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Biology

त्रि-आयामी ऑर्गनॉइड और स्फेरॉइड मॉडल की धुंधला और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

Published: March 27, 2021 doi: 10.3791/62280
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 2, 3, 4, 1
1Childhood Cancer & Cell Death (C3), Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), Lyon 69373, 2Plateforme Anatomopathologie Recherche, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), 3Plateforme d’Imagerie cellulaire, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), 4PerkinElmer S.A.S.
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम 100 μm से लेकर कई मिलीमीटर तक के निश्चित त्रि-आयामी सेल संस्कृति मॉडल के धुंधला और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने के लिए विस्तृत, मजबूत और पूरक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, इस प्रकार उनकी आकृति विज्ञान, सेल-प्रकार संरचना और इंटरैक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करते हैं।

Abstract

इन विट्रो त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल, जैसे ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड, विकास और रोग मॉडलिंग, दवा की खोज और पुनर्योजी चिकित्सा सहित कई अनुप्रयोगों के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। इन मॉडलों का पूरी तरह से फायदा उठाने के लिए, सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर उनका अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस तरह के इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल को चिह्नित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और प्रभावी विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। यहां, यह पेपर 100 μm से लेकर कई मिलीमीटर तक के फिक्स्ड इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल के धुंधला और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने के लिए विस्तृत, मजबूत और पूरक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। ये प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड पर लागू होते हैं जो उनके सेल-ऑफ-ओरिजिन, आकृति विज्ञान और संस्कृति स्थितियों में भिन्न होते हैं। 3 डी संरचना कटाई से छवि विश्लेषण तक, इन प्रोटोकॉल को 4-5 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। संक्षेप में, 3 डी संरचनाओं को एकत्र किया जाता है, तय किया जाता है, और फिर पैराफिन-एम्बेडिंग और हिस्टोलॉजिकल / इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है, या सीधे इम्यूनोलेबल किया जा सकता है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा ऑप्टिकल क्लियरिंग और 3 डी पुनर्निर्माण (200 μm गहराई) के लिए तैयार किया जा सकता है।

Introduction

पिछले दशकों में, स्टेम सेल जीव विज्ञान और इन विट्रो 3 डी संस्कृति प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने जीव विज्ञान और चिकित्सा में एक क्रांति की शुरुआत की है। 3 डी में उच्च जटिलता सेल मॉडल बहुत लोकप्रिय हो गए हैं क्योंकि वे कोशिकाओं को आसपास के बाह्य ढांचे के साथ बढ़ने और बातचीत करने की अनुमति देते हैं, उनके आर्किटेक्चर, सेल संगठन और इंटरैक्शन, या यहां तक कि प्रसार विशेषताओं सहित जीवित ऊतकों के पहलुओं को बारीकी से पुन: व्यवस्थित करते हैं। जैसे, 3 डी सेल कल्चर मॉडल विट्रो में विकासशील या रोगग्रस्त ऊतकों में कोशिकाओं के व्यवहार में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड दोनों बहुकोशिकीय 3 डी संरचनाएं हैं, जो कई माइक्रोमीटर से मिलीमीटर तक हैं, और विट्रो 3 डी संरचनाओं में सबसे प्रमुख हैं। दोनों को एक सहायक मचान के भीतर संवर्धित किया जा सकता है जिसमें (i) जानवरों (तहखाने झिल्ली निकालने, कोलेजन), पौधों (एल्गिनेट / अगारोस), या रसायनों से संश्लेषित हाइड्रोगेल शामिल हैं, या (ii) सेल प्रसार और विकास को बढ़ावा देने के लिए छिद्रयुक्त मैट्रिक्स शामिल हैं।

ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड भी समूहों में स्वयं को इकट्ठा करने के लिए कोशिकाओं पर भरोसा करके एक सहायक मचान की उपस्थिति के बिना विकसित हो सकते हैं। यह विभिन्न तकनीकों पर निर्भर करता है जैसे कि सेल अटैचमेंट, सतह तनाव और गुरुत्वाकर्षण बल (जैसे, हैंगिंग ड्रॉप तकनीक), या वाहिकाओं के निरंतर परिपत्र रोटेशन (जैसे, स्पिनर संस्कृति) को रोकने के लिए गैर-चिपकने वाली सामग्री का उपयोग। सभी मामलों में, ये तकनीकें पारंपरिक मोनोलेयर सेलसंस्कृति की सीमाओं को दूर करने के लिए सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करती हैं। "ऑर्गेनोइड्स" और "स्फेरॉइड" शब्दों का उपयोग अतीत में परस्पर किया गया है, लेकिन इन दो 3 डी सेल संस्कृति मॉडल के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं। ऑर्गेनोइड्स इन विट्रो 3 डी सेलुलर क्लस्टर हैं जो प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं या ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, जिसमें कोशिकाएं अनायास पूर्वजों और विभेदित सेल प्रकारों में आत्म-व्यवस्थित होती हैं औरजो रुचि के अंग के कम से कम कुछ कार्यों को पुन: व्यवस्थित करती हैं। स्फेरॉइड में गैर-अनुयायी स्थितियों के तहत गठित बहुकोशिकीय 3 डी संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है और सेल प्रकारों की एक बड़ी विविधता से उत्पन्न हो सकती है जैसे कि अमर सेल लाइनें या प्राथमिक कोशिकाएं3। इसलिए, उनके आंतरिक स्टेम सेल मूल में निहित, ऑर्गेनोइड्स में स्फेरॉइड की तुलना में स्व-संयोजन, व्यवहार्यता और स्थिरता के लिए उच्च प्रवृत्ति है।

फिर भी, संक्षेप में, ये दो मॉडल कई कोशिकाओं से बने 3 डी संरचनाएं हैं, और उनका अध्ययन करने के लिए विकसित तकनीकें इस प्रकार बहुत समान हैं। उदाहरण के लिए, एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन स्तर पर शक्तिशाली इमेजिंग दृष्टिकोण ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड दोनों की सेलुलर जटिलता की जांच के लिए आवश्यक हैं। यहां, इस समूह की विशेषज्ञता और ऑर्गेनोइड्स4 के क्षेत्र में नेताओं की विशेषज्ञता को सारांशित करके, यह पेपर दो-आयामी (2 डी) और 3 डी होल-माउंट स्टेनिंग, इमेजिंग और सेलुलर और उपकोशिकीय संरचना के विश्लेषण और 100 μm से कई मिलीमीटर तक ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। दरअसल, यह प्रक्रिया इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल के आकार और प्रकार की एक बड़ी विविधता का विश्लेषण करने के लिए दो अलग-अलग और पूरक प्रकार के धुंधलापन और इमेजिंग अधिग्रहण प्रस्तुत करती है। एक (3 डी होल-माउंट विश्लेषण) या दूसरे (2 डी सेक्शन विश्लेषण) का उपयोग अध्ययन किए गए मॉडल और मांगे गए उत्तरों पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी होल-माउंट विश्लेषण को 3 डी संरचना के समग्र आकार के बावजूद, 3 डी संस्कृति में 200 μm तक की कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि 2 डी अनुभागों का विश्लेषण किसी भी आकार के नमूनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, हालांकि 2 डी स्तर पर। इस प्रक्रिया को विभिन्न भ्रूण रोगाणु परतों से उत्पन्न मानव और मुराइन कोशिकाओं से प्राप्त विभिन्न प्रकार के ऑर्गेनोइड 4,5 और स्फेरॉइड में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। प्रमुख चरणों, उनके बीच संबंध, निर्णायक कदम और अपेक्षित समय इंगित किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया का योजनाबद्ध अवलोकन। इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल एकत्र किए जाते हैं और तय किए जाते हैं, फिर या तो 3 डी पूरे माउंट स्टेनिंग (विकल्प ए) के लिए तैयार किया जाता है या 2 डी सेक्शनिंग और स्टेनिंग (विकल्प बी) के लिए पैराफिन में एम्बेडेड किया जाता है। 3 डी होल-माउंट स्टेनिंग प्रयोगों के लिए, निर्धारण चरण के बाद निश्चित 3 डी संरचनाओं को इम्युनोलेबल किया जाता है। छवि प्रसंस्करण के दौरान प्रकाश प्रकीर्णन को कम करके ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गुणवत्ता और गहराई में सुधार करने के लिए एक वैकल्पिक ऑप्टिकल-समाशोधन चरण किया जा सकता है। छवियों को एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या एक कॉन्फोकल उच्च सामग्री प्रणाली पर कैप्चर किया जाता है और उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। पैराफिन एम्बेडिंग के लिए, 3 डी संरचनाओं को सीधे संसाधित किया जाता है (400 μm ≥ बड़ी संरचनाओं के लिए विकल्प b.1) या निर्जलीकरण और पैराफिन एम्बेडिंग के लिए एक जेल (b.2; छोटी संरचनाएं ≤ 400 μm) में शामिल किया जाता है। पैराफिन ब्लॉक को तब काटा जाता है और दाग दिया जाता है (हिस्टोलॉजिकल या इम्यूनोकेमिकल धुंधला)। 2 डी अनुभागों की छवियां एक डिजिटल स्लाइड स्कैनर या एक सीधा माइक्रोस्कोप पर प्राप्त की जाती हैं और तेजी से डिजिटल मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग करके छवि विश्लेषण मंच पर विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया में अभिकर्मक परिवर्तन और धोने से जुड़े चरणों के दौरान 3 डी संरचनाओं की प्रारंभिक संख्या के ≤25% की हानि की उम्मीद की जानी चाहिए। गुणात्मक और मात्रात्मक छवि विश्लेषण करने के लिए प्रति परीक्षण की गई स्थिति में 100 से 500 μm तक के आकार के साथ कम से कम दस 3 डी संरचनाओं की अंतिम संख्या का उपयोग करने की योजना बनाएं। यदि आवश्यक हो, तो बड़ी संरचनाओं के लिए, संरचनाओं को तोड़ने से बचने के लिए 1 एमएल पिपेट युक्तियों के सिरों को काटें। सभी चरणों के लिए, यदि 3 डी संरचना अवसादन बहुत लंबा है, तो कोशिकाओं को कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 50 × ग्राम पर धीरे से घुमाया जा सकता है। जांच किए गए मुद्दे के आधार पर, इस तरह के स्पिनिंग स्टेप के फायदे / नुकसान पर विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि सेंट्रीफ्यूजेशन 3 डी संरचनाओं के आकार से समझौता कर सकता है। >100 × ग्राम पर घूमने से बचें।

1. 3 डी सेल संस्कृति मॉडल का संग्रह और निर्धारण

नोट: सावधान रहें कि 3 डी संरचनाओं को उत्तेजित न करें, जो केवल ट्यूब की दीवार से शिथिल रूप से जुड़े होंगे।

  1. मैट्रिक्स में एम्बेडेड 3 डी सेल कल्चर मॉडल की कटाई
    नोट: यह खंड मुराइन एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म सारकोमा (बीएमई) से तहखाने झिल्ली निकालने की बूंदों में उगाई गई 3 डी संरचनाओं की वसूली का वर्णन करता है, लेकिन इसे अन्य मैट्रिक्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ईसीएम के बारे में महत्वपूर्ण बिंदुओं के लिए चर्चा देखें।
    1. 3 डी मैट्रिक्स को बाधित किए बिना कुओं से संस्कृति माध्यम को हटा दें। फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (जिसे पीबीएस कहा जाता है) में 0.1 % गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में नोक की पूरी लंबाई को डुबोकर प्रोटीन के साथ 1 एमएल पिपेट टिप के अंदर और बाहर प्रीकोट करें और इस घोल के 1 एमएल को दो बार ऊपर और नीचे करें।
      नोट: यह प्रीकोटिंग कोशिकाओं को टिप से चिपकने से रोकेगा और किसी भी नुकसान को कम करेगा।
    2. पीबीएस-बीएसए 0.1% घोल से बार-बार भरकर और ट्यूब को खाली करके प्रोटीन (जिसे इसके बाद प्रीकोटेड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब कहा जाता है) के साथ सेंट्रीफ्यूज (15 एमएल) ट्यूब के अंदर प्रीकोट करें।
      नोट: यह कोशिकाओं को ट्यूब से चिपकने से रोकेगा और किसी भी नुकसान को कम करेगा।
    3. प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, 1 एमएल आइस-कोल्ड 1एक्स पीबीएस का उपयोग करके कुएं की 3 डी संरचनाओं को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें, और धीरे से 3 डी संरचनाओं वाले निलंबन को प्रीकोटेड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. धीरे से 13 एमएल बर्फ-ठंडा 1x PBS जोड़ें, और 3D संरचनाओं को कम से कम 10 मिनट के लिए बर्फ पर तलछट करने की अनुमति दें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो 50 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। >100 × ग्राम घूमने से बचें, क्योंकि यह 3 डी संरचनाओं के आकार से समझौता करेगा।
    5. सतह पर तैरने वाले को हटा दें। प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, धीरे से 3 डी संरचनाओं को 1 एमएल बर्फ-ठंडा 1 एक्स पीबीएस में पुन: निलंबित करें। किसी भी 3 डी मैट्रिक्स अवशेष के बिना एक समरूप गोली प्राप्त करने के लिए चरण 1.1.4 से 1.1.5 दोहराएं।
      नोट: कुशल मैट्रिक्स हटाने मैट्रिक्स के प्रकार, संख्या और 3 डी संरचनाओं के आकार से प्रभावित होता है और विभिन्न संस्कृति स्थितियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है। बीएमई में उगाई गई 3 डी संरचनाओं के लिए, मैट्रिक्स हटाने से वसूली में आमतौर पर 45-60 मिनट लगते हैं।
    6. प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, 3 डी संरचनाओं वाले 1 एमएल 1 एक्स पीबीएस निलंबन को प्रीकोटेड 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और अनुभाग 1.3 के साथ आगे बढ़ें।
  2. फ्लोटिंग फ्लोटिंग 3 डी सेल कल्चर मॉडल की कटाई
    1. प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, 3 डी संरचनाओं को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें और प्रीकोटेड 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 3 डी संरचनाओं को तलछट की अनुमति दें, या आरटी पर 50 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए घूमें।
    2. सतह पर तैरने वाले को हटा दें। प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, 1x PBS के 1 mL में 3D संरचनाओं को फिर से निलंबित करें। धारा 1.3 के साथ आगे बढ़ें।
  3. 3 डी सेल संस्कृति मॉडल का निर्धारण
    1. 3 डी संरचनाओं को तलछट की अनुमति दें। सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें; एक फ्यूम हुड के तहत, धीरे से प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके फॉर्मलिन के 1 एमएल में 3 डी संरचनाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: फॉर्मेलिन में फॉर्मलाडेहाइड होता है, जो खतरनाक है। रासायनिक हुड में रसायन में हेरफेर करें। रबर दस्ताने और सुरक्षा आंखों के चश्मे पहनें।
    2. आरटी में 30 मिनट के लिए 3 डी संरचनाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: फॉर्मलिन के साथ एक 30 मिनट निर्धारण चरण 3 डी संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला (आकार, आकार और मूल में भिन्न) के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए आवश्यक है। हालांकि, सामान्य तौर पर, लंबे निर्धारण समय (>3 घंटे) रिपोर्टर प्रोटीन की प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए बेहतर अनुकूल होते हैं।
    3. 3D संरचनाओं को तलछट में जाने दें, या RT पर 50 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए घूमें। धीरे से फॉर्मेलिन को हटा दें, और इसे 1x PBS के 1 mL से बदलें। इस वॉशिंग स्टेप को 1x PBS में दो बार दोहराएं। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और अनुभाग 2 या धारा 3 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, और कोशिकाओं को दीर्घकालिक भंडारण (>1 वर्ष) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है।

2.3D 3 डी सेल कल्चर मॉडल के पूरे माउंट स्टेनिंग, इमेजिंग और विश्लेषण

नोट: चूंकि ऑर्गेनोइड्स ट्यूब की दीवार से शिथिल रूप से जुड़े होते हैं, इसलिए उन्हें धीरे से संभालें क्योंकि निम्नलिखित सभी अभिकर्मक परिवर्तन नमूना हानि का कारण बन सकते हैं। शुरू करने से पहले, धुंधला करने के लिए सही नियंत्रण की उपलब्धता सुनिश्चित करें। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाएं हो सकती हैं, जिसमें रुचि के प्रोटीन को क्रमशः अतिरंजित या अनुपस्थित माना जाता है। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नमूनों को इनक्यूबेट करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या देखा गया संकेत द्वितीयक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन के कारण है। चूंकि कुछ कोशिकाएं ऑटोफ्लोरेसेंस के उच्च स्तर को प्रदर्शित करती हैं, इसलिए यह निर्धारित करने के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी से रहित नियंत्रण का उपयोग करें कि क्या देखी गई प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस से आ रही है। इम्यूनोलेबलिंग और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर विज़ुअलाइज़ेशन को जोड़ा जा सकता है।

  1. 3 डी पूरे माउंट धुंधला
    1. गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के 0.1% -1% के साथ 1x PBS को पूरक करके परमेबिलाइजेशन-ब्लॉकिंग (PB) समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), 1% डाइमिथाइलसल्फोक्साइड, 1% बीएसए, और 1% गधा सीरम (या उस जानवर से जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी उठाए गए थे)।
      नोट: लक्ष्य के स्थानीयकरण के आधार पर गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट की एकाग्रता को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करें: झिल्ली (0-0.5%), साइटोप्लाज्म (0.5-1%), और नाभिक (1%)। इस समाधान को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। बीएसए आमतौर पर ब्लॉकिंग चरण के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन उच्च पृष्ठभूमि शोर के मामले में, एंटीबॉडी के दिए गए संयोजन के लिए सर्वोत्तम संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए एक अनुभवजन्य परीक्षण करें।
    2. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से ऑर्गेनोइड्स को प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके 0.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ऑर्गेनोइड्स तलछट को धीरे से हटा दें, धीरे से 1x PBS को हटा दें, और इसे 0.5 mL PB समाधान के साथ बदलें। आरटी पर 1 घंटे के लिए कोमल क्षैतिज आंदोलन (30-50 आरपीएम) के साथ ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें।
    3. ऑर्गेनोइड्स को तलछट दें, धीरे से पीबी समाधान को हटा दें, और 3 मिनट के लिए 1 एमएल पीबीएस-बीएसए 0.1% में दो बार धोएं।
      नोट: 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने से संरचनाओं को ट्यूब के तल पर तलछट करने की अनुमति मिलती है।
    4. धीरे से पीबीएस-बीएसए 0.1% को हटा दें, और पीबी: 1 एक्स पीबीएस (1: 10) समाधान में उचित एकाग्रता पर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 250 μL जोड़ें। पीबी: 1 एक्स पीबीएस (1: 10) समाधान के 10 एमएल तैयार करने के लिए, 1 एमएल पीबी घोल को 1 एक्स पीबीएस के 9 एमएल में पतला करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल क्षैतिज आंदोलन (30-50 आरपीएम) के साथ 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: एक उपयुक्त एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय एक उपयुक्त एंटीबॉडी प्रवेश के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि 3 डी संरचनाएं कभी-कभी बड़े आकार तक पहुंच सकती हैं।
    5. ऑर्गेनोइड्स को तलछट दें, और धीरे से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें। पीबीएस-बीएसए में 5x को 3 मिनट प्रति धोने के लिए 0.1% और फिर 1 एमएल पीबीएस-बीएसए में 2x 15 मिनट प्रति धोने के लिए 0.1% कोमल क्षैतिज आंदोलन के साथ धोएं।
    6. पीबी: 1 एक्स पीबीएस (1: 10) समाधान में 1:250 पर पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के 250 μL जोड़ें। कोमल क्षैतिज आंदोलन (30-50 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण के लिए, नमूने को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    7. PB:1x PBS (1:10) घोल में 1:1000 पर पतला Hoechst 33342 (20 μM स्टॉक समाधान) का 250 μL जोड़ें, और कोमल क्षैतिज आंदोलन (30-50 rpm) के साथ 4 °C पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. ऑर्गेनोइड्स को तलछट दें, और धीरे से द्वितीयक एंटीबॉडी + होचस्ट 33342 युक्त समाधान को हटा दें। ऑर्गेनोइड्स 5x को 1x PBS के 1 mL में 3 मिनट प्रति धोने के लिए धोएं और फिर 1x PBS के 1 mL में 15 मिनट के लिए कोमल क्षैतिज आंदोलन (30-50 आरपीएम) के साथ धोएं।
      नोट: पृष्ठभूमि शोर या सिग्नल के नुकसान से बचने के लिए नमूने को बड़े पैमाने पर धोना महत्वपूर्ण है।
    9. छवि अधिग्रहण तक नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें। धारा 2.2 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, और नमूने को प्रकाश से सुरक्षित कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी
    1. प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल ब्लैक पॉलीस्टाइनिन माइक्रोप्लेट में प्रति कुएं 1x PBS के 50 μL में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। चरण 2.2.3 या अनुभाग 2.3 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: इस स्तर पर, नमूना प्रकाश से सुरक्षित किया जा सकता है और कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. समाशोधन
      नोट: समाशोधन चरण वैकल्पिक है और इसका उपयोग इम्यूनोलेबल ऑर्गेनोइड्स या अंतर्जात प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। समाशोधन 3 डी संरचना संकोचन का कारण बन सकता है, लेकिन बड़े लुमेन4 के साथ गोलाकार मोनो-लेयर्ड ऑर्गेनोइड्स को छोड़कर सामान्य आकृति विज्ञान को नहीं बदलता है। इन सिस्टिक ऑर्गेनोइड्स के लिए, समाशोधन चरण को छोड़ दें, और गहरे ऊतक इमेजिंग6 का प्रदर्शन करें।
      1. 2.5 एम ग्लिसरॉल-फ्रुक्टोज क्लियरिंग समाधान तैयार करें जिसमें 50% वी / वी ग्लिसरॉल, 11% वी / वी आसुत जल और 45% डब्ल्यू / वी फ्रुक्टोज होता है, कम से कम रात भर चुंबकीय स्टिरर पर मिश्रण करके जब तक कि समाधान पूरी तरह से घुलनशील और समरूप न हो जाए। 1 महीने तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      2. ऑर्गेनोइड्स को छूने के बिना जितना संभव हो उतना 1x PBS निकालें। अंत को हटाने के बाद 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके क्लियरिंग समाधान का 200 μL जोड़ें, और बुलबुले के गठन को रोकने के लिए धीरे से पुन: निलंबित करें। कम से कम 12 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, और धारा 3 के साथ आगे बढ़ें।
        नोट: चूंकि समाशोधन समाधान चिपचिपा है, इसलिए छोटी मात्रा को संभालना मुश्किल है। हैंडलिंग की सुविधा के लिए, सुनिश्चित करें कि समाधान आरटी पर है, और धीरे-धीरे पिपेट करें। इष्टतम समाशोधन के लिए, नमूने को इमेजिंग से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए समाशोधन समाधान में तलछट करने की अनुमति दें। यदि अधिग्रहण के समय 3 डी संरचनाएं तैर रही हैं, तो आरटी पर <100 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए एक वैकल्पिक स्पिन करें, या उन्हें तलछट देने के लिए अधिक समय (एक से कई दिन) की अनुमति दें। इमेजिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रोटोकॉल को इस चरण में रोका जा सकता है यदि यह प्रकाश से सुरक्षित है और 4 डिग्री सेल्सियस (हफ्तों के लिए) या -20 डिग्री सेल्सियस (महीनों के लिए) पर संग्रहीत है।
  3. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
    नोट: 3 डी संरचनाओं की छवि के लिए छवि अनुभागन तकनीक की आवश्यकता होगी।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, और हवा की तुलना में उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ विसर्जन उद्देश्यों का पक्ष लें। 3 डी संरचनाओं के आकार, छवि पुनर्निर्माण (सिलाई), और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों के अनुसार आवर्धन उद्देश्यों (10x, 20x, 40x) का चयन करें।
    2. अधिग्रहण मोड का चयन करते समय, जेड स्टैकिंग के लिए चरण को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य के फोकस की गहराई को ध्यान में रखें; इष्टतम 3 डी रेंडरिंग के लिए अनुमति दें।
      नोट: छवि विश्लेषण समाधान भिन्न होते हैं, और विश्लेषण को उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर में समायोजित करने की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए, यह विश्लेषण प्रोटोकॉल एक उच्च-सामग्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर स्थापित किया गया था (विवरण के लिए सामग्री की तालिका और पूरक चित्रा 1 देखें) और 3 डी पुनर्निर्मित वस्तु के भीतर ऑब्जेक्ट विभाजन, गुणों की गणना और सेल जनसंख्या चयन पर डेटा प्रदान करता है।

3. 2 डी सेक्शनिंग, धुंधलापन, इमेजिंग और 3 डी सेल कल्चर मॉडल का विश्लेषण

नोट: 3 डी सेल संस्कृति मॉडल आकार में भिन्न होते हैं। कुशल पैराफिन एम्बेडिंग के लिए अनुभाग 3.1 या 3.2 के साथ आगे बढ़ें (चित्रा 2)। किसी भी धोने और अभिकर्मक परिवर्तन से पहले 3 डी संरचना अवसादन के लिए पर्याप्त समय दें। सावधान रहें कि ट्यूब के तल पर तैरने वाले ऑर्गेनोइड्स को एस्पिरेट न करें। पैराफिन एम्बेडिंग के लिए, मार्गदर्शन के लिए चित्रा 2 देखें।

  1. बड़े (Ø 400 μm) 3 डी सेल संस्कृति मॉडल का पैराफिन एम्बेडिंग (Ø ≥ 400 μm)
    1. एम्बेड करने से एक दिन पहले, पैराफिन (पैराफिन स्नान) से भरे दो 150 एमएल फ्लास्क, प्रति नमूना एक छोटी धातु एम्बेडिंग मोल्ड, और 65 डिग्री सेल्सियस तक बारीक बल।
    2. प्रीकोटेड 1 एमएल टिप का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक 1 एक्स पीबीएस में ऑर्गेनोइड्स को पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन-लाइन्ड बोतल कैप के साथ एक फ्लैट-बॉटम ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें। ऑर्गेनोइड्स को तलछट दें, सावधानीपूर्वक 1x PBS को हटा दें, और इसे 70% इथेनॉल के साथ बदलें। कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. ऑर्गेनोइड्स को तलछट दें, और सावधानीपूर्वक 70% इथेनॉल को हटा दें। इसे 1 एमएल रेडी-टू-यूज ईओसिन वाई समाधान के साथ बदलें। ट्यूब को फ्लिक करें, और कम से कम 30 मिनट के लिए दाग दें। ईओसिन समाधान को ध्यान से हटा दें, और ~ 30 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ तीन क्रमिक धोने में ऑर्गेनोइड्स को निर्जलित करें।
      नोट: इथेनॉल, एक ज्वलनशील और वाष्पशील तरल, गंभीर आंख और श्वसन पथ की जलन का कारण बनता है। इसे फ्यूम हुड में हेरफेर करें, और सुरक्षात्मक आंखों के चश्मे पहनें।
    4. सावधानी से 100% इथेनॉल को हटा दें, और एक रासायनिक हुड के तहत, ~ 30 मिनट के लिए 1 एमएल जाइलीन के साथ 3 लगातार धोने में ऑर्गेनोइड्स को साफ करें।
      नोट: जाइलीन एक विषाक्त, तरल ज्वलनशील है जिसके वाष्प से जलन हो सकती है। इसे एक फ्यूम हुड में हेरफेर करें। त्वचा के साथ सीधे संपर्क से बचें, और रबर दस्ताने और सुरक्षात्मक आंखों के चश्मे पहनें।
    5. एक रासायनिक हुड के तहत, कैसेट के डिब्बों में से एक के अंदर बायोप्सी पैड (पहले जाइलीन में भिगोया हुआ) का एक टुकड़ा रखकर एक सफेद माइक्रोट्विन ऊतक कैसेट तैयार करें। बायोप्सी पैड पर प्रीकोटेड 2 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 3 डी संरचनाओं को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। ऑर्गेनोइड्स को हिलने से रोकने के लिए उन्हें जाइलीन में भिगोए गए एक और बायोप्सी पैड के साथ कवर करें, और कैसेट को बंद करें।
    6. यदि कई नमूने संसाधित किए जाते हैं, तो आगे की प्रक्रिया की प्रतीक्षा करने के लिए कैसेट को जाइलीन स्नान में रखें। एक बार जब सभी नमूने कैसेट में स्थानांतरित हो जाते हैं, तो कैसेट को 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक पूर्ववाधित पैराफिन स्नान में रखें। कैसेट को रात भर एक ताजा प्रीवार्ड पैराफिन स्नान में स्थानांतरित करें।
    7. पैराफिन इंप्रेग्नेशन के बाद, एक पूर्वनिर्मित एम्बेडिंग मोल्ड लें, और इसमें गर्म पैराफिन जोड़ें। 3 डी संरचनाओं वाले बायोप्सी पैड को मोल्ड में रखें, और धीरे से इसे तब तक उत्तेजित करें जब तक कि सभी ऑर्गेनोइड मोल्ड के तल तक न गिर जाएं। बहुत सावधानी से 3 डी संरचनाओं को मोल्ड के केंद्र में पूर्वनिर्मित महीन बल का उपयोग करके रखें। धारा 3.3 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: सावधान रहें कि 3 डी संरचनाओं को बल के साथ बाधित न करें; धक्का दें, लेकिन उन्हें चुटकी न दें।
  2. छोटे (Ø ≤ 400 μm) 3 डी सेल संस्कृति मॉडल का पैराफिन एम्बेडिंग
    1. एम्बेड करने से एक दिन पहले, पैराफिन (पैराफिन स्नान) से भरे दो 150 एमएल फ्लास्क, प्रति नमूना एक छोटी धातु एम्बेडिंग मोल्ड, और 65 डिग्री सेल्सियस तक बारीक बल।
    2. ऑर्गेनॉइड निलंबन से 1x PBS को सावधानीपूर्वक हटा दें। धीरे से 1 x Tris-buffered saline (TBS) के 1 एमएल में 3 वॉश करें। ऑर्गेनोइड्स को छूने के बिना जितना संभव हो उतना 1x TBS हटा दें।
      नोट: सावधानी बरतें कि नमूने को एस्पिरेटेड न करें। यदि आवश्यक हो, तो आरटी पर 50 x g पर 5 मिनट स्पिन करें। फॉस्फेट के शेष निशान निम्नलिखित चरणों में हस्तक्षेप करेंगे, विशेष रूप से जेल पोलीमराइजेशन को रोकेंगे। इसलिए, किसी भी प्रसंस्करण चरण के दौरान पीबीएस समाधान का उपयोग न करें। इस चरण के लिए, एक वाणिज्यिक किट, जिसमें कैसेट, अभिकर्मक # 1 (स्पष्ट तरल पदार्थ), और अभिकर्मक # 2 (रंगीन तरल पदार्थ) शामिल थे, का उपयोग पैराफिन-एम्बेडेड प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए किया गया था, जिसमें संभावित रूप से छोटे टुकड़ों को खो दिया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। किट निर्देशों का पालन करें. कैसेट को बैकिंग पेपर और बोर्ड इंसर्ट के साथ पहले से ही इकट्ठा किया गया है।
    3. ट्यूब में अभिकर्मक # 2 की 2 बूंदें जोड़ें, और ट्यूब को टैप करके धीरे से मिलाएं। अभिकर्मक # 1 की 2 बूंदें जोड़ें, और जेल को जमने के लिए टैप करके फिर से मिलाएं। महीन बल का उपयोग करके, जेल को ट्यूब से हटा दें, और इसे कैसेट के कुएं में रखें।
    4. फ्यूम हुड के तहत, कैसेट को क्रमिक स्नान में रखकर नमूने को निर्जलित करें (150 एमएल फ्लास्क का उपयोग करें, और प्रत्येक स्नान के लिए ताजा इथेनॉल या जाइलीन का उपयोग करें): इथेनॉल 70%, 30 मिनट; इथेनॉल 96%, 30 मिनट; इथेनॉल 100%, तीन धोने, प्रत्येक 30 मिनट; जाइलीन, तीन धोने, प्रत्येक 30 मिनट।
    5. कैसेट को 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक पूर्ववाधित पैराफिन स्नान में रखें, और उन्हें रात भर एक ताजा प्रीवार्ड पैराफिन स्नान में स्थानांतरित करें। पैराफिन इंप्रेग्नेशन के बाद, एक पूर्वनिर्मित एम्बेडिंग मोल्ड लें, और इसमें गर्म पैराफिन जोड़ें। कैसेट खोलें, जेल को बारीक बल के साथ सावधानीपूर्वक हटा दें, और एम्बेडिंग मोल्ड के केंद्र पर 3 डी संरचनाओं वाले जेल को रखें। धारा 3.3 के साथ आगे बढ़ें।
  3. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए सामान्य कदम
    1. धीरे से मोल्ड को एक ठंडे क्षेत्र में स्थानांतरित करें ताकि पैराफिन एक पतली परत में जम जाए, जो 3 डी संरचनाओं को उचित स्थिति में बनाए रखेगा। मोल्ड के शीर्ष पर एक ऊतक कैसेट जोड़ें, और इस प्लास्टिक कैसेट को कवर करने के लिए गर्म पैराफिन जोड़ें। एक बार जब यह पूरी तरह से ठोस हो जाता है तो मोल्ड को हटा दें, और धारा 3.4 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: पैराफिन ब्लॉक को वर्षों तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: बड़े और छोटे इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल के पैराफिन एम्बेडिंग के लिए प्रक्रिया का अवलोकन।
(ए) पैराफिन एम्बेडिंग के लिए मानक प्रक्रिया। निर्धारण और निर्जलीकरण के बाद, 3 डी संरचनाओं को उनके विज़ुअलाइज़ेशन (ऊपर और नीचे बाएं) की सुविधा के लिए ईओसिन से दाग दिया जाता है। 3 डी संरचनाओं को सावधानीपूर्वक 2 एमएल पाश्चर पाइपेट (मध्य) का उपयोग करके कैसेट में बायोप्सी पैड (नीले) पर रखा जाता है। पैराफिन इंप्रेग्नेशन के बाद, 3 डी संरचनाओं को धीरे से बल का उपयोग करके तरल पैराफिन में गिरा दिया जाता है और बायोप्सी पैड में धीरे से उत्तेजित किया जाता है। इस चरण के दौरान छोटी 3 डी संरचनाएं खो जाती हैं क्योंकि उन्हें पैड से जारी नहीं किया जा सकता है (नीचे दाएं: असफल एम्बेडिंग)। केवल बड़ी 3 डी संरचनाओं को एम्बेडेड किया जाएगा (शीर्ष दाएं: सफल एम्बेडिंग)। एरोहेड 3 डी संस्कृतियों को इंगित करते हैं। (बी) मानक पैराफिन एम्बेडिंग प्रोटोकॉल का विकल्प। निश्चित छोटी 3 डी संरचनाओं के बाद, एक वाणिज्यिक किट का उपयोग जेल में कोशिकाओं को बनाए रखने और पैराफिन इम्प्रेग्नेशन (दाएं: सफल एम्बेडिंग) के बाद मोल्ड में उनके हस्तांतरण की सुविधा के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. ब्लॉक सेक्शनिंग और धुंधलापन
    1. एक मानक माइक्रोटोम का उपयोग करके 4 μm अनुभागों को काटें, और मानक हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकों का प्रदर्शन करें। धारा 3.5 के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: अनुभागों के बेहतर आसंजन के लिए विशिष्ट स्लाइड्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था। स्लाइड को कमरे के तापमान पर या वर्षों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
    1. डिजिटल स्लाइड स्कैनर या सीधे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग करें, और तेजी से डिजिटल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मंच का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें जो पूरे 3 डी संरचना वर्गों में सेल-बाय-सेल आधार पर रूपात्मक और मल्टीप्लेक्स अभिव्यक्ति डेटा की रिपोर्ट करता है (विवरण के लिए पूरक चित्रा 2 देखें)।
      नोट: 20x उद्देश्य इस समूह द्वारा नियमित रूप से उपयोग किया जाता है।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल 2 डी और 3 डी होल-माउंट स्टेनिंग के लिए महत्वपूर्ण चरणों का अवलोकन प्रदान करता है, साथ ही 3 डी सेल कल्चर मॉडल (चित्रा 3 और चित्रा 4) के इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण भी प्रदान करता है। यह 3 डी सेल कल्चर मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है - विभिन्न मेजबान प्रजातियों या ऊतकों से स्फेरॉइड से ऑर्गेनोइड तक - और वास्तुकला, सेल संगठन और सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर बातचीत पर सटीक और मात्रात्मक जानकारी के अधिग्रहण को सक्षम बनाता है (चित्रा 3 और चित्रा 4)। प्रयोगशालाओं को अपनी आवश्यकताओं के अनुसार 2 डी हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकों और एंटीबॉडी सांद्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

दोनों विधियां मूल्यवान जैविक जानकारी प्रदान करती हैं। 3 डी होल-माउंट स्टेनिंग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 200 μm (चित्रा 3 बी) तक की गहराई के क्षेत्र के साथ सेलुलर संरचना और स्थानिक स्थिति पर दृश्य जानकारी प्रदान करते हैं। हालांकि, 2 डी सेक्शनिंग 3 डी संरचनाओं के पूरे खंड में विस्तृत सेलुलर रूपात्मक लक्षणों को प्रकट करने के लिए बड़ी 3 डी संरचनाओं के लिए सुविधाजनक है जो अन्यथा प्रकाश प्रकीर्णन के कारण सीटू में निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है जो बड़े नमूनों में संकल्प से समझौता करता है। इसके अलावा, दोनों तकनीक मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकती हैं। दरअसल, प्राप्त संकल्प कोशिकाओं की संख्या की मात्रा का परिमाणीकरण और विभिन्न सेलुलर उपप्रकारों (चित्रा 3 एफ और चित्रा 4) में विभिन्न सेल मार्करों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए सेलुलर और उपकोशिकीय विभाजन एल्गोरिदम के आवेदन की अनुमति देता है। सारांश में, यहां वर्णित इमेजिंग तकनीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सरल और पूरक हैं और सेलुलर विषमता का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Figure 3
चित्र 3: 3D पूरे माउंट, इमेजिंग और 3D और 2D ऑप्टिकल वर्गों के विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (A) मानव (h) उच्च श्रेणी के ग्लिओमा स्फेरॉइड की कॉन्फोकल छवियों को एक सप्ताह के लिए संवर्धित किया गया और होचस्ट (नीला), ओलिग 2 (पीला), और एक्टिन (लाल) (20x जल उद्देश्य) के साथ लेबल किया गया। सभी अधिग्रहित छवियों के लिए, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को सकारात्मक नियंत्रण (ऊपर) का उपयोग करके स्थापित किया गया था, और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी (नीचे) की अनुपस्थिति में प्रतिदीप्ति की कमी को नियंत्रित करने के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण को चित्रित किया गया था। (बी) एक सप्ताह के लिए सुसंस्कृत (ग्लिसरॉल-फ्रुक्टोज क्लियरिंग; 20 एक्स वाटर ऑब्जेक्टिव, कॉन्फोकल) में किए गए उच्च ग्रेड ग्लिओमा स्फेरॉइड में किए गए कि67 स्टेनिंग का ऑर्थोगोनल 3 डी होल-माउंट प्रतिनिधित्व। (ग) (ज) उच्च श्रेणी के ग्लियोमा स्फेरॉइड की कॉन्फोकल छवियों को एक सप्ताह के लिए संवर्धित किया गया और होचस्ट (नीला), ओलिग 2 (पीला), और फैलोइडिन -488 (हरा) (ग्लिसरॉल-फ्रुक्टोज समाशोधन; 20x जल उद्देश्य) के साथ लेबल किया गया। (डी) मानव (एच) रैब्डोमायोसारकोमा (ऊपर) और माउस (एम) न्यूरल क्रेस्ट सेल (नीचे) स्फेरॉइड की कॉन्फोकल छवियों को एक सप्ताह के लिए संवर्धित किया गया और क्रमशः होचस्ट (नीला), एक्टिन (लाल), और केआई 67 (हरे) के साथ लेबल किया गया (ग्लिसरॉल-फ्रुक्टोज क्लियरिंग; 20x शुष्क उद्देश्य)। (ई) (एच) उच्च श्रेणी के ग्लिओमा स्फेरॉइड की कॉन्फोकल छवियों को एक सप्ताह के लिए संवर्धित किया गया और होचस्ट (नीला) और केआई 67 (हरा) (ग्लिसरॉल-फ्रुक्टोज समाशोधन; 40x जल उद्देश्य) (शीर्ष बाएं) के साथ लेबल किया गया। होचस्ट चैनल पर खंडित छवियां और ग्रीन चैनल पर Ki67-पॉजिटिव (+) परमाणु क्षेत्रों को उच्च-सामग्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( पूरक चित्र 1 और सामग्री की तालिका देखें) (नीचे) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। दिया गया आउटपुट प्रति खंडित 3 डी संरचना (ऊपर दाएं) केआई 67+ नाभिक का प्रतिशत है। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
(ए, डी) 3 डी सेल मॉडल (एक महीने के लिए संवर्धित मानव रैब्डोमायोसारकोमा स्फेरॉइड) की 2 डी अनुभाग छवियां एक डिजिटल स्लाइड स्कैनर के साथ प्राप्त की गईं और तेजी से डिजिटल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मंच पर विश्लेषण किया गया। (ए) एच एंड ई धुंधला होना और उनके आकार के अनुसार कोशिकाओं का पता लगाना। स्केल बार = 500 μm. (B) हिस्टोग्राम तेजी से डिजिटल मात्रात्मक विश्लेषण (बाएं: हेलो) या मैन्युअल गिनती (दाएं: एमसी) के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पता लगाए गए 100 μm 2और > 100 μm2 < कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है। (सी) केआई 67 उनके 3,3'-डायमिनोबेंजिडीन (डीएबी) सिग्नल की तीव्रता के अनुसार कोशिकाओं का धुंधला होना और पता लगाना। नकारात्मक (नीला), कमजोर सकारात्मक (पीला), सकारात्मक (लाल)। स्केल बार = 500 μm. (D) हिस्टोग्राम Ki67-नकारात्मक, कमजोर सकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है। संक्षिप्तीकरण: एच एंड ई = हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन; एमसी = मैनुअल गिनती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर में चरणों का अवलोकन। विश्लेषण बिल्डिंग ब्लॉक के संघ पर आधारित हैं। प्रत्येक बिल्डिंग ब्लॉक एक फ़ंक्शन-विभाजन, गणना, एसोसिएशन, आउटपुट परिभाषा के अनुरूप है- और छवि बनाए जा रहे जैविक नमूने से मेल खाने के लिए कई एल्गोरिदम और चर चयन प्रदान करता है। सॉफ्टवेयर कई आरएमएस (रेडीमेड सॉल्यूशन) विश्लेषण प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसे आसानी से उपयोग और संशोधित किया जा सकता है। एकीकृत छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल सहेजे जा सकते हैं, विभिन्न डेटासेट पर लागू किए जा सकते हैं, और उपयोगकर्ताओं के बीच साझा किए जा सकते हैं। संक्षेप में, विश्लेषण प्रोटोकॉल का अर्थ अनुक्रमिक वस्तु विभाजन है: स्फेरॉइड, नाभिक और अंत में, Ki67 पॉकेट (A488)। फिर, सकारात्मक घटनाओं को और अधिक भेदभाव करने के लिए Ki67 पॉकेट की औसत तीव्रता की गणना की जाती है। अंत में, Ki67 सकारात्मक जेब को शामिल करने वाले नाभिक को सकारात्मक रूप से चुना जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर के प्रक्रिया चरणों का अवलोकन। चरण 1. अध्ययन टैब का उपयोग कर फ़ाइलें अपलोड करें। फ़ाइलें छवि क्रियाएँ अनुभाग में खोली जाएँगी. चरण 2. एनोटेशन टैब खोलें, फिर टूलबार के सर्कल टूल का उपयोग करके संरचना के चारों ओर एक नई परत डिजाइन करने के लिए लेयर एक्शन पर क्लिक करें। गैर-परिपत्र संरचनाओं के लिए, इसके बजाय पेन टूल का उपयोग किया जा सकता है। चरण 3. टूलबार का उपयोग एनोटेशन डिजाइन करने और टूल के साथ परिमाणीकरण की कल्पना करने के लिए किया जा सकता हैEquation 1। चरण 4. विश्लेषण टैब खोलें, और नमूने के विश्लेषण के लिए सर्वोत्तम स्थितियों का चयन करें (कई परीक्षण यहां आवश्यक हो सकते हैं)। चरण 4.1. धुंधला स्थिति सेट करने के लिए दाग चयन अनुभाग का उपयोग करें। कई दागों की स्थिति में, इन्हें जोड़ा और नाम बदला जा सकता है, और आभासी रंग को संशोधित किया जा सकता है। स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए निर्दिष्ट किया जा सकता है-परमाणु या साइटोप्लाज्म धुंधला। चरण 4.2. सेल डिटेक्शन सेट करने के लिए सेल डिटेक्शन अनुभाग का उपयोग करें। यह खंड विश्लेषण के लिए सबसे महत्वपूर्ण होगा। परमाणु कंट्रास्ट थ्रेशोल्ड अनुभाग सभी नाभिकों का पता लगाने में सक्षम होगा। यदि कई जनसंख्या आकार हैं, तो ध्यान दिया जाना चाहिए, सॉफ्टवेयर एक अद्वितीय बड़े के बजाय कई कोशिकाओं का पता लगा सकता है। परमाणु आकार और परमाणु विभाजन आक्रामकता वर्गों का उपयोग सेल आकार जनसंख्या सीमाओं को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। चरण 5. नमूना विश्लेषण चलाने के तरीके पर विवरण. चित्र में दिखाए गए चरणों का पालन करें। एनोटेशन लेयर अनुभाग केवल इस स्लाइड पर सेटिंग चलाएगा। उपकरण का उपयोग करके परिमाणीकरण की कल्पना की जा सकती हैEquation 1। उपयुक्त परिमाणीकरण प्राप्त होने तक चरण 4.1-5 दोहराएं। चरण 6-6.1. ये चरण आपको सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक आंकड़ा खींचने में सक्षम बनाते हैं। चरण 7. सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्राप्त परिमाणीकरण ग्राफिक्स को सहेजा जा सकता है। चरण 8. डेटा निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कोशिका संस्कृति ऊतक और अंग विकास, कार्य, पुनर्जनन और विघटन और बीमारी में शामिल मौलिक जैविक तंत्र को उजागर करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण है। यद्यपि मोनोलेयर्ड 2 डी सेल कल्चर प्रबल हो गया है, हाल के शोध ने 3 डी संरचनाओं को विवो सेलुलर प्रतिक्रियाओं में अधिक प्रतिबिंबित करने वाली संस्कृतियों की ओर स्थानांतरित कर दिया है, विशेष रूप से अतिरिक्त स्थानिक संगठन और सेल-सेल संपर्कों के कारण जो जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार अधिकपूर्वानुमानित डेटा प्रदान कर सकते हैं। फिर भी, कई चुनौतियां बनी हुई हैं, जिनमें विस्तृत सूक्ष्म विज़ुअलाइज़ेशन और सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर जटिल 3 डी संरचनाओं के मूल्यांकन के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल धुंधलापन और इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता शामिल है। उस संदर्भ में, 100 μm से लेकर आकार में कई मिलीमीटर तक के फिक्स्ड इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल के धुंधला और सेलुलर और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने के लिए विस्तृत, मजबूत और पूरक प्रोटोकॉल प्रदान किए गए हैं।

यह प्रक्रिया इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर मॉडल के आकार और प्रकार की एक बड़ी विविधता से निपटने के लिए दो अलग-अलग रणनीतियों को प्रस्तुत करती है। एक (3 डी होल-माउंट विश्लेषण) या दूसरे (2 डी सेक्शनिंग विश्लेषण) की पसंद उपयोग किए गए मॉडल और जांच किए गए मुद्दे पर निर्भर करेगी। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी होल-माउंट विश्लेषण 3 डी संरचना के समग्र आकार के बावजूद, 200 μm तक की गहराई के क्षेत्र के साथ कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है, जबकि 2 डी सेक्शनिंग किसी भी आकार के नमूनों पर लागू होता है, लेकिन विज़ुअलाइज़ेशन 2 डी आयामी रहता है। नीचे समस्या निवारण और तकनीकी विचारों के लिए कुछ सुझाव दिए गए हैं।

वर्कफ़्लो के दौरान 3 डी संरचनाओं का नुकसान सबसे आम खामी है। वे युक्तियों और ट्यूबों के अनुयायी रह सकते हैं, यही कारण है कि पीबीएस-बीएसए 0.1% समाधान के साथ प्रीकोटिंग टिप्स और ट्यूब महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, अभिकर्मक परिवर्तनों के बीच 3 डी संरचनाओं को तलछट देना और सभी पाइपिंग को बहुत सावधानी से करना महत्वपूर्ण है। जैसा कि प्रक्रिया में उल्लेख किया गया है, सभी चरणों के लिए, यदि 3 डी संरचना अवसादन बहुत लंबा है, तो कोशिकाओं को आरटी में 5 मिनट के लिए 50 × ग्राम पर धीरे से घुमाया जा सकता है। अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर, इस तरह के स्पिनिंग चरण के फायदे / नुकसान पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि सेंट्रीफ्यूजेशन 3 डी संरचनाओं के आकार से समझौता कर सकता है। इसके अलावा, निर्धारण चरण के दौरान इस आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि सिस्टिक ऑर्गेनोइड्स ढह जाते हैं। आकार में 400 μm से कम संरचनाओं को ठीक करने से संरचनात्मक परिवर्तनों को रोकना चाहिए।

इष्टतम इम्यूनोलेबलिंग के लिए, उनके 3 डी मैट्रिसेस से ऑर्गेनोइड्स की वसूली एक महत्वपूर्ण कदम है। 3 डी मैट्रिक्स पर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश को बाधित कर सकता है या मैट्रिक्स के लिए गैर-विशिष्ट बंधन के कारण उच्च पृष्ठभूमि धुंधला हो सकता है। ईसीएम हटाने से ऑर्गेनोइड्स के बाहरी खंडों की आकृति विज्ञान बदल सकता है (विशेष रूप से अध्ययन किए गए 3 डी संरचनाओं से फैले छोटे सेलुलर प्रोट्रूशियंस के मामले में) और आंशिक रूप से विश्लेषण में बाधा डाल सकता है। ऐसी 3 डी संरचनाओं के लिए, मैट्रिक्स को पूरी प्रक्रिया में बनाए रखा जा सकता है; हालांकि, समाधान और एंटीबॉडी के अपर्याप्त प्रवेश को रोकने और अत्यधिक पृष्ठभूमि शोर 6,8 को कम करने के उद्देश्य से लगातार धोने के कदमों से बचने के लिए मैट्रिक्स की न्यूनतम मात्रा में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए संस्कृति स्थितियों को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए।

3 डी होल माउंट स्टेनिंग सेक्शन में इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऑप्टिकल क्लियरिंग स्टेप क्लियरिंग के बिना 50-80 μm के बजाय गहराई में 150-200 μm तक 3 डी संरचनाओं की इमेजिंग के लिए प्रासंगिक है। अन्य समाशोधन पद्धतियों की तुलना में जिन्हें अक्सर कई हफ्तों की आवश्यकता होती है और विषाक्त समाशोधन एजेंटों का उपयोग करते हैं, इस प्रोटोकॉल 4,9 में पहले प्रकाशित तेज और सुरक्षित समाशोधन चरण का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, यह समाशोधन चरण प्रतिवर्ती है, और नए एंटीबॉडी को रिज़ॉल्यूशनया चमक के नुकसान के बिना प्रारंभिक धुंधलापन में जोड़ा जा सकता है। फिर भी, अध्ययन किए गए 3 डी सेल कल्चर मॉडल के आधार पर, 150-200 μm की गहराई 3 डी संरचना को सूचनात्मक तरीके से चित्रित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती है, और यह समाशोधन प्रोटोकॉल बड़े लुमेन4 के साथ गोलाकार, मोनोलेयर ऑर्गेनोइड्स की सामान्य आकृति विज्ञान में परिवर्तन का कारण बन सकता है। उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोग को सावधानीपूर्वक डिजाइन करना चाहिए, और यदि आवश्यक हो, तो परमेबिलाइजेशन / ब्लॉकिंग चरण (एंटीबॉडी और समाधान के प्रवेश की अनुमति देने के लिए), समाशोधन चरण (200 μm से अधिक गहराई में प्रवेश करने के लिए, नमूने पूरी तरह से साफ़ किए जाने चाहिए), और छवि अधिग्रहण के समय को अनुकूलित करें। कोर सुविधाओं में उपलब्ध दो सबसे प्रचलित प्रौद्योगिकियां लाइट शीट और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी होंगी। उपयोगकर्ताओं को अपने 3 डी संरचनाओं के आकार और उनके जैविक प्रश्न10 के आधार पर सावधानीपूर्वक एक तकनीक चुनने की आवश्यकता होगी। हालांकि, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में, ऐसी गहरी संरचनाओं के लिए प्राप्त प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी संकल्प उपकोशिकीय संकल्प प्राप्त करने के लिए उप-मानक बना हुआ है।

यहां, एक विस्तृत और मजबूत प्रक्रिया की सूचना दी गई है जो एकल नमूनों के पैराफिन एम्बेडिंग के लिए समर्पित है। दिलचस्प बात यह है कि गेब्रियल एट अल ने हाल ही में बढ़े हुए थ्रूपुट के साथ पैराफिन में 3 डी सेल संस्कृतियों को एम्बेड करने वाला एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। उन्होंने एक ब्लॉक में माइक्रोएरे पैटर्न में 96 3 डी संरचनाओं को सीमित करने के लिए एक पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोल्ड का उपयोग किया, जो 3 डी ट्यूमर मॉडल पर अध्ययन के लिए नए दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसमें अधिक समूह, समय बिंदु, उपचार की स्थिति औरप्रतिकृतियां शामिल हैं। हालांकि, इस विधि के लिए व्यापक कौशल और मशीनरी की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से पीडीएमएस मोल्ड बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रीमोल्ड के निर्माण के लिए।

सारांश में, यह पेपर दो अलग-अलग, पूरक और अनुकूलनीय दृष्टिकोणों का वर्णन करता है जो 3 डी सेलुलर मॉडल के वास्तुशिल्प और सेलुलर संरचना पर सटीक और मात्रात्मक जानकारी के अधिग्रहण को सक्षम करता है। दोनों पैरामीटर जैविक प्रक्रियाओं जैसे इंट्राट्यूमरल सेलुलर विषमता और उपचार के प्रतिरोध में इसकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सेंट बाल्ड्रिक के रॉबर्ट जे आर्सेसी इनोवेशन अवार्ड # 604303 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Biopsy pad Q Path blue VWR 720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500 VWR 720-2233
Cassette microtwin white VWR 720-2183
Chemical hood Erlab FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL Star lab Tip-One S1122-1730
Fine forceps Pyramid innovation R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL Fisher Scientific 11784259 Excellent  for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm Ibedi 2018003
Horizontal agitation N-BIOTEK NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C Memmert Incubator LAB129
Inox molds 15x15 VWR 720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90 Roche diagnostics 8082286001 these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome Microm Microtech France HM340E
Panoramic scan II 3dhistech 2397612
Paraffin embedding equipment Leica EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL VWR 612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250 VWR 216-1308 Good for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,  solid, provide excellent  stress  crack  and  impact  resistance and have a  good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers  excellent  sealing  characteristics. 
Set of micropipettors  (p200, p1000) Thermo Scientific 11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX PerkinElmer HH14000000
SP5 inverted confocal microscope Leica LSM780
Tissue cassette VWR 720-0228
Zeiss Axiomager microscope Leica SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030-100G
Cytoblock (kit) Thermofisher Scientific 10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 57648266 CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1% Sigma-Aldrich HT110316
Ethanol 96% VWR 83804.360 CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100% VWR 20821.365 CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4% Microm Microtech France F/40877-36 CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose Sigma-Aldrich F0127
Gill hematoxylin type II Microm Microtech France F/CP813
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 500 mL
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 CAUTION: Suspected of causing genetic defects.  Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum Sigma-Aldrich D9663 10 mL
Paraffin Wax tek III Sakura 4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X Gibco 14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X Microm Microtech France F/00801 100 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8532 CAUTION: Triton X­100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene Sigma-Aldrich 534056 CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube. 
Permeabilisation-blocking solution (PB solution) The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X  (1:10) solution PB:PBS-1X  (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software Indicalabs NM 87114
Harmony software PerkinElmer HH17000010

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References

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जीव विज्ञान अंक 169 3 डी सेल मॉडल स्फेरॉइड ऑर्गेनॉइड धुंधला इमेजिंग उच्च-रिज़ॉल्यूशन
त्रि-आयामी ऑर्गनॉइड और स्फेरॉइड मॉडल की धुंधला और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग
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Gonzalez, A. L., Luciana, L., Le Nevé, C., Valantin, J., Francols, L., Gadot, N., Vanbelle, C., Davignon, L., Broutier, L. Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models. J. Vis. Exp. (169), e62280, doi:10.3791/62280 (2021).

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