Farvning og billeddannelse i høj opløsning af tredimensionelle organoid- og sfæroidmodeller

Summary

Her leverer vi detaljerede, robuste og komplementære protokoller til at udføre farvning og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste tredimensionelle cellekulturmodeller, der spænder fra 100 μm til flere millimeter, hvilket muliggør visualisering af deres morfologi, celletypesammensætning og interaktioner.

Abstract

In vitro tredimensionelle (3D) cellekulturmodeller, såsom organoider og sfæroider, er værdifulde værktøjer til mange applikationer, herunder udvikling og sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og regenerativ medicin. For fuldt ud at udnytte disse modeller er det afgørende at studere dem på cellulære og subcellulære niveauer. Karakterisering af sådanne in vitro 3D-cellekulturmodeller kan dog være teknisk udfordrende og kræver specifik ekspertise for at udføre effektive analyser. Her giver dette papir detaljerede, robuste og komplementære protokoller til at udføre farvning og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste in vitro 3D-cellekulturmodeller, der spænder fra 100 μm til flere millimeter. Disse protokoller gælder for en lang række organoider og sfæroider, der adskiller sig i deres oprindelsescelle, morfologi og kulturbetingelser. Fra 3D-strukturhøst til billedanalyse kan disse protokoller afsluttes inden for 4-5 dage. Kort fortalt opsamles, fastgøres 3D-strukturer og kan derefter behandles enten gennem paraffinindlejring og histologisk/immunohistokemisk farvning eller direkte immunmærket og forberedt til optisk clearing og 3D-rekonstruktion (200 μm dybde) ved konfokal mikroskopi.

Introduction

I løbet af de sidste årtier har fremskridt inden for stamcellebiologi og in vitro 3D-kulturteknologier indvarslet en revolution inden for biologi og medicin. Cellemodeller med højere kompleksitet i 3D er blevet meget populære, da de tillader celler at vokse og interagere med en omgivende ekstracellulær ramme, der nøje rekapitulerer aspekter af levende væv, herunder deres arkitektur, celleorganisation og interaktioner eller endda diffusionsegenskaber. Som sådan kan 3D-cellekulturmodeller give unik indsigt i cellernes adfærd i udviklende eller syge væv in vitro. Organoider og sfæroider er begge multicellulære 3D-strukturer, der spænder fra flere mikrometer til millimeter, og er de mest fremtrædende in vitro 3D-strukturer. Begge kan dyrkes i et støttestillads, herunder (i) hydrogeler afledt af dyr (kældermembranekstrakt, kollagen), planter (alginat / agarose) eller syntetiseres fra kemikalier eller (ii) inerte matricer indeholdende porer for at fremme celleproliferation og vækst.

Organoider og sfæroider kan også udvikle sig uden tilstedeværelse af et understøttende stillads ved at stole på celler til selvmontering i klynger. Dette er afhængig af forskellige teknikker såsom brugen af ikke-klæbende materialer til at hæmme cellefastgørelse, overfladespænding og tyngdekraft (f.eks. Hængende dråbeteknikker) eller konstant cirkulær rotation af kar (f.eks. Spinnerkultur). I alle tilfælde letter disse teknikker celle-celle- og cellematrixinteraktioner for at overvinde begrænsningerne ved traditionel enkeltlagscellekultur¹. Udtrykkene "organoider" og "sfæroider" er tidligere blevet brugt om hverandre, men der er vigtige forskelle mellem disse to 3D-cellekulturmodeller. Organoider er in vitro 3D-cellulære klynger afledt af pluripotente stamceller eller vævsspecifikke stamceller, hvor celler spontant selvorganiserer sig i forfædre og differentierede celletyper, og som rekapitulerer i det mindste nogle funktioner i det pågældende organ². Sfæroider omfatter en bredere vifte af multicellulære 3D-strukturer dannet under ikke-klæbende forhold og kan opstå fra en stor mangfoldighed af celletyper såsom udødeliggjorte cellelinjer eller primære celler³. Derfor har organoider, der er forbundet med deres iboende stamcelleoprindelse, en højere tilbøjelighed til selvmontering, levedygtighed og stabilitet end sfæroider.

Ikke desto mindre er disse to modeller i det væsentlige 3D-strukturer sammensat af flere celler, og de teknikker, der er udviklet til at studere dem, er således meget ens. For eksempel er kraftige billeddannelsesmetoder på enkeltcelleopløsningsniveauet nødvendige for at undersøge den cellulære kompleksitet af både organoider og sfæroider. Her, ved at opsummere denne gruppes ekspertise og ledere inden for organoider⁴, beskriver dette papir detaljerede procedurer til at udføre todimensionel (2D) og 3D helmonteret farvning, billeddannelse og analyser af den cellulære og subcellulære sammensætning og rumlige organisering af organoider og sfæroider fra 100 μm til flere millimeter. Faktisk præsenterer denne procedure to forskellige og komplementære typer farvning og billeddannelseserhvervelse til analyse af en lang række størrelser og typer af in vitro 3D-cellekulturmodeller. Brugen af den ene (3D helmonteringsanalyse) eller den anden (2D-sektionsanalyse) afhænger af den undersøgte model og de søgte svar. 3D-helmonteret analyse ved konfokalmikroskopi kan f.eks. anvendes til at visualisere celler i 3D-kultur op til 200 μm dybde, uanset 3D-strukturens samlede størrelse, mens analysen af 2D-sektioner giver indsigt i prøver af enhver størrelse, omend på 2D-niveau. Denne procedure er blevet anvendt med succes på tværs af en række organoider^4,5 og sfæroider afledt af humane celler og murinceller^, der stammer fra forskellige embryonale kimlag. Oversigten over proceduren er vist i figur 1. De store faser, forholdet mellem dem, afgørende skridt og den forventede timing er angivet.

Figur 1: Skematisk oversigt over proceduren. In vitro 3D-cellekulturmodeller indsamles og fikseres derefter enten forberedt til 3D-helmonteret farvning (mulighed a) eller indlejret i paraffin til 2D-sektionering og farvning (mulighed b). Til 3D-helmonterede farvningseksperimenter immunmærkes faste 3D-strukturer efter fikseringstrinnet. Et valgfrit optisk rensningstrin kan udføres for at forbedre billedkvaliteten og dybden af optisk mikroskopi ved at reducere lysspredning under billedbehandling. Billeder optages på et omvendt konfokalmikroskop eller et konfokal højindholdssystem og analyseres ved hjælp af den relevante software. Til paraffinindlejring behandles 3D-strukturer direkte (mulighed b.1 for store strukturer ≥ 400 μm) eller indgår i en gel (b.2; små strukturer ≤ 400 μm) til dehydrering og paraffinindlejring. Paraffinblokke skæres derefter og farves (histologisk eller immunokemisk farvning). Billeder af 2D-sektioner opnås på en digital diasscanner eller et opretstående mikroskop og analyseres på en billedanalyseplatform ved hjælp af hurtig digital kvantitativ analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

BEMÆRK: Der må forventes et tab på ≤25 % af det oprindelige antal 3D-strukturer under de trin, der involverer reagensskift og vask i den følgende procedure. Planlæg at bruge et endeligt antal på mindst ti 3D-strukturer med en størrelse fra 100 til 500 μm pr. testet tilstand til at udføre kvalitative og kvantitative billedanalyser. Hvis det er nødvendigt, skal du for større strukturer skære enderne af 1 ml pipettespidser for at undgå at bryde strukturerne. For alle trin, hvis 3D-struktursedimentering er for lang, kan celler forsigtigt spindes ved 50 × g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Afhængigt af det undersøgte problem bør fordele / ulemper ved et sådant centrifugeringstrin overvejes, da centrifugering kan kompromittere formen på 3D-strukturerne. Undgå at dreje ved >100 × g.

1. Indsamling og fiksering af 3D-cellekulturmodeller

BEMÆRK: Pas på ikke at aspirere 3D-strukturerne, som kun er løst fastgjort til rørvæggen.

1. Høstning af 3D-cellekulturmodeller indlejret i en matrix
   BEMÆRK: Dette afsnit beskriver genvinding af 3D-strukturer dyrket i dråber af et kældermembranekstrakt fra murin Engelbreth-Holm-Swarm-sarkom (BME), men kan tilpasses andre matricer. Se diskussionen for afgørende punkter vedrørende ECM.
   1. Fjern kulturmediet fra brøndene uden at forstyrre 3D-matrixen. Fortræk indersiden og ydersiden af en 1 ml pipettespids med protein (herefter kaldet forlakeret 1 ml spids) ved at dyppe spidsens fulde længde i 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufret saltvand (PBS) (herefter kaldet PBS-BSA 0,1 % opløsning) og pipettere 1 ml af denne opløsning op og ned to gange.
      BEMÆRK: Denne forbelægning forhindrer cellerne i at klæbe til spidsen og minimerer ethvert tab.
   2. Fortræk indersiden af et centrifugerør (15 ml) med protein (herefter kaldet forlakeret centrifugerør ) ved gentagne gange at fylde med PBS-BSA 0,1% opløsning og tømme glasset.
      BEMÆRK: Dette forhindrer cellerne i at klæbe til røret og minimere ethvert tab.
   3. Brug den præcoatede 1 ml spids til forsigtigt at resuspendere brøndens 3D-strukturer ved hjælp af 1 ml iskold 1x PBS og overfør forsigtigt suspensionen indeholdende 3D-strukturerne til det præcoatede centrifugerør.
   4. Tilsæt forsigtigt 13 ml iskold 1x PBS, og lad 3D-strukturerne sedimentere på is i mindst 10 minutter.
      BEMÆRK: Drej om nødvendigt i 5 minutter ved 50 × g ved 4 °C. Undgå at dreje >100 × g, da dette vil kompromittere formen på 3D-strukturerne.
   5. Supernatanten fjernes. Brug en forlakeret 1 ml spids til forsigtigt at resuspendere 3D-strukturerne i 1 ml iskold 1x PBS. Trin 1.1.4 til 1.1.5 gentages for at opnå en homogen pellet uden 3D-matrixrester.
      BEMÆRK: Effektiv matrixfjernelse påvirkes af typen af matrix, antallet og størrelsen af 3D-strukturer og kræver optimering til forskellige kulturforhold. For 3D-strukturer dyrket i BME tager genopretning fra matrixfjernelsen typisk 45-60 minutter.
   6. Brug en forlakeret 1 ml spids til at overføre 1 ml 1x PBS-suspensionen indeholdende 3D-strukturerne til et forlakeret 1,5 ml centrifugerør, og fortsæt med punkt 1.3.
2. Høstning af flydende 3D-cellekulturmodeller
   1. Brug en forlakeret 1 ml spids til forsigtigt at samle og overføre 3D-strukturerne til et forlakeret 1,5 ml centrifugerør. Lad 3D-strukturerne sedimentere eller dreje i 5 minutter ved 50 × g ved RT.
   2. Supernatanten fjernes. Brug en forlakeret 1 ml spids til at resuspendere 3D-strukturerne i 1 ml 1x PBS. Fortsæt med afsnit 1.3.
3. Fastgørelse af 3D-cellekulturmodeller
   1. Lad 3D-strukturerne sedimentere. Supernatanten fjernes forsigtigt; Under en stinkhætte resuspenderes 3D-strukturerne forsigtigt i 1 ml formalin ved hjælp af en forbelagt 1 ml spids.
      BEMÆRK: Formalin indeholder formaldehyd, hvilket er farligt. Manipuler kemikaliet i en kemisk hætte. Brug gummihandsker og beskyttelsesbriller.
   2. Inkuber 3D-strukturerne i 30 minutter ved RT.
      BEMÆRK: Der kræves et 30 minutters fikseringstrin med formalin til immunfarvning af en lang række 3D-strukturer (varierende i størrelse, form og oprindelse). Generelt er længere fikseringstider (>3 timer) imidlertid bedre egnet til at bevare fluorescensen af reporterproteiner.
   3. Lad 3D-strukturerne sedimentere eller dreje i 5 minutter ved 50 × g ved RT. Fjern forsigtigt formalinet, og erstat det med 1 ml 1x PBS. Gentag dette vasketrin i 1x PBS to gange. Prøverne opbevares ved 4 °C, og der fortsættes med punkt 2 eller 3.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og cellerne kan opretholdes ved 4 °C til langtidsopbevaring (>1 år).

2.3D hel montering farvning, billeddannelse og analyse af 3D-cellekulturmodeller

BEMÆRK: Da organoiderne er løst fastgjort til rørvæggen, skal du håndtere dem forsigtigt, da alle følgende reagensændringer kan forårsage tab af prøver. Før du starter, skal du sikre dig, at de korrekte kontroller til farvning er tilgængelige. Positive og negative kontroller kan være celler, hvor proteinet af interesse vides at være enten overudtrykt eller fraværende. Inkuber prøver uden det primære antistof for at bestemme, om det observerede signal skyldes ikke-specifik binding af det sekundære antistof. Da nogle celler har tendens til at vise høje niveauer af autofluorescens, skal du bruge kontroller uden sekundært antistof for at afgøre, om den observerede fluorescens kommer fra baggrundsautofluorescens. Immunmærkning og fluorescerende reporter visualisering kan kombineres.

1. 3D helmonteret farvning
   1. Forbered permeabiliseringsblokerende (PB) opløsning ved at supplere 1x PBS med 0,1% -1% af et ikke-ionisk overfladeaktivt stof (se materialetabellen), 1% dimethylsulfoxid, 1% BSA og 1% æselserum (eller fra dyret, hvor de sekundære antistoffer blev rejst).
      BEMÆRK: Optimer forsigtigt koncentrationen af det ikke-ioniske overfladeaktive middel afhængigt af lokaliseringen af målet: membran (0-0,5%), cytoplasma (0,5-1%) og kerne (1%). Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. BSA fungerer normalt godt til blokeringstrinnet, men i tilfælde af høj baggrundsstøj skal du udføre en empirisk test for at opnå de bedst mulige resultater for en given kombination af antistoffer.
   2. Overfør organoiderne fra 1,5 ml centrifugerøret til et 0,5 ml rør ved hjælp af en forbelagt 1 ml spids. Lad organoiderne sedimentere, fjern forsigtigt 1x PBS, og erstat den med 0,5 ml PB-opløsning. Inkuber organoiderne med blid vandret omrøring (30-50 o / min) i 1 time ved RT.
   3. Lad organoiderne bundfælde, fjern forsigtigt PB-opløsningen, og vask to gange i 1 mL PBS-BSA 0,1% i 3 min.
      BEMÆRK: Hvis du venter i 3 minutter, kan strukturerne sedimentere i bunden af røret.
   4. PBS-BSA 0,1 % fjernes forsigtigt, og der tilsættes 250 μL primært antistof fortyndet i den passende koncentration i PB:1x PBS-opløsning (1:10). For at klargøre 10 ml PB:1x PBS (1:10) opløsning fortyndes 1 ml PB-opløsning i 9 ml 1x PBS. Der inkuberes i 2-3 dage med let vandret omrøring (30-50 omdr./min.) ved 4 °C.
      BEMÆRK: En passende antistofinkubationstid er afgørende for en passende antistofpenetration, da 3D-strukturer undertiden kan nå store størrelser.
   5. Lad organoiderne sedimentere, og fjern forsigtigt den primære antistofopløsning. Vask 5x i PBS-BSA 0,1% i 3 min pr. vask og derefter 2x i 1 mL PBS-BSA 0,1% i 15 min pr. vask med blid vandret omrøring.
   6. Der tilsættes 250 μL sekundært antistof fortyndet ved 1:250 i PB:1x PBS (1:10)-opløsning. Der inkuberes i 24 timer ved 4 °C med let vandret omrøring (30-50 omdr./min.). I dette trin skal du beskytte prøverne mod lys.
   7. Der tilsættes 250 μL Hoechst 33342 (20 μM stamopløsning) fortyndet ved 1:1000 i PB:1x PBS-opløsning (1:10), og der inkuberes i yderligere 2 timer ved 4 °C med let vandret omrøring (30-50 omdr./min.).
   8. Organoiderne får bundfældning, og opløsningen indeholdende sekundært antistof + Hoechst 33342 fjernes forsigtigt. Organoiderne vaskes 5x i 1 ml 1x PBS i 3 min pr. vask og derefter 2x i 1 ml 1x PBS i 15 min pr. vask med let vandret omrøring (30-50 o / min).
      BEMÆRK: Det er afgørende at vaske prøverne grundigt for at undgå baggrundsstøj eller tab af signal.
   9. Prøverne opbevares i PBS ved 4 °C indtil billedoptagelse. Fortsæt med afsnit 2.2.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne kan opbevares ved 4 °C i flere måneder, beskyttet mod lys.
2. Prøveforberedelse til konfokal billeddannelse
   1. Brug en forbelagt 1 ml spids til forsigtigt at overføre organoiderne til 50 μL af 1x PBS pr. brønd i en 96-brønds sort polystyrenmikroplade. Fortsæt med trin 2.2.3 eller punkt 2.3.
      BEMÆRK: På dette stadium kan prøven beskyttes mod lys og opbevares ved 4 °C i mange uger.
   2. Clearing
      BEMÆRK: Clearingtrinnet er valgfrit og kan bruges til enten at immunmærke organoider eller til at detektere endogen fluorescens. Rydning kan forårsage 3D-strukturkrympning, men ændrer ikke den generelle morfologi bortset fra sfæriske enkeltlags organoider med store lumen⁴. For disse cystiske organoider skal du springe clearingtrinnet over og udføre dybvævsbilleddannelse⁶.
      1. Der fremstilles 2,5 M glycerolfruktoserydningsopløsning indeholdende 50% v/v glycerol, 11% v/v destilleret vand og 45% w/v fruktose ved blanding på en magnetisk omrører mindst natten over, indtil opløsningen er fuldstændig opløselig og homogen. Opbevares ved 4 °C mørkt i op til 1 måned.
      2. Fjern så meget 1x PBS som muligt uden at røre organoiderne. Tilsæt 200 μL af clearingopløsningen ved hjælp af en 1 ml pipettespids efter fjernelse af enden, og resuspender forsigtigt for at forhindre dannelse af bobler. Der inkuberes ved RT i mindst 12 timer, og fortsæt med punkt 3.
         BEMÆRK: Da rydningsløsningen er tyktflydende, er små mængder vanskelige at håndtere. For at lette håndteringen skal du sørge for, at opløsningen er ved RT, og pipette langsomt. For optimal rydning skal prøven sedimenteres i clearingopløsningen i mindst 24 timer før billeddannelse. Hvis 3D-strukturer flyder på tidspunktet for erhvervelsen, skal du udføre et valgfrit spin i 10 minutter ved <100 × g ved RT eller give mere tid (en til flere dage) til at lade dem sedimentere. Protokollen kan sættes på pause på dette trin, før du fortsætter til billeddannelse, hvis den er beskyttet mod lys og opbevares ved 4 °C (i uger) eller -20 °C (i flere måneder).
3. Billedoptagelse og analyse
   BEMÆRK: Billedsektionsteknologi kræves for at afbilde 3D-strukturer.
   1. Brug konfokale mikroskoper, og favoriser nedsænkningsmål med højere numerisk blænde (NA) sammenlignet med luft. Vælg forstørrelsesmål (10x, 20x, 40x) i henhold til størrelsen af 3D-strukturer, billedrekonstruktion (syning) og løsninger, der bruges til analysen.
   2. Når du vælger anskaffelsestilstand, skal du tage højde for fokusdybden for det mål, der bruges til at definere trinnet for Z-stabling; giver mulighed for optimal 3D-gengivelse.
      BEMÆRK: Billedanalyseløsninger varierer, og analysen skal justeres til den anvendte software. For eksempel blev denne analyseprotokol etableret på en analysesoftware med højt indhold (se tabel over materialer og supplerende figur 1 for detaljer) og giver data om objektsegmentering, beregning af egenskaber og cellepopulationsvalg inden for et 3D-rekonstrueret objekt.

3. 2D-sektionering, farvning, billeddannelse og analyse af 3D-cellekulturmodeller

BEMÆRK: 3D-cellekulturmodeller varierer i størrelse. Fortsæt med punkt 3.1 eller 3.2 for effektiv paraffinindlejring (figur 2). Giv tilstrækkelig tid til sedimentering af 3D-strukturen, før der foretages vaskning og ændring af reagens. Pas på ikke at aspirere organoiderne, der flyder i bunden af røret. For paraffinindlejring henvises til figur 2 for vejledning.

1. Paraffinindlejring af store (Ø ≥ 400 μm) 3D-cellekulturmodeller
   1. Dagen før indlejring forvarmes to 150 ml kolber fyldt med paraffin (paraffinbade), en lille metalindlejringsform pr. prøve og fine pincet til 65 °C.
   2. Brug en forlakeret 1 ml spids til forsigtigt at overføre organoiderne i 1x PBS til et fladbundet glasrør med en polytetrafluorethylenforet flaskehætte. Lad organoiderne sedimentere, fjern forsigtigt 1x PBS, og erstat det med 70% ethanol. Inkuber i mindst 30 min.
   3. Lad organoiderne sedimentere, og fjern forsigtigt 70% ethanol. Udskift den med 1 ml brugsklar eosin Y-opløsning. Svip tuben, og pletter i mindst 30 minutter. Fjern forsigtigt eosinopløsningen, og dehydrer organoiderne i tre på hinanden følgende vaske med 1 ml 100% ethanol i ~ 30 minutter hver.
      BEMÆRK: Ethanol, en brandfarlig og flygtig væske, forårsager alvorlig øjen- og luftvejsirritation. Manipuler det i en røghætte, og brug beskyttelsesbriller.
   4. Fjern forsigtigt 100% ethanol, og fjern organoiderne under en kemisk hætte i 3 på hinanden følgende vaske med 1 ml xylen i ~ 30 minutter hver.
      BEMÆRK: Xylen er en giftig, flydende brandfarlig, hvis dampe kan forårsage irritation. Manipuler det i en røghætte. Undgå direkte kontakt med huden, og brug gummihandsker og beskyttelsesbriller.
   5. Under en kemisk hætte skal du forberede en hvid mikrotwinvævskassettte ved at placere et stykke biopsipude, der tidligere er gennemblødt i xylen) inde i et af kassettens rum. Overfør forsigtigt 3D-strukturerne ved hjælp af en forlakeret 2 ml plast Pasteur-pipette til biopsipladen. Dæk dem med en anden biopsipude, gennemblødt i xylen for at forhindre organoiderne i at bevæge sig, og luk kassetten.
   6. Hvis flere prøver behandles, anbringes kassetten i et xylenbad for at afvente yderligere behandling. Når alle prøver er overført til kassetter, anbringes kassetterne i et forvarmet paraffinbad i 30 minutter ved 65 °C. Overfør kassetterne til et frisk forvarmet paraffinbad natten over.
   7. Efter paraffinimprægnering skal du tage en forvarmet indlejringsform og tilsætte den opvarmede paraffin til den. Placer biopsipuden, der indeholder 3D-strukturerne i formen, og omrør den forsigtigt, indtil alle organoiderne falder til bunden af formen. Placer meget omhyggeligt 3D-strukturerne i midten af formen ved hjælp af forvarmede fine tang. Fortsæt med afsnit 3.3.
      BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre 3D-strukturerne med pincet; Skub, men klem dem ikke.
2. Paraffinindlejring af små (Ø ≤ 400 μm) 3D-cellekulturmodeller
   1. Dagen før indlejring forvarmes to 150 ml kolber fyldt med paraffin (paraffinbade), en lille metalindlejringsform pr. prøve og fine pincet til 65 °C.
   2. Fjern forsigtigt 1x PBS fra organoidsuspensionen. Udfør forsigtigt 3 vaske i 1 ml 1x Tris-bufret saltvand (TBS). Fjern så meget 1x TBS som muligt uden at røre organoiderne.
      BEMÆRK: Pas på ikke at aspirere prøven. Udfør om nødvendigt et 5 minutters spin ved 50 x g ved RT. Resterende spor af fosfat vil forstyrre følgende trin, især forebyggelse af gelpolymerisation. Brug derfor ikke PBS-opløsninger under noget behandlingstrin. Til dette trin blev et kommercielt sæt, der indeholdt kassetter, reagens # 1 (klar væske) og reagens # 2 (farvet væske), brugt til at lette den paraffinindlejrede procedure uden potentielt at miste små fragmenter (se materialetabel). Følg instruktionerne i sættet. Kassetterne er færdigmonteret med bagpapir og papindsatser, der allerede er på plads.
   3. Tilsæt 2 dråber reagens #2 i røret, og bland forsigtigt ved at banke på røret. Tilsæt 2 dråber reagens #1, og bland igen ved at banke for at få gelen til at størkne. Brug den fine tang til at fjerne gelen fra røret og placere den i kassettens brønd.
   4. Under damphætten dehydreres prøven ved at anbringe kassetten i successive bade som følger (brug 150 ml kolber, og brug frisk ethanol eller xylen til hvert bad): ethanol 70%, 30 min; ethanol 96%, 30 min; ethanol 100%, tre vaske, 30 min hver; xylen, tre vaske, 30 min hver.
   5. Anbring kassetterne i et forvarmet paraffinbad i 30 minutter ved 65 °C, og overfør dem til et friskt forvarmet paraffinbad natten over. Efter paraffinimprægnering skal du tage en forvarmet indlejringsform og tilføje opvarmet paraffin i den. Åbn kassetten, løsn gelen forsigtigt med fine pincet, og placer gelen, der indeholder 3D-strukturerne, på midten af indlejringsformen. Fortsæt med afsnit 3.3.
3. Almindelige trin til paraffinindlejring
   1. Overfør forsigtigt formen til et koldt område for at lade paraffinen størkne i et tyndt lag, som opretholder 3D-strukturerne i den passende position. Tilføj en vævskassette oven på formen, og tilsæt varm paraffin for at dække denne plastikkassette. Fjern formen, når den er helt størknet, og fortsæt med punkt 3.4.
      BEMÆRK: Paraffinblokke kan opbevares ved stuetemperatur i årevis.

Figur 2: Oversigt over proceduren for paraffinindlejring af store og små in vitro 3D-cellekulturmodeller.
(A) Standardprocedure for paraffinindlejring. Efter fiksering og dehydrering farves 3D-strukturer med eosin for at lette deres visualisering (øverst og nederst til venstre). 3D-strukturer placeres omhyggeligt på biopsipepuden (blå) i kassetten ved hjælp af en 2 ml Pasteur-pipet (midten). Efter paraffinimprægnering falder 3D-strukturerne forsigtigt ned i den flydende paraffin ved hjælp af tang og omrøres forsigtigt i biopsipappen. Små 3D-strukturer går tabt under dette trin, da de ikke kan frigøres fra puden (nederst til højre: mislykket indlejring). Kun store 3D-strukturer vil blive indlejret (øverst til højre: vellykket indlejring). Pilespidser peger på 3D-kulturer. (B) Alternativ til standardprotokollen for paraffinindlejring. Efter at have fastgjort små 3D-strukturer bruges et kommercielt sæt til at opretholde celler i en gel og lette deres overførsel til formen efter paraffinimprægnering (højre: vellykket indlejring). Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Bloker sektionering og farvning
   1. Skær 4 μm sektioner ved hjælp af et standard mikrotom, og udfør standard histologiske og immunhistokemiske teknikker. Fortsæt med afsnit 3.5.
      BEMÆRK: Specifikke dias (se materialetabel) blev brugt til en bedre vedhæftning af sektioner. Rutsjebanerne kan opbevares ved stuetemperatur eller ved 4 °C i årevis.
5. Billedoptagelse og analyse
   1. Udfør billeddannelse ved hjælp af en digital diasscanner eller opretstående mikroskop, og analyser data ved hjælp af en platform til hurtig digital kvantitativ analyse, der rapporterer morfologiske og multipleksede ekspressionsdata på celle-for-celle-basis på tværs af hele 3D-struktursektioner (se supplerende figur 2 for detaljer).
      BEMÆRK: 20x-målet bruges rutinemæssigt af denne gruppe.

Representative Results

Denne protokol giver et overblik over de kritiske trin for 2D- og 3D-helmonteret farvning samt billeddannelse og kvantitative analyser af 3D-cellekulturmodeller (figur 3 og figur 4). Det kan anvendes til en bred vifte af 3D-cellekulturmodeller - fra sfæroider til organoider fra forskellige værtsarter eller væv - og muliggør erhvervelse af nøjagtige og kvantitative oplysninger om arkitektur, celleorganisation og interaktioner på cellulære og subcellulære niveauer (figur 3 og figur 4). Laboratorier kan være nødt til at optimere 2D histologiske og immunhistokemiske teknikker og antistofkoncentrationer i henhold til deres egne behov.

Begge metoder giver værdifuld biologisk information. 3D helmonteret farvning og konfokal mikroskopi giver visuel information om cellulær sammensætning og rumlig position med et dybdefelt på op til 200 μm (figur 3B). Imidlertid er 2D-sektionering praktisk for større 3D-strukturer til at afsløre detaljerede cellulære morfologiske træk i hele sektionen af 3D-strukturer, der ellers kan være udfordrende at observere in situ på grund af lysspredning, der kompromitterer opløsningen i større prøver. Desuden kan begge teknikker give kvantitative data. Faktisk tillader den opnåede opløsning anvendelse af cellulære og subcellulære segmenteringsalgoritmer til kvantificering af antallet af celler og påvisning af tilstedeværelsen af forskellige cellemarkører i forskellige cellulære undertyper (figur 3F og figur 4). Sammenfattende er de billeddannelsesteknikker, der er beskrevet her, reproducerbare, enkle og komplementære og repræsenterer værdifulde værktøjer til at studere cellulær heterogenitet.

Figur 3: Repræsentative resultater for 3D hele montering, billeddannelse og analyser af 3D og 2D optiske sektioner. (A) Konfokale billeder af mennesker h) sfærisk sfæroid af høj kvalitet gliom, der dyrkes i en uge og er mærket med Hoechst (blå), Olig2 (gul) og Actin (rød) (20x vandmål). For alle erhvervede billeder blev mikroskopindstillinger etableret ved hjælp af en positiv kontrol (øverst), og derefter blev den negative kontrol afbildet ved hjælp af identiske indstillinger for at kontrollere manglen på fluorescens i fravær af primært antistof (bund). (B) Ortogonal 3D helmonteret repræsentation af Ki67-farvning udført i (h) højkvalitets gliomsfæroid dyrket i en uge (glycerol-fruktoserensning; 20x vandmål, konfokal). (C) Konfokale billeder af h) højkvalitets gliomsfæroid dyrket i en uge og mærket med Hoechst (blå), Olig2 (gul) og phalloidin-488 (grøn) (glycerol-fruktoserensning; 20x vandmål). (D) Konfokale billeder af sfæroider dyrket i henholdsvis Hoechst (blå), Actin (rød) og Ki67 (grøn) (glycerol-fruktoserensning; 20x tørt mål). (E) Konfokale billeder af h) højkvalitets gliomsfæroid dyrket i en uge og mærket med Hoechst (blå) og Ki67 (grøn) (glycerol-fruktoserensning; 40x vandmål) (øverst til venstre). Segmenterede billeder på Hoechst-kanalen og Ki67-positive (+) nukleare regioner på den grønne kanal blev genereret ved hjælp af software til analyse med højt indhold (se supplerende figur 1 og materialetabel) (nederst). Det angivne output er procentdelen af Ki67⁺ kerner pr. segmenteret 3D-struktur (øverst til højre). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Repræsentative resultater for billeddannelse og analyser af optiske 2D-sektioner. (A, D) 2D-sektionsbilleder af en 3D-cellemodel (humane rhabdomyosarcoma sfæroider dyrket i en måned) opnået med en digital diasscanner og analyseret på en platform til hurtig digital kvantitativ analyse. (A) H&E-farvning og detektion af celler i henhold til deres størrelse. Skalabjælke = 500 μm. (B) Histogram viser procentdelen af celler < 100 μm 2 og > 100 μm² detekteret ved hjælp af software til hurtig digital kvantitativ analyse (venstre: Halo) eller manuel tælling (højre: MC). C) Ki67-farvning og detektion af celler i henhold til intensiteten af deres 3,3'-diaminobenzidinsignal (DAB). Negativ (blå), svagt positiv (gul), positiv (rød). Skalabjælke = 500 μm. (D) Histogram viser procentdelen af Ki67-negative, svagt positive og positive celler. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; MC = manuel optælling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Oversigt over trinnene i billedanalysesoftwaren. Analyserne er baseret på sammenhængen mellem byggesten. Hver byggesten svarer til en funktionssegmentering, beregning, tilknytning, outputdefinition - og tilbyder flere algoritmer og variable valg, der matcher den biologiske prøve, der afbildes. Softwaren giver flere RMS (Ready Made Solution) analyseprotokoller, der let kan bruges og ændres. Integrerede billedanalyseprotokoller kan gemmes, anvendes på forskellige datasæt og deles mellem brugere. Kort fortalt indebærer analyseprotokollen sekventiel objektsegmentering: sfæroide, kerner og endelig Ki67-lommer (A488). Derefter beregnes den gennemsnitlige intensitet af Ki67-lommerne for yderligere at diskriminere de positive begivenheder. Endelig vælges kerner, der omfatter Ki67-positive lommer, positivt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Oversigt over proceduretrinnene i den kvantitative analysesoftware. Trin 1. Upload filerne ved hjælp af fanen Studier . Filer åbnes i afsnittet Billedhandlinger . Trin 2. Åbn fanen Anmærkninger , og klik derefter på Laghandlinger for at designe et nyt lag rundt om strukturen ved hjælp af cirkelværktøjet på værktøjslinjen. For ikke-cirkulære strukturer kan penværktøjet bruges i stedet. Trin 3. Værktøjslinjen kan bruges til at designe annoteringer og visualisere kvantificeringen med værktøjet . Trin 4. Åbn fanen Analyse , og vælg de bedste betingelser for analyse af prøven (flere forsøg kan være nødvendige her). Trin 4.1. Brug afsnittet Valg af pletter til at konfigurere farvningstilstanden. I tilfælde af flere pletter kan disse tilføjes og omdøbes, og den virtuelle farve kan ændres. Lokaliseringsdetekteringen kan specificeres - nuklear eller cytoplasmafarvning. Trin 4.2. Brug sektionen Celleregistrering til at konfigurere celleregistreringen. Dette afsnit vil være det vigtigste for analysen. Afsnittet Tærskelværdi for kernekontrast gør det muligt at detektere alle kerner. Der skal tages hensyn til, at hvis der er flere befolkningsstørrelser, kan softwaren registrere flere celler i stedet for en unik stor. Sektioner om nuklear størrelse og nuklear segmentering aggressivitet kan bruges til at kvantificere befolkningsintervaller for cellestørrelse. Trin 5. Beskrivelse af, hvordan prøveanalyse køres. Følg trinene vist i figuren. Sektionen Annotationslag kører kun indstillingen på dette dias. Kvantificeringen kan visualiseres ved hjælp af værktøjet. Trin 4.1-5 gentages, indtil der er opnået en passende kvantificering. Trin 6-6.1. Disse trin giver dig mulighed for at tegne en figur ved hjælp af softwaren. Trin 7. Kvantificeringsgrafik opnået via software kan gemmes. Trin 8. Data kan eksporteres. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Cellekultur er et uundværligt redskab til at afdække grundlæggende biologiske mekanismer involveret i vævs- og organudvikling, funktion, regenerering og forstyrrelse og sygdom. Selvom monolaget 2D-cellekultur har domineret, har nyere forskning skiftet mod kulturer, der genererer 3D-strukturer, der mere afspejler in vivo-cellulære reaktioner, især på grund af yderligere rumlig organisation og celle-cellekontakter, der påvirker genekspression og cellulær adfærd og dermed kunne give mere prædiktive data⁷. Ikke desto mindre er der stadig mange udfordringer, herunder behovet for brugervenlige farvnings- og billeddannelsesteknikker til detaljeret mikroskopisk visualisering og evaluering af komplekse 3D-strukturer på cellulært og subcellulært niveau. I den sammenhæng er detaljerede, robuste og komplementære protokoller blevet leveret til at udføre farvning og cellulær og subcellulær opløsningsbilleddannelse af faste in vitro 3D-cellekulturmodeller, der spænder fra 100 μm til flere millimeter i størrelse.

Denne procedure præsenterer to forskellige strategier til at håndtere en lang række størrelser og typer af in vitro 3D-cellekulturmodeller. Valget af den ene (3D-helmonteringsanalyse) eller den anden (2D-sektionsanalyse) afhænger af den anvendte model og det undersøgte problem. 3D-helmonteringsanalyse ved konfokalmikroskopi muliggør visualisering af celler med et dybdefelt på op til 200 μm, uanset den samlede størrelse af 3D-strukturen, mens 2D-sektionering kan anvendes til prøver af enhver størrelse, men visualisering forbliver 2D-dimensionel. Nedenfor er nogle forslag til fejlfinding og tekniske overvejelser.

Tab af 3D-strukturer under arbejdsgangen er den mest almindelige ulempe. De kan forblive klæbende til spidserne og rørene, hvorfor forbelægningsspidser og rør med PBS-BSA 0,1% opløsning er nøglen. Desuden er det afgørende at lade 3D-strukturerne sedimentere mellem reagensændringer og udføre al pipettering meget omhyggeligt. Som nævnt i proceduren kan celler for alle trin, hvis 3D-struktursedimentering er for lang, forsigtigt spindes ved 50 × g i 5 minutter ved RT. Afhængigt af formålet med undersøgelsen bør fordele / ulemper ved et sådant spindetrin overvejes, da centrifugering kan kompromittere formen på 3D-strukturerne. Desuden bør man sørge for at bevare denne morfologi under fikseringstrinnet, fordi cystiske organoider har tendens til at kollapse. Fastgørelse af strukturer under 400 μm i størrelse bør forhindre strukturelle ændringer.

For optimal immunmærkning er genopretning af organoider fra deres 3D-matricer et afgørende skridt. 3D-matrixen kan hindre tilstrækkelig antistofindtrængning eller føre til farvning med høj baggrund på grund af ikke-specifik binding til matrixen. Fjernelse af ECM kan ændre morfologien af de ydre segmenter af organoider (især i tilfælde af små cellulære fremspring, der strækker sig fra studerede 3D-strukturer) og delvist hæmme analyser. For sådanne 3D-strukturer kan matrixen bevares under hele proceduren; Kulturbetingelserne bør dog tilpasses omhyggeligt, så cellerne dyrkes i en minimal matrix, for at undgå utilstrækkelig indtrængning af opløsninger og antistoffer og for at undgå successive vasketrin, der har til formål at reducere overdreven baggrundsstøj ^6,8.

Det optiske rydningstrin, der er beskrevet i denne protokol i 3D-farveafsnittet for hele monteringen, er relevant for billeddannelse af 3D-strukturer op til 150-200 μm i dybden i stedet for 50-80 μm uden rydning. Sammenlignet med andre clearingmetoder, der ofte kræver flere uger og anvender giftige clearingmidler, blev der anvendt et tidligere offentliggjort hurtigt og sikkert clearingtrin i denne protokol ^4,9. Derudover er dette clearingtrin reversibelt, og nye antistoffer kan tilføjes til den oprindelige farvning uden tab af opløsning eller lysstyrke⁴. Afhængigt af den undersøgte 3D-cellekulturmodel er en dybde på 150-200 μm muligvis ikke tilstrækkelig til at afbilde 3D-strukturen på en informativ måde, og denne clearingprotokol kan forårsage ændringer i den generelle morfologi af sfæriske, enkeltlagede organoider med store lumen⁴. Brugere bør omhyggeligt designe deres eksperiment og om nødvendigt optimere timingen af permeabiliserings- / blokeringstrinnet (for at tillade penetration af antistoffer og opløsning), clearingtrinnet (for at trænge dybere end 200 μm skal prøver ryddes fuldstændigt) og billedoptagelse. De to mest udbredte teknologier, der er tilgængelige i kernefaciliteter, ville være lysark og konfokal mikroskopi. Brugere skal omhyggeligt vælge en teknologi baseret på størrelsen af deres 3D-strukturer og deres biologiske spørgsmål¹⁰. Sammenlignet med konfokal mikroskopi forbliver lysarkmikroskopiopløsning opnået for sådanne dybe strukturer imidlertid suboptimal til opnåelse af subcellulær opløsning.

Her er der rapporteret om en detaljeret og robust proces, der er dedikeret til paraffinindlejring af enkeltprøver. Interessant nok udviklede Gabriel et al. for nylig en protokol, der indlejrede 3D-cellekulturer i paraffin med en øget gennemstrømning. De brugte en polydimethylsiloxan (PDMS) form til at begrænse 96 3D-strukturer i et mikroarray-mønster i en blok, hvilket gav nye perspektiver til undersøgelser af 3D-tumormodeller, der omfatter flere grupper, tidspunkter, behandlingsbetingelser og replikater¹¹. Denne metode kræver imidlertid omfattende færdigheder og maskiner, især til fremstilling af den forform, der bruges til at skabe PDMS-forme.

Sammenfattende beskriver dette papir to forskellige, komplementære og tilpasningsdygtige tilgange, der muliggør erhvervelse af nøjagtige og kvantitative oplysninger om arkitektonisk og cellulær sammensætning af 3D-cellulære modeller. Begge parametre er afgørende for at studere biologiske processer såsom intratumoral cellulær heterogenitet og dens rolle i resistens over for behandlinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Biopsy pad Q Path blue	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin white	VWR	720-2183
Chemical hood	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fine forceps	Pyramid innovation	R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Excellent  for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontal agitation	N-BIOTEK	NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox molds 15x15	VWR	720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panoramic scan II	3dhistech	2397612
Paraffin embedding equipment	Leica	EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Good for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,  solid, provide excellent  stress  crack  and  impact  resistance and have a  good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers  excellent  sealing  characteristics.
Set of micropipettors  (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 inverted confocal microscope	Leica	LSM780
Tissue cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscope	Leica	SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylin type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	CAUTION: Suspected of causing genetic defects.  Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffin Wax tek III	Sakura	4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	CAUTION: Triton X­100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution	Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution	To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.
Permeabilisation-blocking solution (PB solution)	The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X  (1:10) solution	PB:PBS-1X  (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software	Indicalabs	NM 87114
Harmony software	PerkinElmer	HH17000010