تلطيخ وتصوير عالي الدقة لنماذج عضوية وكروية ثلاثية الأبعاد

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لأداء التصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الثابتة التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات ، مما يتيح تصور مورفولوجيتها وتكوينها من نوع الخلية وتفاعلاتها.

Abstract

تعد نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر ، مثل الكائنات العضوية والكروية ، أدوات قيمة للعديد من التطبيقات بما في ذلك التطوير ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والطب التجديدي. لاستغلال هذه النماذج بشكل كامل ، من الأهمية بمكان دراستها على المستويين الخلوي ودون الخلوي. ومع ذلك ، فإن توصيف نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر يمكن أن يكون تحديا تقنيا ويتطلب خبرة محددة لإجراء تحليلات فعالة. هنا ، تقدم هذه الورقة بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لأداء التصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج زراعة الخلايا 3D الثابتة في المختبر والتي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. تنطبق هذه البروتوكولات على مجموعة واسعة من المواد العضوية والكروية التي تختلف في خلاياها الأصلية ومورفولوجيتها وظروف الثقافة. من حصاد هيكل 3D إلى تحليل الصور ، يمكن إكمال هذه البروتوكولات في غضون 4-5 أيام. باختصار ، يتم جمع الهياكل ثلاثية الأبعاد وتثبيتها ، ويمكن بعد ذلك معالجتها إما من خلال تضمين البارافين والتلوين النسيجي / المناعي الكيميائي ، أو مباشرة مناعية وإعدادها للمقاصة البصرية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (عمق 200 ميكرومتر) بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.

Introduction

على مدى العقود الماضية ، بشر التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية وتقنيات زراعة 3D في المختبر بثورة في علم الأحياء والطب. أصبحت نماذج الخلايا عالية التعقيد في 3D شائعة جدا لأنها تسمح للخلايا بالنمو والتفاعل مع إطار خارج الخلية المحيط ، مما يلخص عن كثب جوانب الأنسجة الحية بما في ذلك هندستها المعمارية وتنظيم الخلايا وتفاعلاتها ، أو حتى خصائص الانتشار. على هذا النحو ، يمكن أن توفر نماذج زراعة الخلايا 3D رؤى فريدة حول سلوك الخلايا في الأنسجة النامية أو المريضة في المختبر. العضويات والكروية كلاهما هياكل ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا ، تتراوح من عدة ميكرومتر إلى ملليمترات ، وهي الأبرز في الهياكل ثلاثية الأبعاد في المختبر. يمكن استزراع كلاهما داخل سقالة داعمة بما في ذلك (i) الهلاميات المائية المشتقة من الحيوانات (مستخلص الغشاء القاعدي ، الكولاجين) ، النباتات (الجينات / الأغاروز) ، أو توليفها من المواد الكيميائية ، أو (ii) المصفوفات الخاملة التي تحتوي على مسام لتعزيز تكاثر الخلايا ونموها.

يمكن أن تتطور الكائنات العضوية والكروية أيضا دون وجود سقالة داعمة من خلال الاعتماد على الخلايا للتجميع الذاتي في مجموعات. يعتمد هذا على تقنيات مختلفة مثل استخدام مواد غير لاصقة لمنع ارتباط الخلية والتوتر السطحي وقوة الجاذبية (على سبيل المثال ، تقنيات الإسقاط المعلق) ، أو الدوران الدائري المستمر للأوعية (على سبيل المثال ، ثقافة الغزل). في جميع الحالات ، تسهل هذه التقنيات تفاعلات الخلية الخلوية ومصفوفة الخلية للتغلب على قيود ثقافة الخلايا أحادية الطبقة التقليدية¹. تم استخدام المصطلحين "organoids" و "spheroids" بالتبادل في الماضي ، ولكن هناك اختلافات رئيسية بين هذين النموذجين لثقافة الخلايا 3D. الكائنات العضوية هي مجموعات خلوية 3D في المختبر مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة ، حيث تنظم الخلايا نفسها تلقائيا في أسلاف وأنواع خلايا متمايزة والتي تلخص على الأقل بعض وظائف الجهاز محل الاهتمام². تشتمل الأجسام الكروية على مجموعة واسعة من الهياكل ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا التي تشكلت في ظل ظروف غير ملتصقة ويمكن أن تنشأ من مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا مثل خطوط الخلايا الخالدة أو الخلايا الأولية³. ومن ثم ، فإن الكائنات العضوية المتأصلة في أصول الخلايا الجذعية الجوهرية لها ميل أعلى للتجميع الذاتي والجدوى والاستقرار من الأجسام الكروية.

ومع ذلك ، في جوهرها ، هذان النموذجان عبارة عن هياكل 3D تتكون من خلايا متعددة ، وبالتالي فإن التقنيات التي تم تطويرها لدراستها متشابهة جدا. على سبيل المثال ، تعد أساليب التصوير القوية على مستوى دقة الخلية الواحدة ضرورية للتحقق من التعقيد الخلوي لكل من المواد العضوية والكروية. هنا ، من خلال تلخيص خبرة هذه المجموعة وخبرة القادة في مجال العضويات⁴ ، تصف هذه الورقة الإجراءات التفصيلية لأداء تلطيخ ثنائي الأبعاد (2D) و 3D بالكامل ، والتصوير ، وتحليل التركيب الخلوي ودون الخلوي والتنظيم المكاني للعضويات والكروية التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. في الواقع ، يقدم هذا الإجراء نوعين مختلفين ومتكاملين من التلوين واكتساب التصوير لتحليل مجموعة كبيرة ومتنوعة من أحجام وأنواع نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر. يعتمد استخدام أحدهما (تحليل 3D بالكامل) أو الآخر (تحليل قسم 2D) على النموذج المدروس والإجابات المطلوبة. يمكن تطبيق التحليل الكامل ثلاثي الأبعاد بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، على سبيل المثال ، لتصور الخلايا في ثقافة ثلاثية الأبعاد يصل عمقها إلى 200 ميكرومتر ، بغض النظر عن الحجم الكلي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، في حين أن تحليل أقسام ثنائية الأبعاد يوفر نظرة ثاقبة للعينات من أي حجم ، وإن كان ذلك على مستوى 2D. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح عبر مجموعة متنوعة من المواد العضوية⁴،⁵ والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا البشرية والفئران ^، والتي نشأت من طبقات جرثومية جنينية مختلفة. تظهر نظرة عامة على الإجراء في الشكل 1. يشار إلى المراحل الرئيسية والعلاقات بينها والخطوات الحاسمة والتوقيت المتوقع.

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء. يتم جمع نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر وتثبيتها ، ثم يتم إعدادها إما لتلطيخ التركيب الكامل ثلاثي الأبعاد (الخيار أ) أو تضمينها في البارافين للتقسيم والتلوين ثنائي الأبعاد (الخيار ب). بالنسبة لتجارب التلوين ثلاثية الأبعاد ، يتم تصنيف الهياكل ثلاثية الأبعاد الثابتة باتباع خطوة التثبيت. يمكن تنفيذ خطوة اختيارية للمسح البصري لتحسين جودة التصوير وعمق الفحص المجهري الضوئي عن طريق تقليل تشتت الضوء أثناء معالجة الصور. يتم التقاط الصور على مجهر متحد البؤر مقلوب أو نظام محتوى عالي متحد البؤر وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب. بالنسبة لتضمين البارافين ، تتم معالجة الهياكل ثلاثية الأبعاد مباشرة (الخيار b.1 للهياكل الكبيرة ≥ 400 ميكرومتر) أو تضمينها في هلام (b.2 ؛ هياكل صغيرة ≤ 400 ميكرومتر) للجفاف وتضمين البارافين. ثم يتم قطع كتل البارافين وتلطيخها (تلطيخ نسيجي أو كيميائي مناعي). يتم الحصول على صور لأقسام 2D على ماسح ضوئي رقمي للشرائح أو مجهر مستقيم ويتم تحليلها على منصة تحليل الصور باستخدام التحليل الكمي الرقمي السريع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

ملاحظة: يجب توقع خسارة ≤25٪ من العدد الأولي لهياكل 3D أثناء الخطوات التي تنطوي على تغييرات الكاشف والغسيل في الإجراء التالي. خطط لاستخدام عدد نهائي لا يقل عن عشرة هياكل ثلاثية الأبعاد ، بحجم يتراوح من 100 إلى 500 ميكرومتر ، لكل حالة تم اختبارها لإجراء تحليلات نوعية وكمية للصور. إذا لزم الأمر ، بالنسبة للهياكل الأكبر حجما ، قم بقطع أطراف ماصة سعة 1 مل لتجنب كسر الهياكل. بالنسبة لجميع الخطوات ، إذا كان ترسيب الهيكل ثلاثي الأبعاد طويلا جدا ، فيمكن تدوير الخلايا برفق عند 50 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). اعتمادا على المشكلة التي تم التحقيق فيها ، ينبغي النظر في مزايا / عيوب مثل هذه الخطوة الغزل ، لأن الطرد المركزي يمكن أن يضر بشكل هياكل 3D. تجنب الدوران عند >100 × جم.

1. جمع وتثبيت نماذج زراعة الخلايا 3D

ملاحظة: احرص على عدم استنشاق هياكل 3D ، والتي سيتم ربطها بشكل فضفاض فقط بجدار الأنبوب.

1. حصاد نماذج زراعة الخلايا 3D المضمنة في مصفوفة
   ملاحظة: يصف هذا القسم استعادة هياكل 3D نمت في قطرات من مستخلص الغشاء القاعدي من ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm (BME) ، ولكن يمكن تكييفها مع مصفوفات أخرى. انظر المناقشة لمعرفة النقاط الحاسمة المتعلقة ب ECM.
   1. إزالة وسط الاستزراع من الآبار دون تعطيل مصفوفة 3D. قم بتغطية الجزء الداخلي والخارجي من طرف ماصة سعة 1 مل بالبروتين (يسمى طرف 1 مل المطلي مسبقا فيما بعد) عن طريق غمس الطول الكامل للطرف في ألبومين مصل البقر بنسبة 0.1٪ (BSA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (يسمى محلول PBS-BSA 0.1٪ فيما بعد) وسحب 1 مل من هذا المحلول لأعلى ولأسفل مرتين.
      ملاحظة: سيمنع هذا الطلاء المسبق الخلايا من الالتصاق بالطرف ويقلل من أي خسارة.
   2. قم بطلاء الجزء الداخلي من أنبوب الطرد المركزي (15 مل) بالبروتين (يسمى أنبوب الطرد المركزي المطلي مسبقا فيما بعد) عن طريق ملء محلول PBS-BSA 0.1٪ بشكل متكرر وإفراغ الأنبوب.
      ملاحظة: هذا سيمنع الخلايا من الالتصاق بالأنبوب ويقلل من أي خسارة.
   3. باستخدام طرف 1 مل المطلي مسبقا ، أعد تعليق الهياكل ثلاثية الأبعاد للبئر بعناية باستخدام 1 مل من الثلج البارد 1x PBS ، وانقل برفق التعليق الذي يحتوي على الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى أنبوب الطرد المركزي المطلي مسبقا.
   4. أضف برفق 13 مل من الثلج البارد 1x PBS ، واترك الهياكل ثلاثية الأبعاد تترسب على الجليد لمدة 10 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بالدوران لمدة 5 دقائق عند 50 × جم عند 4 درجات مئوية. تجنب الدوران >100 × جم ، لأن هذا سيضر بشكل هياكل 3D.
   5. إزالة طاف . باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا ، أعد تعليق الهياكل ثلاثية الأبعاد برفق في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x بارد. كرر الخطوات من 1.1.4 إلى 1.1.5 للحصول على حبيبات متجانسة بدون أي بقايا مصفوفة ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: تتأثر إزالة المصفوفة الفعالة بنوع المصفوفة وعدد وحجم هياكل 3D وتتطلب تحسينا لظروف الثقافة المختلفة. بالنسبة للهياكل ثلاثية الأبعاد المزروعة في BME ، يستغرق الاسترداد من إزالة المصفوفة عادة 45-60 دقيقة.
   6. باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا ، انقل تعليق 1 مل 1x PBS الذي يحتوي على الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى أنبوب طرد مركزي مطلي مسبقا سعة 1.5 مل ، وتابع القسم 1.3.
2. حصاد نماذج ثقافة الخلايا العائمة 3D
   1. باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا ، قم بجمع ونقل الهياكل ثلاثية الأبعاد بعناية إلى أنبوب طرد مركزي مطلي مسبقا سعة 1.5 مل. اسمح للهياكل ثلاثية الأبعاد بالرواسب ، أو تدور لمدة 5 دقائق عند 50 × جم عند RT.
   2. إزالة طاف . باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا ، أعد تعليق الهياكل ثلاثية الأبعاد في 1 مل من 1x PBS. تابع القسم 1.3.
3. تثبيت نماذج زراعة الخلايا 3D
   1. السماح للهياكل 3D إلى الرواسب. إزالة بعناية طاف ؛ تحت غطاء الدخان ، أعد تعليق الهياكل ثلاثية الأبعاد برفق في 1 مل من الفورمالين باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا.
      ملاحظة: يحتوي الفورمالين على الفورمالديهايد ، وهو أمر خطير. التلاعب بالمادة الكيميائية في غطاء كيميائي. ارتد قفازات مطاطية ونظارات واقية للعين.
   2. احتضان الهياكل ثلاثية الأبعاد لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظة: مطلوب خطوة تثبيت لمدة 30 دقيقة مع الفورمالين للتلطيخ المناعي لمجموعة واسعة من الهياكل ثلاثية الأبعاد (متفاوتة في الحجم والشكل والأصل). ومع ذلك ، بشكل عام ، فإن أوقات التثبيت الأطول (>3 ساعات) مناسبة بشكل أفضل للحفاظ على مضان بروتينات المراسل.
   3. اسمح للهياكل ثلاثية الأبعاد بالرواسب ، أو تدور لمدة 5 دقائق عند 50 × جم في RT. قم بإزالة الفورمالين برفق ، واستبدله ب 1 مل من 1x PBS. كرر خطوة الغسيل هذه في 1x PBS مرتين. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية ، وتابع القسم 2 أو القسم 3.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن الحفاظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأجل (>1 سنة).

2.3D تلطيخ جبل كامل ، والتصوير ، وتحليل نماذج ثقافة الخلية 3D

ملاحظة: نظرا لأن المواد العضوية متصلة بشكل غير محكم بجدار الأنبوب ، تعامل معها برفق لأن جميع تغييرات الكاشف التالية يمكن أن تسبب فقدان العينة. قبل البدء ، تأكد من توفر عناصر التحكم الصحيحة للتلطيخ. يمكن أن تكون الضوابط الإيجابية والسلبية عبارة عن خلايا ، حيث من المعروف أن البروتين محل الاهتمام إما مفرط التعبير أو غائب ، على التوالي. احتضان العينات بدون الجسم المضاد الأساسي لتحديد ما إذا كانت الإشارة المرصودة ناتجة عن ارتباط غير محدد للجسم المضاد الثانوي. نظرا لأن بعض الخلايا تميل إلى إظهار مستويات عالية من التألق الذاتي ، استخدم عناصر تحكم خالية من الأجسام المضادة الثانوية لتحديد ما إذا كان التألق المرصود قادما من التألق الذاتي في الخلفية. يمكن الجمع بين وضع العلامات المناعية وتصور المراسل الفلوري.

1. 3D تلطيخ جبل كامل
   1. قم بإعداد محلول منع النفاذية (PB) عن طريق استكمال 1x PBS ب 0.1٪ -1٪ من الفاعل بالسطح غير الأيوني (انظر جدول المواد) ، 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، 1٪ BSA ، و 1٪ مصل حمار (أو من الحيوان الذي أثيرت فيه الأجسام المضادة الثانوية).
      ملاحظة: قم بتحسين تركيز الفاعل بالسطح غير الأيوني بعناية اعتمادا على توطين الهدف: الغشاء (0-0.5٪) ، السيتوبلازم (0.5-1٪) ، والنواة (1٪). يمكن تخزين هذا الحل في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر. عادة ما يعمل BSA بشكل جيد لخطوة الحجب ، ولكن في حالة الضوضاء العالية في الخلفية ، قم بإجراء اختبار تجريبي للحصول على أفضل النتائج الممكنة لمجموعة معينة من الأجسام المضادة.
   2. انقل المواد العضوية من أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل إلى أنبوب سعة 0.5 مل باستخدام طرف سعة 1 مل مطلي مسبقا. دع الرواسب العضوية ، قم بإزالة 1x PBS برفق ، واستبدلها ب 0.5 مل من محلول PB. احتضان المواد العضوية مع التحريض الأفقي اللطيف (30-50 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة في RT.
   3. دع الرواسب العضوية ، وقم بإزالة محلول PB برفق ، واغسلها مرتين في 1 مل PBS-BSA 0.1٪ لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: الانتظار لمدة 3 دقائق يسمح للهياكل بالترسب في قاع الأنبوب.
   4. قم بإزالة PBS-BSA 0.1٪ برفق ، وأضف 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف بالتركيز المناسب في محلول PB: 1x PBS (1:10). لتحضير 10 مل من محلول PB: 1x PBS (1:10) ، قم بتخفيف 1 مل من محلول PB في 9 مل من 1x PBS. احتضان لمدة 2-3 أيام مع التحريض الأفقي اللطيف (30-50 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يعد وقت حضانة الأجسام المضادة المناسب أمرا بالغ الأهمية لاختراق الأجسام المضادة المناسبة حيث يمكن أن تصل هياكل 3D في بعض الأحيان إلى أحجام كبيرة.
   5. دع الرواسب العضوية ، وقم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي برفق. اغسل 5x في PBS-BSA 0.1٪ لمدة 3 دقائق لكل غسلة ثم 2x في 1 مل PBS-BSA 0.1٪ لمدة 15 دقيقة لكل غسلة مع تحريك أفقي لطيف.
   6. أضف 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف عند 1: 250 في محلول PB: 1x PBS (1:10). احتضن لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع تحريك أفقي لطيف (30-50 دورة في الدقيقة). في هذه الخطوة ، قم بحماية العينات من الضوء.
   7. أضف 250 ميكرولتر من Hoechst 33342 (محلول مخزون 20 ميكرومتر) مخفف عند 1: 1000 في محلول PB: 1x PBS (1:10) ، واحتضان لمدة 2 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية مع تحريض أفقي لطيف (30-50 دورة في الدقيقة).
   8. دع الرواسب العضوية ، وقم بإزالة المحلول الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي + Hoechst 33342 برفق. اغسل المواد العضوية 5x في 1 مل من 1x PBS لمدة 3 دقائق لكل غسلة ثم 2x في 1 مل من 1x PBS لمدة 15 دقيقة لكل غسلة مع تحريض أفقي لطيف (30-50 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: من الضروري غسل العينات على نطاق واسع لتجنب ضوضاء الخلفية أو فقدان الإشارة.
   9. قم بتخزين العينات في PBS عند 4 درجات مئوية حتى الحصول على الصورة. تابع القسم 2.2.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر ، محمية من الضوء.
2. تحضير العينة للتصوير متحد البؤر
   1. باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا ، انقل المواد العضوية بعناية إلى 50 ميكرولتر من 1x PBS لكل بئر في صفيحة دقيقة من البوليسترين الأسود 96 بئرا. تابع الخطوة 2.2.3 أو القسم 2.3.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن حماية العينة من الضوء وتخزينها عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
   2. مسح
      ملاحظة: خطوة المقاصة اختيارية ويمكن استخدامها إما للعضويات المناعية أو للكشف عن التألق الداخلي. يمكن أن تتسبب المقاصة في انكماش بنية 3D ، ولكنها لا تغير التشكل العام باستثناء المواد العضوية الكروية أحادية الطبقات ذات اللومن الكبير⁴. بالنسبة لهذه الكائنات العضوية الكيسية ، تخطي خطوة المقاصة ، وقم بإجراء تصوير الأنسجة العميقة⁶.
      1. تحضير محلول إزالة الجلسرين والفركتوز 2.5 م يحتوي على 50٪ فولت / فولت من الجلسرين ، و 11٪ فولت / فولت من الماء المقطر ، و 45٪ وزن / فولت من الفركتوز عن طريق الخلط على محرك مغناطيسي طوال الليل على الأقل حتى يصبح المحلول قابلا للذوبان ومتجانسا تماما. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 شهر.
      2. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من 1x PBS دون لمس المواد العضوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول المقاصة باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل بعد إزالة الطرف ، وأعد التعليق برفق لمنع تكوين الفقاعات. احتضان في RT لمدة 12 ساعة على الأقل ، والمضي قدما في القسم 3.
         ملاحظة: نظرا لأن محلول المقاصة لزج ، يصعب التعامل مع الأحجام الصغيرة. لتسهيل المناولة ، تأكد من أن الحل في RT ، والماصة ببطء. للحصول على التطهير الأمثل ، اترك العينة تترسب في محلول المقاصة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير. إذا كانت الهياكل ثلاثية الأبعاد تطفو في وقت الاستحواذ ، فقم بإجراء دوران اختياري لمدة 10 دقائق عند <100 × جم في RT ، أو اترك مزيدا من الوقت (من يوم إلى عدة أيام) للسماح لها بالترسب. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة قبل المتابعة إلى التصوير إذا كان محميا من الضوء وتخزينه عند 4 درجات مئوية (لأسابيع) أو -20 درجة مئوية (لعدة أشهر).
3. الحصول على الصور وتحليلها
   ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى تقنية تقسيم الصور لتصوير هياكل 3D.
   1. استخدم المجاهر متحدة البؤر ، وفضل أهداف الانغماس ذات الفتحة العددية الأعلى (NA) مقارنة بالهواء. اختر أهداف التكبير (10x ، 20x ، 40x) وفقا لحجم الهياكل ثلاثية الأبعاد ، وإعادة بناء الصورة (خياطة) ، والحلول المستخدمة للتحليل.
   2. عند اختيار وضع الاستحواذ ، ضع في اعتبارك عمق تركيز الهدف المستخدم لتحديد خطوة تكديس Z ؛ السماح لتقديم 3D الأمثل.
      ملاحظة: تختلف حلول تحليل الصور، وسيلزم تعديل التحليل وفقا للبرنامج المستخدم. على سبيل المثال ، تم إنشاء بروتوكول التحليل هذا على برنامج تحليل عالي المحتوى (انظر جدول المواد والشكل التكميلي 1 للحصول على التفاصيل) ويوفر بيانات حول تجزئة الكائن وحساب الخصائص واختيار سكان الخلية داخل كائن 3D معاد بناؤه.

3. تقسيم 2D ، تلطيخ ، تصوير ، وتحليل نماذج ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: نماذج زراعة الخلايا 3D تختلف في الحجم. تابع القسم 3.1 أو 3.2 لتضمين البارافين بكفاءة (الشكل 2). اترك وقتا كافيا لترسيب هيكل 3D قبل أي تغييرات في الغسيل والكاشف. احرص على عدم استنشاق المواد العضوية التي ستطفو في قاع الأنبوب. لتضمين البارافين، راجع الشكل 2 للحصول على إرشادات.

1. تضمين البارافين لنماذج زراعة الخلايا 3D الكبيرة (Ø ≥ 400 ميكرومتر)
   1. في اليوم السابق للتضمين ، قم بتسخين قارورتين سعة 150 مل مملوءتين بالبارافين (حمامات البارافين) ، وقالب تضمين معدني صغير لكل عينة ، وملقط ناعم إلى 65 درجة مئوية.
   2. باستخدام طرف 1 مل مطلي مسبقا ، انقل المواد العضوية بعناية في 1x PBS إلى أنبوب زجاجي مسطح القاع مع غطاء زجاجة مبطن ببولي تترافلورو إيثيلين. دع الرواسب العضوية ، قم بإزالة 1x PBS بعناية ، واستبدلها بنسبة 70٪ من الإيثانول. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   3. دع الرواسب العضوية ، وقم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ بعناية. استبدله ب 1 مل من محلول eosin Y الجاهز للاستخدام. حرك الأنبوب وصمخه لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بإزالة محلول eosin بعناية ، وقم بتجفيف المواد العضوية في ثلاث غسلات متتالية مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة ~ 30 دقيقة لكل منهما.
      ملاحظة: الإيثانول ، وهو سائل قابل للاشتعال ومتقلب ، يسبب تهيجا شديدا في العين والجهاز التنفسي. التلاعب بها في غطاء الدخان ، وارتداء نظارات واقية للعين.
   4. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 100٪ بعناية ، وتحت غطاء كيميائي ، قم بإزالة المواد العضوية في 3 غسلات متتالية مع 1 مل من الزيلين لمدة ~ 30 دقيقة لكل منهما.
      ملاحظة: الزيلين مادة سامة سائلة قابلة للاشتعال قد تسبب أبخرتها تهيجا. التلاعب بها في غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد مباشرة ، وارتداء قفازات مطاطية ونظارات واقية للعين.
   5. تحت غطاء كيميائي ، قم بإعداد شريط نسيج أبيض microtwin عن طريق وضع قطعة من وسادة الخزعة (غارقة سابقا في الزيلين) داخل إحدى مقصورات الكاسيت. انقل الهياكل ثلاثية الأبعاد بعناية باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مغلفة مسبقا سعة 2 مل إلى وسادة الخزعة. قم بتغطيتها بوسادة خزعة أخرى مبللة بالزيلين لمنع الكائنات العضوية من الحركة ، وأغلق الكاسيت.
   6. إذا تمت معالجة عدة عينات ، ضع الكاسيت في حمام زيلين في انتظار مزيد من المعالجة. بمجرد نقل جميع العينات إلى أشرطة ، ضع الكاسيت في حمام بارافين مسبق التسخين لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. انقل الكاسيت إلى حمام بارافين طازج قبل التسخين طوال الليل.
   7. بعد تشريب البارافين ، خذ قالب تضمين مسبق التسخين ، وأضف البارافين الساخن إليه. ضع وسادة الخزعة التي تحتوي على هياكل 3D في القالب ، وقم بتحريكها برفق حتى تسقط جميع الكائنات العضوية إلى قاع القالب. بعناية فائقة ضع هياكل 3D في وسط القالب باستخدام ملقط ناعم prewarmed. تابع القسم 3.3.
      ملاحظة: احرص على عدم تعطيل هياكل 3D بالملقط. ادفع ، لكن لا تقرصهم.
2. تضمين البارافين لنماذج زراعة الخلايا 3D الصغيرة (Ø ≤ 400 ميكرومتر)
   1. في اليوم السابق للتضمين ، قم بتسخين قارورتين سعة 150 مل مملوءتين بالبارافين (حمامات البارافين) ، وقالب تضمين معدني صغير لكل عينة ، وملقط ناعم إلى 65 درجة مئوية.
   2. قم بإزالة برنامج تلفزيوني 1x بعناية من التعليق العضوي. قم بإجراء 3 غسلات برفق في 1 مل من 1x محلول ملحي مخزن ب Tris (TBS). قم بإزالة أكبر قدر ممكن من 1x TBS دون لمس الكائنات العضوية.
      ملاحظة: احرص على عدم استنشاق العينة. إذا لزم الأمر ، قم بإجراء دوران لمدة 5 دقائق عند 50 × جم في RT. سوف تتداخل الآثار المتبقية من الفوسفات مع الخطوات التالية ، ولا سيما منع بلمرة الهلام. لذلك ، لا تستخدم حلول PBS أثناء أي خطوة معالجة. في هذه الخطوة ، تم استخدام مجموعة تجارية تحتوي على أشرطة ، وكاشف # 1 (سائل صاف) ، وكاشف # 2 (سائل ملون) ، لتسهيل الإجراء المضمن بالبارافين دون احتمال فقدان شظايا صغيرة (انظر جدول المواد). اتبع تعليمات المجموعة. يتم تجميع الكاسيتات مسبقا بأوراق دعم وإدخالات لوحة في مكانها بالفعل.
   3. أضف قطرتين من الكاشف # 2 في الأنبوب ، واخلطه برفق عن طريق النقر على الأنبوب. أضف قطرتين من الكاشف # 1 ، واخلطه مرة أخرى عن طريق النقر لجعل الجل يصلب. باستخدام الملقط الناعم ، قم بإزالة الجل من الأنبوب ، وضعه في بئر الكاسيت.
   4. تحت غطاء الدخان ، قم بتجفيف العينة عن طريق وضع الكاسيت في حمامات متتالية على النحو التالي (استخدم قوارير 150 مل ، واستخدم الإيثانول الطازج أو الزيلين لكل حمام): الإيثانول 70٪ ، 30 دقيقة ؛ الإيثانول 96 ٪ ، 30 دقيقة ؛ الإيثانول 100 ٪ ، ثلاث غسلات ، 30 دقيقة لكل منهما ؛ زيلين ، ثلاث غسلات ، 30 دقيقة لكل منهما.
   5. ضع الكاسيت في حمام بارافين مسبق التسخين لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، وانقلها إلى حمام بارافين طازج قبل التسخين طوال الليل. بعد تشريب البارافين ، خذ قالب تضمين مسبق التسخين ، وأضف البارافين الساخن إليه. افتح الكاسيت ، وقم بإزاحة الجل بعناية باستخدام ملقط دقيق ، وضع الجل الذي يحتوي على هياكل 3D في وسط قالب التضمين. تابع القسم 3.3.
3. الخطوات الشائعة لتضمين البارافين
   1. انقل القالب برفق إلى منطقة باردة للسماح للبارافين بالتصلب في طبقة رقيقة ، مما سيحافظ على هياكل 3D في الموضع المناسب. أضف علبة مناديل أعلى القالب ، وأضف البارافين الساخن لتغطية هذا الكاسيت البلاستيكي. قم بإزالة القالب بمجرد أن يتجمد تماما ، وتابع القسم 3.4.
      ملاحظة: يمكن تخزين كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة لسنوات.

الشكل 2: نظرة عامة على إجراءات تضمين البارافين لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الكبيرة والصغيرة في المختبر.
(أ) الإجراء القياسي لتضمين البارافين. بعد التثبيت والجفاف ، يتم تلطيخ هياكل 3D مع eosin لتسهيل تصورها (أعلى وأسفل اليسار). يتم وضع هياكل 3D بعناية على وسادة الخزعة (الأزرق) في الكاسيت باستخدام ماصة باستور 2 مل (وسط). بعد تشريب البارافين ، يتم إسقاط هياكل 3D بلطف في البارافين السائل باستخدام ملقط ويتم تحريكها بلطف في وسادة الخزعة. يتم فقد هياكل 3D الصغيرة خلال هذه الخطوة حيث لا يمكن تحريرها من اللوحة (أسفل اليمين: فشل التضمين). سيتم تضمين هياكل 3D الكبيرة فقط (أعلى اليمين: التضمين الناجح). تشير رؤوس الأسهم إلى ثقافات 3D. (ب) بديل لبروتوكول تضمين البارافين القياسي. بعد إصلاح هياكل 3D الصغيرة ، يتم استخدام مجموعة تجارية للحفاظ على الخلايا في هلام وتسهيل نقلها إلى القالب بعد تشريب البارافين (يمين: التضمين الناجح). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. كتلة التقسيم وتلطيخ
   1. قطع أقسام 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم قياسي ، وتنفيذ التقنيات النسيجية والكيميائية المناعية القياسية. تابع القسم 3.5.
      ملاحظة: تم استخدام شرائح محددة (انظر جدول المواد) لتحسين التصاق الأقسام. يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية لسنوات.
5. الحصول على الصور وتحليلها
   1. قم بإجراء التصوير باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح أو مجهر مستقيم ، وقم بتحليل البيانات باستخدام منصة للتحليل الكمي الرقمي السريع الذي يبلغ عن بيانات التعبير المورفولوجية والمتعددة على أساس كل خلية على حدة عبر أقسام بنية 3D بأكملها (انظر الشكل التكميلي 2 للحصول على التفاصيل).
      ملاحظة: يتم استخدام الهدف 20x بشكل روتيني من قبل هذه المجموعة.

Representative Results

يوفر هذا البروتوكول نظرة عامة على الخطوات الحاسمة للتلطيخ الكامل 2D و 3D ، بالإضافة إلى التصوير والتحليلات الكمية لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (الشكل 3 والشكل 4). وهو قابل للتطبيق على مجموعة واسعة من نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد - من الأجسام الكروية إلى الكائنات العضوية من أنواع أو أنسجة مضيفة مختلفة - ويتيح الحصول على معلومات دقيقة وكمية عن الهندسة المعمارية وتنظيم الخلايا والتفاعلات على المستويات الخلوية ودون الخلوية (الشكل 3 والشكل 4). قد تحتاج المختبرات إلى تحسين التقنيات النسيجية والكيميائية المناعية 2D وتركيزات الأجسام المضادة وفقا لاحتياجاتها الخاصة.

كلتا الطريقتين تسفر عن معلومات بيولوجية قيمة. يوفر التلوين الكامل ثلاثي الأبعاد والفحص المجهري متحد البؤر معلومات مرئية عن التركيب الخلوي والموقع المكاني مع مجال عمق يصل إلى 200 ميكرومتر (الشكل 3B). ومع ذلك ، فإن التقسيم 2D مناسب للهياكل ثلاثية الأبعاد الأكبر حجما للكشف عن السمات المورفولوجية الخلوية التفصيلية في القسم بأكمله من الهياكل ثلاثية الأبعاد التي قد يكون من الصعب ملاحظتها في الموقع بسبب تشتت الضوء الذي يضر بالدقة في عينات أكبر. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر كلتا التقنيتين بيانات كمية. في الواقع ، تسمح الدقة التي تم الحصول عليها بتطبيق خوارزميات التجزئة الخلوية ودون الخلوية لتحديد عدد الخلايا والكشف عن وجود علامات خلوية مختلفة في أنواع فرعية خلوية مختلفة (الشكل 3F والشكل 4). باختصار ، تقنيات التصوير الموصوفة هنا قابلة للتكرار وبسيطة ومتكاملة وتمثل أدوات قيمة لدراسة عدم التجانس الخلوي.

الشكل 3: النتائج التمثيلية للتركيب الكامل ثلاثي الأبعاد والتصوير والتحليلات للأقسام البصرية ثلاثية الأبعاد و 2 دي . (أ) صور متحدة البؤر للإنسان (ح) ورم دبقي كروي عالي الدرجة مستزرع لمدة أسبوع وموسوم ب Hoechst (أزرق) و Olig2 (أصفر) وأكتين (أحمر) (هدف مائي 20x). بالنسبة لجميع الصور التي تم الحصول عليها ، تم إنشاء إعدادات المجهر باستخدام عنصر تحكم إيجابي (أعلى) ، ثم تم تصوير عنصر التحكم السلبي باستخدام إعدادات متطابقة للتحكم في نقص التألق في غياب الجسم المضاد الأساسي (أسفل). (ب) تمثيل متعامد 3D كامل التركيب لتلطيخ Ki67 يتم إجراؤه في (ح) الورم الدبقي الكروي عالي الجودة المزروع لمدة أسبوع (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ هدف 20x مائي ، بؤري). (ج) صور متحدة البؤر ل (ح) الورم الدبقي عالي الدرجة الكروي المزروع لمدة أسبوع والموسومة ب Hoechst (أزرق) ، Olig2 (أصفر) ، و Phalloidine-488 (أخضر) (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ هدف مائي 20x). (د) صور متحدة البؤر للأورام الكروية البشرية (ح) العضلية المخططة (أعلى) والفأر (م) خلية القمة العصبية (أسفل) المستزرعة لمدة أسبوع والموسومة ب Hoechst (الأزرق) والأكتين (الأحمر) و Ki67 (الأخضر) ، على التوالي (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ 20x الهدف الجاف). (ه) صور متحدة البؤر ل (ح) ورم دبقي كروي عالي الدرجة مستزرع لمدة أسبوع وموسوم ب Hoechst (أزرق) و Ki67 (أخضر) (إزالة الجلسرين والفركتوز ؛ هدف الماء 40x) (أعلى اليسار). تم إنشاء صور مجزأة على قناة Hoechst والمناطق النووية الإيجابية Ki67 (+) على القناة الخضراء باستخدام برنامج تحليل عالي المحتوى (انظر الشكل التكميلي 1 وجدول المواد) (أسفل). الناتج المعطى هو النسبة المئوية لنوى Ki67 ⁺ لكل بنية 3D مجزأة (أعلى اليمين). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: النتائج التمثيلية لتصوير وتحليل المقاطع البصرية ثنائية الأبعاد. (أ ، د) صور مقطع 2D لنموذج خلية ثلاثية الأبعاد (ساركوما عضلية مخططة بشرية مستزرعة لمدة شهر) تم الحصول عليها باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح وتحليلها على منصة للتحليل الكمي الرقمي السريع. (أ) تلطيخ H&E والكشف عن الخلايا حسب حجمها. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (B) يظهر الرسم البياني النسبة المئوية للخلايا < 100 ميكرومتر 2 و > 100 ميكرومتر² المكتشفة باستخدام برنامج للتحليل الكمي الرقمي السريع (يسار: Halo) أو العد اليدوي (يمين: MC). (C) تلطيخ Ki67 والكشف عن الخلايا وفقا لشدة إشارة 3،3'-diaminobenzidine (DAB). سلبي (أزرق) ، إيجابي ضعيف (أصفر) ، إيجابي (أحمر). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (D) يظهر الرسم البياني النسبة المئوية للخلايا السالبة Ki67 والإيجابية الضعيفة والموجبة. الاختصارات: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. MC = العد اليدوي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: نظرة عامة على الخطوات في برنامج تحليل التصوير. تستند التحليلات إلى ارتباط اللبنات الأساسية. كل لبنة بناء تتوافق مع تجزئة الوظيفة ، والحساب ، والارتباط ، وتعريف الإخراج - وتقدم خوارزميات متعددة واختيارات متغيرة لمطابقة العينة البيولوجية التي يتم تصويرها. يوفر البرنامج بروتوكولات تحليل RMS (الحل الجاهز) المتعددة التي يمكن استخدامها وتعديلها بسهولة. يمكن حفظ بروتوكولات تحليل الصور المتكاملة وتطبيقها على مجموعات بيانات مختلفة ومشاركتها بين المستخدمين. باختصار ، يتضمن بروتوكول التحليل تجزئة الكائنات المتسلسلة: كروية ، نوى وأخيرا ، جيوب Ki67 (A488). بعد ذلك ، يتم حساب متوسط شدة جيوب Ki67 لزيادة التمييز بين الأحداث الإيجابية. أخيرا ، يتم اختيار النوى التي تشمل جيوب Ki67 الإيجابية بشكل إيجابي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: نظرة عامة على خطوات إجراء برنامج التحليل الكمي. الخطوة 1. قم بتحميل الملفات باستخدام علامة التبويب دراسات . سيتم فتح الملفات في قسم إجراءات الصورة . الخطوة 2. افتح علامة التبويب التعليقات التوضيحية ، ثم انقر فوق إجراءات الطبقة لتصميم طبقة جديدة في جميع أنحاء الهيكل باستخدام أداة الدائرة لشريط الأدوات. بالنسبة للهياكل غير الدائرية ، يمكن استخدام أداة القلم بدلا من ذلك. الخطوه 3. يمكن استخدام شريط الأدوات لتصميم التعليقات التوضيحية وتصور القياس الكمي باستخدام الأداة. الخطوة 4. افتح علامة التبويب تحليل ، وحدد أفضل الظروف لتحليل العينة (قد تكون هناك حاجة إلى عدة تجارب هنا). الخطوة 4.1. استخدم قسم اختيار البقع لإعداد حالة التلطيخ. في حالة وجود عدة بقع ، يمكن إضافتها وإعادة تسميتها ، ويمكن تعديل اللون الافتراضي . يمكن تحديد الكشف عن التوطين - تلطيخ نووي أو سيتوبلازم. الخطوة 4.2. استخدم قسم اكتشاف الخلايا لإعداد اكتشاف الخلايا . سيكون هذا القسم هو الأهم للتحليل. سيمكن قسم عتبة التباين النووي من اكتشاف جميع النوى. يجب الانتباه في حالة وجود أحجام سكانية متعددة ، يمكن للبرنامج اكتشاف عدة خلايا بدلا من خلية كبيرة فريدة. يمكن استخدام أقسام عدوانية الحجم النووي والتجزئة النووية لتحديد نطاقات حجم الخلايا السكانية. الخطوة 5. وصف حول كيفية تشغيل تحليل العينة. اتبع الخطوات الموضحة في الشكل. سيقوم قسم طبقة التعليقات التوضيحية بتشغيل الإعداد فقط على هذه الشريحة. يمكن تصور القياس الكمي باستخدام الأداة. كرر الخطوات 4.1-5 حتى يتم تحقيق القياس الكمي المناسب. الخطوات 6-6.1. تمكنك هذه الخطوات من رسم شكل باستخدام البرنامج. الخطوة 7. يمكن حفظ رسومات القياس الكمي التي تم الحصول عليها عبر البرنامج. الخطوة 8. يمكن تصدير البيانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

زراعة الخلايا هي أداة لا غنى عنها للكشف عن الآليات البيولوجية الأساسية المشاركة في نمو الأنسجة والأعضاء ، والوظيفة ، والتجديد والاضطراب ، والمرض. على الرغم من أن ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد أحادية الطبقة قد سادت ، فقد تحولت الأبحاث الحديثة نحو الثقافات التي تولد هياكل 3D أكثر انعكاسا للاستجابات الخلوية في الجسم الحي ، ويرجع ذلك بشكل خاص إلى التنظيم المكاني الإضافي واتصالات الخلايا الخلوية التي تؤثر على التعبير الجيني والسلوك الخلوي وبالتالي يمكن أن توفر المزيد من البيانات التنبؤية⁷. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من التحديات ، بما في ذلك الحاجة إلى تقنيات تلطيخ وتصوير سهلة الاستخدام للتصور المجهري التفصيلي وتقييم هياكل 3D المعقدة على المستويين الخلوي ودون الخلوي. في هذا السياق ، تم توفير بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لإجراء تلطيخ وتصوير خلوي وتحت خلوي لنماذج زراعة الخلايا 3D الثابتة في المختبر والتي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات في الحجم.

يقدم هذا الإجراء استراتيجيتين مختلفتين للتعامل مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأحجام والأنواع من نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر. يعتمد اختيار أحدهما (تحليل 3D بالكامل) أو الآخر (تحليل التقسيم 2D) على النموذج المستخدم والمشكلة التي تم التحقيق فيها. يتيح التحليل الكامل ثلاثي الأبعاد بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر تصور الخلايا ذات العمق الممتد حتى 200 ميكرومتر ، بغض النظر عن الحجم الكلي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، في حين أن التقسيم ثنائي الأبعاد ينطبق على العينات من أي حجم ، لكن التصور يظل بعديا ثنائي الأبعاد. فيما يلي بعض الاقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها والاعتبارات الفنية.

فقدان هياكل 3D أثناء سير العمل هو العيب الأكثر شيوعا. يمكن أن تظل ملتصقة بالنصائح والأنابيب ، وهذا هو السبب في أن أطراف وأنابيب الطلاء المسبق بمحلول PBS-BSA 0.1٪ هو المفتاح. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان ترك هياكل 3D الرواسب بين تغييرات الكاشف وأداء جميع عمليات السحب بعناية فائقة. كما هو مذكور في الإجراء ، بالنسبة لجميع الخطوات ، إذا كان ترسيب الهيكل ثلاثي الأبعاد طويلا جدا ، فيمكن تدوير الخلايا بلطف عند 50 × جم لمدة 5 دقائق في RT. اعتمادا على الهدف من الدراسة ، ينبغي النظر في مزايا / عيوب مثل هذه الخطوة الغزل كما يمكن أن الطرد المركزي يضر شكل الهياكل 3D. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر للحفاظ على هذا التشكل أثناء خطوة التثبيت لأن الكائنات العضوية الكيسية تميل إلى الانهيار. يجب أن يمنع تثبيت الهياكل التي يقل حجمها عن 400 ميكرومتر التغييرات الهيكلية.

للحصول على العلامات المناعية المثلى ، يعد استرداد المواد العضوية من مصفوفات 3D خطوة حاسمة. يمكن أن تعيق مصفوفة 3D اختراق الأجسام المضادة الكافية أو تؤدي إلى تلطيخ الخلفية العالية بسبب الارتباط غير المحدد بالمصفوفة. قد تؤدي إزالة ECM إلى تغيير مورفولوجيا الأجزاء الخارجية من المواد العضوية (لا سيما في حالة النتوءات الخلوية الصغيرة الممتدة من هياكل 3D المدروسة) وتعيق التحليلات جزئيا. لمثل هذه الهياكل 3D ، يمكن الاحتفاظ بالمصفوفة طوال الإجراء ؛ ومع ذلك ، يجب تكييف ظروف الثقافة بعناية لنمو الخلايا في الحد الأدنى من المصفوفة لمنع الاختراق غير الكافي للحلول والأجسام المضادة وتجنب خطوات الغسيل المتتالية التي تهدف إلى تقليل ضوضاء الخلفية المفرطة ^6,8.

تعتبر خطوة المقاصة البصرية الموضحة في هذا البروتوكول في قسم تلطيخ التركيب الكامل ثلاثي الأبعاد ذات صلة بتصوير الهياكل ثلاثية الأبعاد التي يصل عمقها إلى 150-200 ميكرومتر بدلا من 50-80 ميكرومتر دون تطهير. مقارنة بمنهجيات المقاصة الأخرى التي تتطلب في كثير من الأحيان عدة أسابيع وتستخدم عوامل إزالة سامة ، تم استخدام خطوة إزالة سريعة وآمنة منشورة مسبقا في هذا البروتوكول ^4,9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خطوة المقاصة هذه قابلة للعكس ، ويمكن إضافة أجسام مضادة جديدة إلى التلوين الأولي دون فقدان الدقة أو السطوع⁴. ومع ذلك ، اعتمادا على نموذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الذي تمت دراسته ، قد لا يكون عمق 150-200 ميكرومتر كافيا لتصوير بنية ثلاثية الأبعاد بطريقة إعلامية ، ويمكن أن يتسبب بروتوكول المقاصة هذا في حدوث تغييرات في التشكل العام للعضويات الكروية أحادية الطبقات ذات اللومن الكبير⁴. يجب على المستخدمين تصميم تجربتهم بعناية ، وإذا لزم الأمر ، تحسين توقيت خطوة النفاذية / الحجب (للسماح باختراق الأجسام المضادة والمحلول) ، وخطوة المقاصة (لاختراق أعمق من 200 ميكرومتر ، يجب مسح العينات تماما) ، والحصول على الصور. والتكنولوجيات الأكثر انتشارا المتاحة في المرافق الأساسية هما الصفيحة الضوئية والفحص المجهري متحد البؤر. سيحتاج المستخدمون إلى اختيار تقنية بعناية بناء على حجم هياكل 3D الخاصة بهم وسؤالهم البيولوجي¹⁰. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الفحص المجهري متحد البؤر ، تظل دقة الفحص المجهري للصفائح الضوئية التي تم الحصول عليها لمثل هذه الهياكل العميقة دون المستوى الأمثل للحصول على دقة تحت خلوية.

هنا ، تم الإبلاغ عن عملية مفصلة وقوية مخصصة لتضمين البارافين لعينات واحدة. ومن المثير للاهتمام ، أن Gabriel et al. طورت مؤخرا بروتوكولا يتضمن ثقافات خلايا 3D في البارافين مع زيادة الإنتاجية. استخدموا قالب polydimethylsiloxane (PDMS) لحصر 96 بنية ثلاثية الأبعاد في نمط microarray في كتلة واحدة ، مما يوفر وجهات نظر جديدة للدراسات حول نماذج الورم ثلاثية الأبعاد التي تشمل المزيد من المجموعات والنقاط الزمنية وظروف العلاج وتكرار¹¹. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة مهارات وآلات واسعة النطاق ، لا سيما لتصنيع القوالب الأولية المستخدمة لإنشاء قوالب PDMS.

باختصار ، تصف هذه الورقة نهجين مختلفين ومتكاملين وقابلين للتكيف مما يتيح الحصول على معلومات دقيقة وكمية عن التركيب المعماري والخلوي للنماذج الخلوية 3D. كلا المعلمتين ضروريتان لدراسة العمليات البيولوجية مثل عدم التجانس الخلوي داخل الورم ودوره في مقاومة العلاجات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Biopsy pad Q Path blue	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin white	VWR	720-2183
Chemical hood	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fine forceps	Pyramid innovation	R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Excellent  for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontal agitation	N-BIOTEK	NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox molds 15x15	VWR	720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panoramic scan II	3dhistech	2397612
Paraffin embedding equipment	Leica	EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Good for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,  solid, provide excellent  stress  crack  and  impact  resistance and have a  good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers  excellent  sealing  characteristics.
Set of micropipettors  (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 inverted confocal microscope	Leica	LSM780
Tissue cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscope	Leica	SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylin type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	CAUTION: Suspected of causing genetic defects.  Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffin Wax tek III	Sakura	4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	CAUTION: Triton X­100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution	Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution	To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.
Permeabilisation-blocking solution (PB solution)	The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X  (1:10) solution	PB:PBS-1X  (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software	Indicalabs	NM 87114
Harmony software	PerkinElmer	HH17000010