Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dubbelmärkning av immunofluorescens med antikroppar från samma art för att studera värdpatogeninteraktioner

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62219
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver protokollet hur man utför dubbelmärkning av immunofluorescens med hjälp av primära antikroppar uppfödda i samma art för att studera värdpatogeninteraktioner. Det kan också inkludera den tredje antikroppen från en annan värd i detta protokoll. Detta tillvägagångssätt kan göras i alla celltyper och patogener.

Abstract

Numera är det möjligt att hitta ett brett utbud av molekylära verktyg tillgängliga för att studera parasit-värd cellinteraktioner. Vissa begränsningar finns dock för att erhålla kommersiella monoklonala eller polyklonala antikroppar som känner igen specifika cellstrukturer och proteiner i parasiter. Dessutom finns det få kommersiella antikroppar tillgängliga för att märka trypanosomatids. Vanligtvis framställs polyklonala antikroppar mot parasiter internt och kan vara mer utmanande att använda i kombination med andra antikroppar som produceras i samma art. Här visar protokollet hur man använder polyklonala och monoklonala antikroppar uppfödda i samma art för att utföra dubbelmärkning av immunofluorescens för att studera värdcells- och patogeninteraktioner. För att uppnå dubbelmärkning av immunofluorescens är det viktigt att först inkubera musens polyklonala antikropp och sedan följa inkubationen med den sekundära musen IgG-antikroppen konjugerad till någon fluorokrom. Därefter är ett ytterligare blockeringssteg nödvändigt för att förhindra att spår av den primära antikroppen känns igen av nästa sekundära antikropp. Därefter tillsätts en monoklonal antikropp för mus och dess specifika sekundär antikropp i IgG som konjugerats till en annan fluorokrom i provet vid lämpliga tidpunkter. Dessutom är det möjligt att utföra trippelmärkning av immunofluorescens med hjälp av en tredje antikropp uppfödd i en annan art. Strukturer som atomkärnor och aktin kan också färgas senare med sina specifika föreningar eller etiketter. Således kan dessa metoder som presenteras här justeras för alla celler vars källor till primära antikroppar är begränsade.

Introduction

Att studera patogenens interaktion med värdcellen på cellnivå ger viktig information om de underliggande orsakerna till sjukdomen eftersom olika grupper, såsom virus, bakterier och protozoer, kan infektera de flesta värdcelltyper1,2,3,4. Det kan också hjälpa till att utveckla och identifiera potentiella terapeutiska mål som kan bromsa eller hämma patogenens tillväxt. I levande förhållanden är de producerade antikropparna ansvariga för att känna igen självkomponenter, antigener från virus, bakteriella komponenter eller produkter, svampar, parasiter och andra5.

För detta ändamål används antikroppar i stor utsträckning, främst för att förstå placeringen och funktionen av cellulära strukturer och proteiner. Flera studier med multipla antikroppsmärkning visar att ytterligare blockeringssteg bidrar till immunlokaliseringens specificitet. Dessutom använder de flesta beskrivna protokoll specifika kommersiella monoklonala antikroppar, inklusive antikroppar från samma värdart6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Vanligtvis använder dubbelmärkning av immunofluorescens två antikroppar uppfödda i olika arter för att färga cellstrukturerna av intresse eller patogenerna och värdcellerna för att se interaktionen mellan dem. Detta kan dock vara ett problem när inga kommersiella monoklonala eller polyklonala antikroppar som är specifika för vissa patogener är tillgängliga för att utföra dubbelmärkning. Det finns också kommersiellt tillgängliga antikroppskonjugationssatser, och det är möjligt att konjugera de primära antikropparna direkt till fluoroforen genom en succinimidylestersreaktion15. Problemet är att dessa kit ofta är dyra, och det är nödvändigt att ha tillräckligt med antikroppar för att märka dem. Med vetskap om detta utvecklade vi framgångsrikt en dubbel immunofluorescensmetod med hjälp av två olika antikroppar uppfödda i samma art för att studera proteinlokalisering i Trypanosoma brucei16. För intracellulära parasiter, inklusive Trypanosoma cruzi, har detta tillvägagångssätt dock inte visats. Här visar vi hur man utför dubbelmärkning av immunofluorescens för att studera intracellulära T. cruzi parasiter och värdcellen med primära antikroppar uppfödda i samma art utan korsreaktioner. Förutom denna metod har en trippel immunofluorescensmärkning fastställts med tillsats av den tredje antikroppen från en annan art. Dessa metoder hjälper när källan till antikroppar är begränsad och kan användas i alla celltyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell- och parasitkulturer

  1. Odla LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) celler från American Type Culture Collection (CCL-7) i en 25 cm2 cellodlingkolv som innehåller i RPMI-medium kompletterad med 10% värmeinaktiverad FBS (Fetal Bovine Serum) och antibiotika (100 U/ mL Penicillin och 100 μg / mL Streptomycin) vid 37 °C i 5% CO2 17.
  2. Infektera LLC-MK2 celler med Trypanosoma cruzi (Y stam) enligt ett tidigare protokoll 18.
  3. Samla supernatanten av DE LLC-MK2 infekterade cellerna (5 ml) i en 15 mL cellodling konisk centrifugrör och centrifug vid 500 x g i 10 minuter och 22 °C för att sänka cellskräp. Håll röret i 10 minuter vid 37 °C så att trypomastigotes kan simma till supernatanten.
  4. Samla supernatanten i ett nytt koniskt rör och centrifugera vid 2500 x g i 15 minuter vid 22 °C. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten som innehåller parasiterna i fullständigt RPMI-medium för att bestämma celltätheten genom att räkna celler i en Neubauer-kammare.

2. Kontrollera immunfluorescensprotokollet

OBS: När det är fast är det möjligt att förvara plattor som innehåller täckbesked vid 4 °C i 1x PBS (pH 7.2) i en vecka. För att lagras är det viktigt att cellerna inte har gått igenom permeabiliseringssteget.

  1. Settle LLC-MK2 celler (2 x 104) i 24 brunnsplattor som innehåller UV-steriliserade rundade täcken i RPMI-media i 16 timmar.
  2. För infekterade celler, tillsätt ett supernatant som innehåller T. cruzi (punkt 1.4) till varje brunn i proportion (MOI 10:1) och lämna för 6 h infektion. Tvätta täcken som innehåller infekterade och icke-infekterade celler fem gånger med PBS-lösning och fixeras med 2% paraformaldehyd i 1x PBS (pH 7.2) i 10 min vid rumstemperatur (RT).
  3. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS (pH 7.2).
  4. Permeabilize täcksliparna med 0,2% IGEPAL CA-630 i 1x PBS (PH 7.2) i 10 min på RT.
  5. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  6. Inkubera täckskydd i 30 min vid RT med blockeringslösningen (2% BSA i 1x PBS, pH 7,2).
  7. Inkubera täckglas i 30 minuter vid RT antingen med musmonoklonala anti-hnRNPA1 (utspädning 1:200) eller med muspolyklonala anti-TcFAZ(utspädning 1:100) antikroppar utspädda i blockerande lösning.
  8. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  9. Inkubera täckglasen i 30 minuter vid RT med get antimus IgG F (ab')2 (H+L) konjugerad till Alexa Fluor 488 (1:600) tillsammans med falloidin konjugerad till Alexa 594 (1:300) för att färga aktinfilament (F-aktin) i värdcellen utspädd i blockeringslösningen.
  10. Tvätta tre gånger med 1x PBS (pH 7,2) i 5 min vardera.
  11. Applicera en liten mängd ProLong Gold antifade montering reagens med DAPI medium på ytan av bilden.
  12. Använd tång, luta försiktigt täcket i monteringsmediet för att förhindra att bubblor bildas. När du är torr, försegla täckslipet om så önskas.

3. Dubbelmärkning av immunofluorescensprotokoll med monoklonala och polyklonala antikroppar uppfödda i samma värd

  1. Upprepa steg 2.1–2.6 som beskrivs ovan.
  2. Inkubera täckblad som innehåller infekterade och icke-infekterade celler med intern muspolyklonal anti-TcFAZ-antikropp (1:100) utspädd i blockeringslösning i 30 min vid RT.
  3. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  4. Inkubera täckglas i 30 minuter vid RT med get antimus IgG F (ab')2 (H+L) konjugerad till Alexa Fluor 647 (1:600) utspädd i blockeringslösningen.
  5. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  6. Utför det andra blockeringssteget med AffiniPure kanin antimus IgG (H +L) utspädd (0,12 mg/ml) i blockeringslösning i 30 min vid RT.
  7. Tvätta täcksläparna tre gånger med 1x PBS (pH 7.2) i 5 min vardera. Inkubera sedan med mus monoklonal anti-hnRNP A1 IgG2b antikropp (1:200) i 30 min på RT.
  8. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  9. Inkubera täcksliparna i 30 minuter med get antimus IgG2b antikropp konjugerad till Alexa Fluor 488 (1:600) och med falloidin konjugerad till Alexa 594 (1:300) utspädd i blockeringslösningen.
  10. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  11. Upprepa steg 2.8–2.10 som beskrivs ovan.

4. Trippelmärkning av immunfluorescensprotokoll med tillsats av den tredje polyklonala antikroppen från olika värdarter

OBS: För ytterligare märkning, notera IgG-underklasserna, antikroppsisotyperna och följ ordningen av antikroppar: 1. muspolyklonal, 2. kaninpolyklonal, 3. andra block och 4. musmonoklonal. Tänk på vilken typ av lasrar som finns i det konfokala mikroskopet för att välja rätt fluoroforkonjugerad sekundär antikropp.

  1. Upprepa steg 2.1–2.6 som beskrivs ovan.
  2. Efter steg 3,2 till 3,5 (tvättsteg), starta en ny inkubation med kaninpolyklonal antikropp i blockeringslösningen i 30 minuter vid RT.
  3. Tvätta täcksläparna tre gånger med 1x PBS (pH 7.2) i 5 minuter vardera.
  4. Inkubera täckena med getantikroppen IgG konjugerad till Alexa 647 (1:600) i blockeringslösning i 30 minuter.
  5. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  6. Utför ett blockerande steg med AffiniPure kanin antimus IgG (H +L) utspädd (0,12 mg/ml) i blockeringslösning i 30 min vid RT.
  7. Tvätta täcksliparna tre gånger med 1x PBS (pH 7.2) i 5 minuter vardera och inkubera med alla musmonoklonala IgG-subklassantikroppar utspädda i blockerande lösning i 30 minuter.
  8. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.
  9. Inkubera täcksliparna i 30 minuter med ett specifikt par get antimus-IgG-underklassantikropp konjugerad till Alexa 594 (1:600) i blockeringslösning i 30 minuter.
  10. Tvätta täcksläparna tre gånger i 5 minuter vardera med 1x PBS.

5. Confocal imaging förvärv

  1. Analysera immunofluorescensproverna med hjälp av ett konfokalt mikroskop, med ett 63X oljesänkningsmål och detektera fluorescensen med ett fotomultipliktplierrör (PMT) och hybriddetektor (HyD).
    OBS: Vi använde installationen från Multiuser Laboratory of Confocal Microscopy - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo.
  2. Hämta alla konfokala bilder med separerade kanaler. Utför bildbehandling med Adobe Photoshop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här visar vi hur man studerar värd-parasitinteraktioner genom immunofluorescens när källan till antikroppar är begränsad på grund av otillgängligheten av kommersiella antikroppar som känner igen specifika strukturer och proteiner i trypanosomatids.

Bland trypanosomatids har T. cruzi en av de mest komplexa livscyklerna som involverar olika utvecklingsstadier mellan ryggradsdjur och ryggradslösa djur värdar 19. Under T. cruzi livscykeln, i ett tidigt skede av däggdjursinfektion, invaderar metacykliska trypomastigotes celler genom en process som involverar en mängd olika molekyler som finns i parasiter och ryggradsdjurens värdceller 19,20. För att studera dessa processer producerar vårt laboratorium rutinmässigt interna polyklonala antikroppar mot proteiner av T. cruzi, T. brucei och Leishmania sp16,21,22,23 att använda tillsammans med kommersiella mus monoklonala antikroppar och / eller med kanin antikroppar.

I figur 1 visar konfokal mikroskopibilder resultaten med kontrollexperiment av infekterade och icke-infekterade celler, vilket belyser specificiteten hos antikropparna i värdcellen och den internaliserade parasiten. Musen polyklonal antikropp (anti-TcFAZ) som lyfts i vårt labb kände igen endast T. cruzi jätte protein i FAZ vid parasiten flagellum men inte i värdcellen (figur 1A). Fördelningen av heterogena nukleära ribonucleoprotein A124 i atomkärnorna observerades med hjälp av en kommersiell mus monoklonal anti-hnRNP A1 antikropp som känner igen endast värd däggdjursceller men inte parasiten (figur 1B). Värd och parasitkärnor och parasit kinetoplasts färgades också med DAPI, och värd F-aktin färgades med Phalloidin konjugerad till Alexa 594 (figur 1). Dessa kontrollresultat visar antikropparnas specificitet, och sedan kan vi köra dubbelmärkningen av immunfluorescensprotokollet (figur 2).

I figur 2 visar dubbelmärkning av immunofluorescens proteinfördelningen i värden och parasiten analyserad av konfokal mikroskopi. Inga korsreaktioner förekommer mellan antikroppar med denna metod. Effektiviteten hos det andra blockeringssteget med renad kanin antimus IgG är tillräckligt för att försämra den ospecificerade märkningen av de sekundära antikropparna. Denna märkning gör det möjligt att studera interaktionen mellan parasiten och värdproteinerna och deras beteende under infektion.

Figure 1
Figur 1: Konfokal mikroskopi som visar lokaliseringen av T. cruzi jätteprotein (TcFAZ) och värd hnRNP A1 i icke-infekterade (NI) och infekterade (INF) LLC-MK2 celler med T. cruzi. (A) T. cruzi jätteprotein (TcFAZ) lokaliserat i T. cruzi flagellum är märkt med muspolyklonal anti-TcFAZ-antikropp och visualiseras med get antimus IgG sekundär antikropp konjugerad till Alexa 488 (grön). (B) Värd nukleär hnRNP A1 i LLC-MK2 är märkt med musmonoklonal anti-hnRNP A1 IgG2b antikropp och visualiseras av get antimus IgG2b antikropp konjugerad till Alexa 488 (grön). Phalloidin konjugerad till Alexa 594 fläckar F-aktin (röd). Nuklei och kinetoplaster är färgade med DAPI (blå). Skalstång = 5 μm. Alla experiment gjordes i biologisk tredikat. Vita pilar indikerar intracellulära parasiter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Dubbelmärkning av immunofluorescens visar no-cross reaktion mellan antikroppar uppfödda i samma värdart i icke-infekterade (NI) och infekterade (INF) LLC-MK2 celler med T. cruzi analyseras av Confocal Microscopy. Jätteprotein lokaliserat i flagellumbilagazonen (FAZ) är märkt med mus polyklonal anti-TcFAZ antikropp och visualiseras av get anti-mus IgG antikropp konjugerad till Alexa 647 (röd). Värd nukleära hnRNP A1 är märkt med mus monoklonal anti-hnRNP A1 IgG2b antikropp och visualiseras av get anti-mus IgG2b antikropp konjugerad till Alexa 488 (grön). Phalloidin konjugerad till Alexa 594 fläckar F-aktin (grå). Nuklei och kinetoplaster är färgade med DAPI (blå). Sammanfogade bilder visas som angiven. Infälld motsvarar värdkärnans förstorade område. Bar=5 μm. Alla experiment gjordes i biologisk tredikat. Den vita pilen visar närvaron av parasiten nära värdcellkärnan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Schematisk illustration av sekventiell dubbel immunstainering med primära antikroppar som härrör från samma art. Diagrammet visar ordningen på antikropparna för att säkerställa effektiviteten i detta protokoll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra dubbel immunmärkning i Trypanosoma cruzi infekterade celler med två olika antikroppar från samma värdart. För att studera, med mer detaljer, infektionens konsekvenser, kan strukturer i värdcellen som kärnan eller cytosoliska organeller märkas med hjälp av detta protokoll. Det kan också användas i den postinbäddning av tunn sektion immunogold märkningsmetod. Detta tillvägagångssätt hjälper till att övervinna hindret för att ha få antikroppar tillgängliga för att studera trypanosomatids och andra parasiter.

Dessutom visade vårt protokoll att en intracellulär parasit är märkt tillsammans med värdcellen, två eukaryoter i samma immunofluorescens, som skiljer sig från de protokoll som realiseras i olika typer av vävnader7,8,9,10,11,12,13,14 . Vårt protokoll visar att ingen epitop av den primära polyklonala antikroppen kan kännas igen av den andra sekundära antikroppen (steg 3.9), vilket säkerställer att inga korsreaktioner uppstår mellan antikropparna (figur 3). Framgången med denna metod beror på effektiviteten hos blockeringssteget (steg 3.6) med renad kanin antimus IgG. Ett liknande protokoll som beskrivs av Ansorg et al. (2015) har ytterligare två blockeringar, där den första använder serum från samma värd som den primära antikroppen och den andra realiseras med okonjugerade Fab-fragment6. Utan den andra blockeringen kan också falskt positiv märkning uppstå, vilket förklaras av dessa författare 6.

För trippelimmunmärkning kan dessutom den tredje antikroppen hos en kaninvärdart tillsättas före det andra blockeringssteget som beskrivs ovan i protokollet (steg 4.2). Det är också möjligt att använda mer än en monoklonal antikropp eftersom de har olika IgG-underklasser. För detta bör motsvarande sekundära antikroppar vara mycket adsorberade för att minimera korsreaktivitet mellan dem. Användningen av olika IgG-underklasser möjliggör användning av samma värdantikroppar utan korsreaktion. Dessa protokoll fungerar bra, men kontrollgrupper är nödvändiga för att undvika falskt positiva resultat. Specificiteten hos IgG-underklasser och deras egenskaper gör det möjligt att göra dubbel- och trippelmärkning. Det har rapporterats att IgG-underklasserna skiljer sig åt i komplementaktiveringen och Fc-receptorerna i de intertunga kedjedisulfidbindningarna, gångjärnsregionen aminosyror, molekylmassa (kDa) och det relativa överflöd (i procent) som svar på proteiner, sackarider och allergener 25. De har små skillnader i gångjärnsstrukturen aminosyror, vilket påverkar stabiliteten och flexibiliteten hos varje IgG-underklass. IgG2 har det kortaste och ännu styvaste gångjärnet av alla IgG-underklasser på grund av en CH2-region med en aminosyraborttagning och en extra inter-tung kedjedisulfidbro 25.

Sammanfattningsvis presenterar protokollet som beskrivs här för att studera värdpatogena interaktioner en grundläggande och utarbetad teknik anpassad till alla kombinationer av antikroppar. Detta tillvägagångssätt gör immunofluorescens kostnadseffektivt och kan hjälpa när källan till antikroppar är begränsad. Protokollet kan samtidigt upptäcka patogener och värdcellproteiner i infekterade värdceller; Det kan också appliceras på alla celltyper och frilevande organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) till MMAB, av Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA till MMAB och av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - finanskod 001. CG-C fick ett master- och doktorandstipendium från CAPES och LAMT-S fick doktorandstipendium från CNPq. Vi tackar Elizabete R. Milani för konfokal mikroskopihjälp och Dr Dario Zamboni för att ha tillhandahållit LLC-MK2-celler (Ribeirao Preto Medical School, USP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody Life technologies, USA A21141 Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch, USA 315-005-003 Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A11017 Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody Life technologies, USA A21125 Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A21237 Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b Sigma-Aldrich, USA R4528 Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody Our lab In-house Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, USA A2153-10G Albumin protein
Detergent Igepal CA-630 Sigma-Aldrich, USA I3021 Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo fisher scientific, USA 12657-029 Serum
Penicillin Streptomycin Gibco, Thermo fisher scientific, USA 15140-122 Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594 Life technologies, USA A12381 Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI Life technologies, USA P36935 Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine Corning, USA 10-040-CV Cell culture media
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich, USA T4049-100ML Bioreagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).

Tags

Immunologi och infektion nummer 173 immunmärkning dubbelmärkning samma värdantikroppar värdpatogen interaktion
Dubbelmärkning av immunofluorescens med antikroppar från samma art för att studera värdpatogeninteraktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. … More

Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. A. M., Baqui, M. M. A. Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (173), e62219, doi:10.3791/62219 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter