las distribuciones de proteínas en el huésped y el parásito analizados por microscopía confocal. No se producen reacciones cruzadas entre los anticuerpos que utilizan esta metodología. La eficiencia del segundo paso de bloqueo utilizando IgG anti-ratón de conejo purificado es suficiente para perjudicar el etiquetado inespecífico por los anticuerpos secundarios. Este etiquetado permite estudiar la interacción entre el parásito y las proteínas del huésped y su comportamiento durante la infección.

Figure 1
Figura 1: Microscopía confocal que muestra la localización de la proteína gigante de T. cruzi (TcFAZ) y el huésped hnRNP A1 en células LLC-MK2 no infectadas (NI) e infectadas (INF) con T. cruzi. (A) La proteína gigante de T. cruzi (TcFAZ) localizada en el flagelo de T. cruzi está marcada con anticuerpos policlonales anti-TcFAZ de ratón y visualizadas con el anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado a Alexa 488 (verde). (B) El hnRNP A1 nuclear del huésped en LLC-MK2 está marcado con anticuerpos anti-hnRNP A1 IgG2b monoclonales de ratón y visualizados por anticuerpos IgG2b anti-ratón de cabra conjugados con Alexa 488 (verde). La faloidina conjugada con Alexa 594 tiñe F-actina (rojo). Los núcleos y los cinetoplastos se tiñen con DAPI (azul). Barra de escala = 5 μm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado biológico. Las flechas blancas indican parásitos intracelulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La inmunofluorescencia de doble etiquetado muestra una reacción no cruzada entre anticuerpos criados en la misma especie huésped en células LLC-MK2 no infectadas (NI) e infectadas (INF) con T. cruzi analizada por microscopía confocal. La proteína gigante localizada en la zona de unión del flagelo (FAZ) está marcada con anticuerpos policlonales anti-TcFAZ de ratón y visualizadas por el anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 647 (rojo). El hnRNP A1 nuclear del huésped está marcado con anticuerpos anti-hnRNP A1 IgG2b monoclonales de ratón y visualizados por el anticuerpo IgG2b anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 488 (verde). Faloidina conjugada a Alexa 594 tiñe F-actina (gris). Los núcleos y los cinetoplastos se tiñen con DAPI (azul). Las imágenes combinadas se muestran como se indica. El recuadro corresponde al área ampliada del núcleo huésped. Bar=5 μm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado biológico. La flecha blanca muestra la presencia del parásito cerca del núcleo de la célula huésped. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustración esquemática de doble inmunotinción secuencial con anticuerpos primarios derivados de la misma especie. El diagrama muestra el orden de los anticuerpos para garantizar la eficiencia de este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un doble inmunoetiquetado en células infectadas por Trypanosoma cruzi utilizando dos anticuerpos diferentes de la misma especie huésped. Para estudiar, con más detalle, las implicaciones de la infección, se pueden etiquetar estructuras en la célula huésped como el núcleo u orgánulos citosólicos utilizando este protocolo. Además, se puede utilizar en el método de etiquetado de inmunogold de sección delgada posterior a la incrustación. Este enfoque ayuda a superar el obstáculo de tener pocos anticuerpos disponibles para estudiar tripanosomátidos y otros parásitos.

Además, nuestro protocolo mostró que un parásito intracelular está marcado junto con la célula huésped, dos eucariotas en la misma inmunofluorescencia, diferentes de los protocolos realizados en diferentes tipos de tejidos7,8,9,10,11,12,13,14 . Nuestro protocolo muestra que ningún epítopo del anticuerpo policlonal primario puede ser reconocido por el segundo anticuerpo secundario (paso 3.9), asegurando que no se produzcan reacciones cruzadas entre los anticuerpos (Figura 3). El éxito de esta metodología se debe a la eficiencia del paso de bloqueo (paso 3.6) utilizando IgG anti-ratón de conejo purificado. Un protocolo similar descrito por Ansorg et al. (2015) tiene dos bloqueos adicionales, donde el primero utiliza suero del mismo huésped que el anticuerpo primario y el segundo se realiza con fragmentos de Fab no conjugados6. Además, sin el segundo bloqueo, puede ocurrir un etiquetado de falsos positivos, como explican estos autores 6.

Además, para el triple inmunoetiquetado, se puede agregar el tercer anticuerpo de una especie huésped de conejo antes del segundo paso de bloqueo descrito anteriormente en el protocolo (paso 4.2). Además, es posible utilizar más de un anticuerpo monoclonal ya que tienen diferentes subclases de IgG. Para ello, los anticuerpos secundarios correspondientes deben ser altamente adsorbidos para minimizar la reactividad cruzada entre ellos. El uso de diferentes subclases de IgG permite la utilización de los mismos anticuerpos del huésped sin reacción cruzada. Estos protocolos funcionan bien, pero los grupos de control son necesarios para evitar resultados falsos positivos. La especificidad de las subclases IgG y sus propiedades permite hacer doble y triple etiquetado. Se ha reportado que las subclases IgG difieren en la activación del complemento y los receptores Fc en los enlaces disulfuro de cadena interpesada, aminoácidos de la región bisagra, masa molecular (kDa) y la abundancia relativa (en porcentaje) en respuesta a proteínas, sacáridos y alérgenos 25. Tienen ligeras diferencias en los aminoácidos de la estructura de la bisagra, influyendo en la estabilidad y flexibilidad de cada subclase de IgG. IgG2 tiene la bisagra más corta e incluso más rígida de todas las subclases de IgG debido a una región CH2 con una deleción de aminoácidos y un puente disulfuro de cadena interpesada adicional 25.

En resumen, el protocolo aquí descrito para estudiar las interacciones huésped-patógeno presenta una técnica básica y elaborada adaptada a cualquier combinación de anticuerpos. Este enfoque hace que la inmunofluorescencia sea rentable y puede ayudar cuando la fuente de anticuerpos es limitada. El protocolo puede detectar simultáneamente patógenos y las proteínas de la célula huésped en las células huésped infectadas; también se puede aplicar a cualquier tipo de célula y organismos de vida libre.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses contrapuestos o financieros.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) a MMAB, por fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA a MMAB y por Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - código financiero 001. CG-C recibió una beca de maestría y doctorado de CAPES y LAMT-S recibió una beca de doctorado de CNPq. Agradecemos a Elizabete R. Milani por la asistencia en microscopía confocal y al Dr. Darío Zamboni por proporcionar células LLC-MK2 (Facultad de Medicina de Ribeirao Preto, USP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody Life technologies, USA A21141 Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch, USA 315-005-003 Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A11017 Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody Life technologies, USA A21125 Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A21237 Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b Sigma-Aldrich, USA R4528 Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody Our lab In-house Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, USA A2153-10G Albumin protein
Detergent Igepal CA-630 Sigma-Aldrich, USA I3021 Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo fisher scientific, USA 12657-029 Serum
Penicillin Streptomycin Gibco, Thermo fisher scientific, USA 15140-122 Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594 Life technologies, USA A12381 Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI Life technologies, USA P36935 Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine Corning, USA 10-040-CV Cell culture media
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich, USA T4049-100ML Bioreagent

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Inmunología e infección número 173 inmunoetiquetado doble etiquetado mismos anticuerpos del huésped interacción huésped-patógeno
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