Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62219
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil
* These authors contributed equally

Summary

Ici, le protocole décrit comment effectuer une immunofluorescence à double marquage en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène. En outre, il peut inclure le troisième anticorps d’un hôte différent dans ce protocole. Cette approche peut être faite dans n’importe quel type de cellule et d’agents pathogènes.

Abstract

De nos jours, il est possible de trouver un large éventail d’outils moléculaires disponibles pour étudier les interactions parasite-cellule hôte. Cependant, certaines limites existent pour obtenir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux commerciaux qui reconnaissent des structures cellulaires et des protéines spécifiques chez les parasites. En outre, il existe peu d’anticorps commerciaux disponibles pour marquer les trypanosomatidés. Habituellement, les anticorps polyclonaux contre les parasites sont préparés en interne et pourraient être plus difficiles à utiliser en combinaison avec d’autres anticorps produits chez la même espèce. Ici, le protocole montre comment utiliser des anticorps polyclonaux et monoclonaux élevés chez la même espèce pour effectuer une immunofluorescence à double marquage afin d’étudier les interactions entre les cellules hôtes et les agents pathogènes. Pour obtenir l’immunofluorescence à double marquage, il est crucial d’incuber d’abord l’anticorps polyclonal de la souris, puis de suivre l’incubation avec l’anticorps IgG secondaire de la souris conjugué à n’importe quel fluorochrome. Après cela, une étape de blocage supplémentaire est nécessaire pour empêcher toute trace de l’anticorps primaire d’être reconnue par l’anticorps secondaire suivant. Ensuite, un anticorps monoclonal de souris et son anticorps secondaire spécifique de sous-classe IgG conjugué à un fluorochrome différent sont ajoutés à l’échantillon aux moments appropriés. De plus, il est possible d’effectuer une immunofluorescence à triple marquage à l’aide d’un troisième anticorps élevé chez une espèce différente. En outre, des structures telles que les noyaux et l’actine peuvent être colorées ultérieurement avec leurs composés ou étiquettes spécifiques. Ainsi, ces approches présentées ici peuvent être ajustées pour toute cellule dont les sources d’anticorps primaires sont limitées.

Introduction

Étudier l’interaction de l’agent pathogène avec la cellule hôte au niveau cellulaire fournit des informations essentielles sur les causes sous-jacentes de la maladie, car différents groupes, tels que les virus, les bactéries et les protozoaires, peuvent infecter la plupart des types de cellules hôtes1,2,3,4. Il peut également aider à développer et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent ralentir ou inhiber la croissance de l’agent pathogène. Dans des conditions de vie, les anticorps produits sont responsables de la reconnaissance des auto-composants, des antigènes des virus, des composants ou produits bactériens, des champignons, des parasites et autres5.

À cette fin, les anticorps sont des outils largement utilisés, principalement pour comprendre l’emplacement et la fonction des structures cellulaires et des protéines. Plusieurs études utilisant le marquage d’anticorps multiples démontrent que des étapes de blocage supplémentaires contribuent à la spécificité de l’immunolocalisation. En outre, la plupart des protocoles décrits utilisent des anticorps monoclonaux commerciaux spécifiques, y compris des anticorps de la même espèce hôte6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Habituellement, l’immunofluorescence à double marquage utilise deux anticorps élevés chez des espèces différentes pour colorer les structures cellulaires d’intérêt ou les agents pathogènes et les cellules hôtes pour voir l’interaction entre eux. Cependant, cela peut être un problème lorsqu’aucun anticorps commercial monoclonal ou polyclonal spécifique à certains agents pathogènes n’est disponible pour effectuer le double marquage. En outre, il existe des kits de conjugaison d’anticorps disponibles dans le commerce, et il est possible de conjuguer les anticorps primaires directement au fluorophore par une réaction d’ester de succinimidyle15. Le problème est que ces kits sont souvent coûteux, et il est nécessaire d’avoir suffisamment d’anticorps pour les étiqueter. Sachant cela, nous avons développé avec succès une méthode de double immunofluorescence utilisant deux anticorps différents élevés dans la même espèce pour étudier la localisation des protéines dans Trypanosoma brucei16. Cependant, pour les parasites intracellulaires, y compris Trypanosoma cruzi, cette approche n’a pas été démontrée. Ici, nous montrons comment effectuer une immunofluorescence à double marquage pour étudier les parasites intracellulaires de T. cruzi et la cellule hôte en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce sans réactions croisées. Outre cette méthode, un triple marquage par immunofluorescence a été établi avec l’ajout du troisième anticorps d’une espèce différente. Ces approches aident lorsque la source d’anticorps est limitée et peuvent être utilisées dans n’importe quel type de cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultures de cellules et de parasites

  1. Cultiver des cellules LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de l’American Type Culture Collection (CCL-7) dans une fiole de culture cellulaire de 25 cm2 contenant dans un milieu RPMI complété par 10% de FBS (Sérum Fœtal Bovin) inactivé par la chaleur et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C dans 5% de CO2 17.
  2. Infecter les cellules LLC-MK2 avec Trypanosoma cruzi (souche Y) selon un protocole précédent 18.
  3. Recueillir le surnageant des cellules infectées par LLC-MK2 (5 mL) dans un tube de centrifugeuse conique de culture cellulaire de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 10 minutes et 22 °C pour réduire les débris cellulaires. Conservez le tube pendant 10 minutes à 37 °C pour permettre aux trypomastigotes de nager jusqu’au surnageant.
  4. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube conique et centrifuger à 2500 x g pendant 15 minutes à 22 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant les parasites dans un milieu RPMI complet pour déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules dans une chambre de Neubauer.

2. Protocole d’immunofluorescence de contrôle

REMARQUE: Une fois fixés, il est possible de stocker des plaques contenant des couvercles à 4 ° C dans 1x PBS (pH 7,2) pendant une semaine. Pour être stockées, il est important que les cellules ne soient pas passées par l’étape de la perméabilisation.

  1. Déposez les cellules LLC-MK2 (2 x 104) dans 24 plaques de puits contenant des couvercles arrondis stérilisés aux UV dans des milieux RPMI pendant 16 heures.
  2. Pour les cellules infectées, ajouter un surnageant contenant T. cruzi (point 1.4) à chaque puits en proportion (MOI 10:1) et laisser reposer pendant 6 h d’infection. Laver les couvercles contenant des cellules infectées et non infectées cinq fois avec une solution de PBS et fixés avec 2% de paraformaldéhyde dans 1x PBS (pH 7,2) pendant 10 min à température ambiante (RT).
  3. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS (pH 7,2).
  4. Perméabiliser les couvercles avec 0,2% IGEPAL CA-630 en 1x PBS (PH 7.2) pendant 10 min à RT.
  5. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  6. Incuber des couvercles pendant 30 min à RT avec la solution bloquante (2% de BSA dans 1x PBS, pH 7,2).
  7. Incuber les couvercles pendant 30 min à TA soit avec des anticorps anti-hnRNPA1 monoclonaux de souris (dilution 1:200) ou avec des anticorps polyclonaux anti-TcFAZ (dilution 1:100) de souris dilués dans une solution bloquante.
  8. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  9. Incuber les couvercles pendant 30 min à RT avec de l’IgG F (ab')2 (H+L) anti-souris de chèvre conjuguée à Alexa Fluor 488 (1:600) avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (1:300) pour colorer les filaments d’actine (F-actine) dans la cellule hôte diluée dans la solution bloquante.
  10. Laver trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 min chacun.
  11. Appliquez une petite quantité de réactif de montage antifade ProLong Gold avec un milieu DAPI sur la surface de la glissière.
  12. À l’aide d’une pince, inclinez doucement le couvercle dans le support de montage pour empêcher la formation de bulles. Une fois sec, scellez le couvercle si vous le souhaitez.

3. Protocole d’immunofluorescence à double marquage utilisant des anticorps monoclonaux et polyclonaux élevés dans le même hôte

  1. Répétez les étapes 2.1 à 2.6 décrites ci-dessus.
  2. Incuber des couvercles contenant des cellules infectées et non infectées avec un anticorps polyclonal anti-TcFAZ de souris interne (1:100) dilué dans une solution bloquante pendant 30 min à TA.
  3. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  4. Incuber des couvercles pendant 30 min à TA avec des IgG F (ab')2 (H+L) anti-souris de chèvre conjuguées à Alexa Fluor 647 (1:600) diluées dans la solution bloquante.
  5. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  6. Effectuez la deuxième étape de blocage avec AffiniPure lapin anti-souris IgG (H + L) dilué (0,12 mg / mL) dans une solution bloquante pendant 30 min à TA.
  7. Lavez les couvercles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 min chacun. Puis incuber avec un anticorps monoclonal anti-hnRNP A1 IgG2b de souris (1:200) pendant 30 min à TA.
  8. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  9. Incuber les couvercles pendant 30 min avec un anticorps IgG2b anti-souris de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488 (1:600) et avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (1:300) diluée dans la solution bloquante.
  10. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  11. Répétez les étapes 2.8 à 2.10 décrites ci-dessus.

4. Protocole d’immunofluorescence à triple marquage avec l’ajout du troisième anticorps polyclonal de différentes espèces hôtes

REMARQUE: Pour l’étiquetage supplémentaire, notez les sous-classes IgG, les isotypes d’anticorps et suivez l’ordre des anticorps: 1. polyclonal de souris, 2. polyclonal de lapin, 3. deuxième bloc et 4. monoclonal de souris. Considérez le type de lasers disponibles dans le microscope confocal pour choisir le bon anticorps secondaire conjugué au fluorophore.

  1. Répétez les étapes 2.1 à 2.6 décrites ci-dessus.
  2. Après les étapes 3.2 à 3.5 (étape de lavage), commencez une nouvelle incubation avec un anticorps polyclonal de lapin en solution bloquante pendant 30 minutes à TA.
  3. Lavez les couvercles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 minutes chacun.
  4. Incuber les couvercles avec des IgG d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugués à Alexa 647 (1:600) dans une solution bloquante pendant 30 minutes.
  5. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  6. Effectuez une étape de blocage avec AffiniPure lapin anti-souris IgG (H + L) dilué (0,12 mg / mL) dans une solution de blocage pendant 30 min à RT.
  7. Lavez les couvercles trois fois avec 1x PBS (pH 7,2) pendant 5 minutes chacun et incubez avec n’importe quel anticorps monoclonal de la sous-classe IgG de souris dilué dans une solution bloquante pendant 30 minutes.
  8. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.
  9. Incuber les couvercles pendant 30 minutes avec une paire spécifique d’anticorps de sous-classe IgG anti-souris de chèvre conjugués à Alexa 594 (1:600) en solution bloquante pendant 30 minutes.
  10. Lavez les couvercles trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS.

5. Acquisition d’imagerie confocale

  1. Analysez les échantillons d’immunofluorescence à l’aide d’un microscope confocal, avec un objectif d’immersion dans l’huile 63X et détectez la fluorescence avec un tube photomultiplicateur (PMT) et un détecteur hybride (HyD).
    REMARQUE: Nous avons utilisé la configuration du laboratoire multi-utilisateurs de microscopie confocale - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, Université de Sao Paulo.
  2. Acquérez toutes les images confocales avec des canaux séparés. Effectuez le traitement d’image à l’aide d’Adobe Photoshop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ici, nous montrons comment étudier les interactions hôte-parasite par immunofluorescence lorsque la source d’anticorps est limitée en raison de l’indisponibilité d’anticorps commerciaux qui reconnaissent des structures et des protéines spécifiques chez les trypanosomatidés.

Parmi les trypanosomatidés, T. cruzi a l’un des cycles de vie les plus complexes impliquant divers stades de développement entre les hôtes vertébrés et invertébrés 19. Au cours du cycle de vie de T. cruzi, à un stade précoce de l’infection chez les mammifères, les trypomastigotes métacycliques envahissent les cellules par un processus qui implique une grande variété de molécules présentes dans les parasites et les cellules hôtes des vertébrés 19,20. Pour étudier ces processus, notre laboratoire produit régulièrement des anticorps polyclonaux internes contre les protéines de T. cruzi, T. brucei et Leishmania sp16,21,22,23 à utiliser avec des anticorps monoclonaux de souris commerciaux et/ou avec des anticorps de lapin.

Dans la figure 1, les images de microscopie confocale montrent les résultats avec les expériences de contrôle de cellules infectées et non infectées, soulignant la spécificité des anticorps dans la cellule hôte et le parasite internalisé. L’anticorps polyclonal de souris (anti-TcFAZ) élevé dans notre laboratoire n’a reconnu que la protéine géante de T. cruzi dans la FAZ au niveau du flagelle du parasite, mais pas dans la cellule hôte (Figure 1A). La distribution de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A124 dans les noyaux a été observée à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-hnRNP A1 monoclonal de souris commercial qui ne reconnaît que les cellules de mammifères hôtes mais pas le parasite (Figure 1B). En outre, les noyaux de l’hôte et du parasite et les kinétoplastes du parasite ont été colorés avec du DAPI, et l’hôte F-actin a été coloré avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594 (Figure 1). Ces résultats de contrôle montrent la spécificité des anticorps, et ensuite, nous pouvons exécuter le protocole d’immunofluorescence à double marquage (Figure 2).

Dans la figure 2, l’immunofluorescence à double marquage montre les distributions de protéines dans l’hôte et le parasite analysées par microscopie confocale. Aucune réaction croisée ne se produit entre les anticorps utilisant cette méthodologie. L’efficacité de la deuxième étape de blocage à l’aide d’IgG anti-souris purifiées de lapin est suffisante pour altérer le marquage non spécifique par les anticorps secondaires. Ce marquage permet d’étudier l’interaction entre le parasite et les protéines hôtes et leur comportement lors de l’infection.

Figure 1
Figure 1 : Microscopie confocale montrant la localisation de la protéine géante T. cruzi (TcFAZ) et de l’hôte hnRNP A1 dans des cellules LLC-MK2 non infectées (NI) et infectées (INF) avec T. cruzi. (A) La protéine géante T. cruzi (TcFAZ) localisée dans le flagelle de T. cruzi est marquée avec un anticorps polyclonal anti-TcFAZ de souris et visualisée avec l’anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre conjugué à Alexa 488 (vert). (B) Le hnRNP A1 nucléaire hôte dans LLC-MK2 est marqué avec un anticorps monoclonal anti-hnRNP A1 IgG2b de souris et visualisé par un anticorps IgG2b anti-souris de chèvre conjugué à Alexa 488 (vert). La phalloïdine conjuguée à Alexa 594 tache f-actine (rouge). Les noyaux et les kinétoplastes sont colorés avec du DAPI (bleu). Barre d’échelle = 5 μm. Toutes les expériences ont été faites en triple exemplaire biologique. Les flèches blanches indiquent les parasites intracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’immunofluorescence à double marquage montre une réaction non croisée entre les anticorps élevés chez la même espèce hôte dans des cellules LLC-MK2 non infectées (NI) et infectées (INF) avec T. cruzi analysées par microscopie confocale. La protéine géante localisée dans la zone d’attachement du flagelle (FAZ) est marquée avec un anticorps polyclonal anti-TcFAZ de souris et visualisée par un anticorps IgG anti-souris de chèvre conjugué à Alexa 647 (rouge). Le hnRNP A1 nucléaire hôte est marqué avec un anticorps monoclonal anti-hnRNP A1 IgG2b de souris et visualisé par un anticorps IgG2b anti-souris de chèvre conjugué à Alexa 488 (vert). La phalloïdine conjuguée à Alexa 594 tache f-actine (gris). Les noyaux et les kinétoplastes sont colorés avec du DAPI (bleu). Les images fusionnées sont affichées comme indiqué. L’encart correspond à la zone élargie du noyau hôte. Bar = 5 μm. Toutes les expériences ont été faites en triple exemplaire biologique. La flèche blanche montre la présence du parasite près du noyau de la cellule hôte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Illustration schématique de la double immunocoloration séquentielle avec des anticorps primaires dérivés de la même espèce. Le diagramme montre l’ordre des anticorps pour assurer l’efficacité de ce protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer un double immunomarquage dans les cellules infectées par Trypanosoma cruzi en utilisant deux anticorps différents de la même espèce hôte. Pour étudier, avec plus de détails, les implications de l’infection, les structures de la cellule hôte telles que le noyau ou les organites cytosoliques peuvent être étiquetées à l’aide de ce protocole. En outre, il peut être utilisé dans la méthode d’étiquetage immunogold à section mince post-intégration. Cette approche aide à surmonter l’obstacle d’avoir peu d’anticorps disponibles pour étudier les trypanosomatidés et autres parasites.

De plus, notre protocole a montré qu’un parasite intracellulaire est marqué avec la cellule hôte, deux eucaryotes dans la même immunofluorescence, différents de ceux réalisés dans différents types de tissus7,8,9,10,11,12,13,14 . Notre protocole montre qu’aucun épitope de l’anticorps polyclonal primaire ne peut être reconnu par le deuxième anticorps secondaire (étape 3.9), ce qui garantit qu’aucune réaction croisée ne se produit entre les anticorps (Figure 3). Le succès de cette méthodologie est dû à l’efficacité de l’étape de blocage (étape 3.6) en utilisant des IgG anti-souris purifiées pour lapin. Un protocole similaire décrit par Ansorg et al. (2015) comporte deux blocages supplémentaires, où le premier utilise le sérum du même hôte que l’anticorps primaire et le second est réalisé avec des fragments fab non conjugués6. En outre, sans le deuxième blocage, un étiquetage de faux positifs peut se produire, comme l’expliquent ces auteurs 6.

De plus, pour le triple immunomarquage, le troisième anticorps d’une espèce hôte de lapin peut être ajouté avant la deuxième étape de blocage décrite ci-dessus dans le protocole (étape 4.2). En outre, il est possible d’utiliser plus d’un anticorps monoclonal car ils ont différentes sous-classes IgG. Pour cela, les anticorps secondaires correspondants doivent être fortement adsorbés afin de minimiser la réactivité croisée entre eux. L’utilisation de différentes sous-classes d’IgG permet l’utilisation des mêmes anticorps hôtes sans réaction croisée. Ces protocoles fonctionnent bien, mais des groupes témoins sont nécessaires pour éviter les résultats faussement positifs. La spécificité des sous-classes IgG et leurs propriétés permettent de faire du double et du triple étiquetage. Il a été rapporté que les sous-classes IgG diffèrent dans l’activation du complément et les récepteurs Fc dans les liaisons disulfures à chaîne inter-lourdes, les acides aminés de la région charnière, la masse moléculaire (kDa) et l’abondance relative (en pourcentage) en réponse aux protéines, aux saccharides et aux allergènes 25. Ils ont de légères différences dans la structure de la charnière des acides aminés, influençant la stabilité et la flexibilité de chaque sous-classe IgG. IgG2 a la charnière la plus courte et encore plus rigide de toutes les sous-classes IgG en raison d’une région CH2 avec une délétion d’acide aminé et un pont de disulfure de chaîne inter-lourd supplémentaire 25.

En résumé, le protocole décrit ici pour étudier les interactions hôte-pathogène présente une technique de base et élaborée adaptée à toute combinaison d’anticorps. Cette approche rend l’immunofluorescence rentable et peut aider lorsque la source d’anticorps est limitée. Le protocole peut détecter simultanément les agents pathogènes et les protéines de la cellule hôte dans les cellules hôtes infectées; il peut également être appliqué à tout type de cellule et à des organismes vivants libres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent ou financier.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) à MMAB, par fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência - FAEPA à MMAB et par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - code financier 001. CG-C a reçu une bourse de maîtrise et de doctorat de CAPES et LAMT-S a reçu une bourse de doctorat du CNPq. Nous remercions Elizabete R. Milani pour l’assistance en microscopie confocale et le Dr Dario Zamboni pour la fourniture de cellules LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody Life technologies, USA A21141 Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch, USA 315-005-003 Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A11017 Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody Life technologies, USA A21125 Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A21237 Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b Sigma-Aldrich, USA R4528 Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody Our lab In-house Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, USA A2153-10G Albumin protein
Detergent Igepal CA-630 Sigma-Aldrich, USA I3021 Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo fisher scientific, USA 12657-029 Serum
Penicillin Streptomycin Gibco, Thermo fisher scientific, USA 15140-122 Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594 Life technologies, USA A12381 Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI Life technologies, USA P36935 Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine Corning, USA 10-040-CV Cell culture media
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich, USA T4049-100ML Bioreagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).

Tags

Immunologie et infection numéro 173 immunomarquage double marquage mêmes anticorps hôtes interaction hôte-pathogène
Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. … More

Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. A. M., Baqui, M. M. A. Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (173), e62219, doi:10.3791/62219 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter