Farging og høyoppløselig avbildning av tredimensjonale organoid- og sfæroidmodeller

Summary

Her gir vi detaljerte, robuste og komplementære protokoller for å utføre farging og subcellulær oppløsningsavbildning av faste tredimensjonale cellekulturmodeller fra 100 μm til flere millimeter, og muliggjør dermed visualisering av deres morfologi, celletypesammensetning og interaksjoner.

Abstract

In vitro tredimensjonale (3D) cellekulturmodeller, som organoider og sfæroider, er verdifulle verktøy for mange applikasjoner, inkludert utvikling og sykdomsmodellering, legemiddeloppdagelse og regenerativ medisin. For å utnytte disse modellene fullt ut, er det avgjørende å studere dem på cellulære og subcellulære nivåer. Karakterisering av slike in vitro 3D-cellekulturmodeller kan imidlertid være teknisk utfordrende og krever spesifikk kompetanse for å utføre effektive analyser. Her gir dette papiret detaljerte, robuste og komplementære protokoller for å utføre farging og subcellulær oppløsningsavbildning av faste in vitro 3D-cellekulturmodeller fra 100 μm til flere millimeter. Disse protokollene gjelder for et bredt utvalg av organoider og sfæroider som er forskjellige i deres opprinnelsescelle, morfologi og kulturforhold. Fra høsting av 3D-struktur til bildeanalyse kan disse protokollene fullføres innen 4-5 dager. Kort fortalt samles 3D-strukturer inn, fikseres og kan deretter behandles enten gjennom parafininnstøping og histologisk/immunhistokjemisk farging, eller direkte immunmerket og klargjort for optisk clearing og 3D-rekonstruksjon (200 μm dybde) ved konfokalmikroskopi.

Introduction

I løpet av de siste tiårene har fremskritt innen stamcellebiologi og in vitro 3D-kulturteknologier varslet en revolusjon innen biologi og medisin. Cellemodeller med høyere kompleksitet i 3D har blitt svært populære ettersom de tillater celler å vokse og samhandle med et omkringliggende ekstracellulært rammeverk, nært rekapitulerende aspekter av levende vev, inkludert deres arkitektur, celleorganisasjon og interaksjoner, eller til og med diffusjonsegenskaper. Som sådan kan 3D-cellekulturmodeller gi unik innsikt i oppførselen til celler i utviklende eller syke vev in vitro. Organoider og sfæroider er begge flercellede 3D-strukturer, alt fra flere mikrometer til millimeter, og er de mest fremtredende in vitro 3D-strukturer. Begge kan dyrkes i et støttestillas, inkludert (i) hydrogeler avledet fra dyr (kjellermembranekstrakt, kollagen), planter (alginat / agarose), eller syntetisert fra kjemikalier, eller (ii) inerte matriser som inneholder porer for å fremme celleproliferasjon og vekst.

Organoider og sfæroider kan også utvikle seg uten tilstedeværelse av et støttestillas ved å stole på celler for å selvmontere i klynger. Dette er avhengig av forskjellige teknikker som bruk av ikke-klebende materialer for å hemme cellefeste, overflatespenning og gravitasjonskraft (f.eks. Hengende dråpeteknikker) eller konstant sirkulær rotasjon av kar (f.eks. Spinnerkultur). I alle tilfeller letter disse teknikkene celle-celle- og cellematrise-interaksjoner for å overvinne begrensningene i tradisjonell monolags cellekultur¹. Begrepene "organoider" og "sfæroider" har blitt brukt om hverandre tidligere, men det er viktige forskjeller mellom disse to 3D-cellekulturmodellene. Organoider er in vitro 3D-cellulære klynger avledet fra pluripotente stamceller eller vevsspesifikke stamceller, hvor celler spontant selvorganiserer seg i forfedre og differensierte celletyper og som rekapitulerer i det minste noen funksjoner i organet av interesse². Sfæroider omfatter et bredere spekter av flercellede 3D-strukturer dannet under ikke-adherente forhold og kan oppstå fra et stort mangfold av celletyper som immortaliserte cellelinjer eller primære celler³. Derfor, iboende for deres iboende stamcelleopprinnelse, har organoider en høyere tilbøyelighet til selvmontering, levedyktighet og stabilitet enn sfæroider.

Likevel er disse to modellene i hovedsak 3D-strukturer sammensatt av flere celler, og teknikkene som er utviklet for å studere dem er dermed svært like. For eksempel er kraftige bildebehandlingsmetoder på enkeltcelleoppløsningsnivå nødvendige for å undersøke den cellulære kompleksiteten til både organoider og sfæroider. Her, ved å oppsummere denne gruppens kompetanse og ledere innen organoider⁴, beskriver dette papiret detaljerte prosedyrer for å utføre todimensjonal (2D) og 3D helmontert farging, avbildning og analyser av cellulær og subcellulær sammensetning og romlig organisering av organoider og sfæroider fra 100 μm til flere millimeter. Faktisk presenterer denne prosedyren to forskjellige og komplementære typer farging og bildeoppkjøp for å analysere et stort utvalg av størrelser og typer in vitro 3D-cellekulturmodeller. Bruken av den ene (3D-helmonteringsanalysen) eller den andre (2D-seksjonsanalyse) vil avhenge av modellen som studeres og svarene som søkes. 3D-helmontert analyse ved konfokalmikroskopi kan for eksempel brukes til å visualisere celler i 3D-kultur opp til 200 μm i dybden, uavhengig av den totale størrelsen på 3D-strukturen, mens analysen av 2D-seksjoner gir innsikt i prøver av enhver størrelse, om enn på 2D-nivå. Denne prosedyren har blitt brukt på tvers av en rekke organoider^4,5 og sfæroider avledet fra humane og murinceller^, som stammer fra forskjellige embryonale kimlag. Oversikten over prosedyren er vist i figur 1. De store stadiene, forholdet mellom dem, avgjørende trinn og forventet timing er indikert.

Figur 1 Skjematisk oversikt over prosedyren. In vitro 3D-cellekulturmodeller samles inn og festes, deretter enten klargjort for 3D-farging med helmontering (alternativ a) eller innebygd i parafin for 2D-snitting og farging (alternativ b). For 3D-fargeeksperimenter med helmontering immunmerkes faste 3D-strukturer etter fikseringstrinnet. Et valgfritt optisk clearing-trinn kan utføres for å forbedre bildekvaliteten og dybden av optisk mikroskopi ved å redusere lysspredning under bildebehandling. Bilder er tatt på et invertert konfokalmikroskop eller et konfokalt høyt innholdssystem og analysert ved hjelp av riktig programvare. For parafininnebygging behandles 3D-strukturer direkte (alternativ b.1 for store strukturer ≥ 400 μm) eller inngår i en gel (b.2; små strukturer ≤ 400 μm) for dehydrering og parafininnstøping. Parafinblokker blir deretter kuttet og farget (histologisk eller immunokjemisk farging). Bilder av 2D-seksjoner oppnås på en digital lysbildeskanner eller et oppreist mikroskop og analyseres på en bildeanalyseplattform ved hjelp av rask digital kvantitativ analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

MERK: Et tap på ≤25 % av det opprinnelige antallet 3D-strukturer må forventes under trinnene som involverer reagensskift og vasking i følgende prosedyre. Planlegg å bruke et endelig antall på minst ti 3D-strukturer, med en størrelse fra 100 til 500 μm, per testet tilstand for å utføre kvalitative og kvantitative bildeanalyser. Om nødvendig, for større konstruksjoner, kutt endene av 1 ml pipettespisser for å unngå å bryte strukturene. For alle trinn, hvis 3D-struktursedimentering er for lang, kan celler forsiktig spinnes ved 50 × g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Avhengig av problemet som undersøkes, bør fordeler/ulemper ved et slikt spinnetrinn vurderes, da sentrifugering kan kompromittere formen på 3D-strukturene. Unngå å spinne på >100 × g.

1. Innsamling og fiksering av 3D-cellekulturmodeller

MERK: Vær forsiktig så du ikke aspirerer 3D-strukturene, som bare er løst festet til rørveggen.

1. Høsting av 3D-cellekulturmodeller innebygd i en matrise
   MERK: Denne delen beskriver utvinning av 3D-strukturer dyrket i dråper av et kjellermembranekstrakt fra murine Engelbreth-Holm-Swarm sarkom (BME), men kan tilpasses andre matriser. Se diskusjonen for viktige punkter angående ECM.
   1. Fjern dyrkningsmediet fra brønnene uten å forstyrre 3D-matrisen. Dekk innsiden og utsiden av en 1 ml pipettespiss med protein (heretter kalt forhåndsbelagt 1 ml spiss ) ved å dyppe hele spissens lengde i 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufret saltvann (PBS) (heretter kalt PBS-BSA 0,1 % oppløsning ) og pipettere 1 ml av denne oppløsningen opp og ned to ganger.
      MERK: Dette forhåndsbelegget forhindrer at cellene fester seg til spissen og minimerer tap.
   2. Dekk innsiden av et sentrifugerør (15 ml) med protein (heretter kalt forhåndsbelagt sentrifugerør ) ved å fylle gjentatte ganger med PBS-BSA 0,1 % oppløsning og tømme røret.
      MERK: Dette vil forhindre at cellene fester seg til røret og minimere tap.
   3. Bruk den forhåndsbelagte 1 ml spissen, resuspender forsiktig 3D-strukturene i brønnen ved hjelp av 1 ml iskald 1x PBS, og overfør forsiktig suspensjonen som inneholder 3D-strukturer til det forhåndsbelagte sentrifugerøret.
   4. Tilsett forsiktig 13 ml iskald 1x PBS, og la 3D-strukturene sedimentere på is i minst 10 minutter.
      MERK: Hvis nødvendig, sentrifuger i 5 minutter ved 50 × g ved 4 °C. Unngå å spinne >100 × g, da dette vil kompromittere formen på 3D-strukturene.
   5. Fjern supernatanten. Bruk en forhåndsbelagt spiss på 1 ml til å resuspendere 3D-strukturene forsiktig i 1 ml iskald 1x PBS. Gjenta trinn 1.1.4 til 1.1.5 for å oppnå en homogen pellet uten 3D-matriksrester.
      MERK: Effektiv matrisefjerning påvirkes av typen matrise, antall og størrelse på 3D-strukturer og krever optimalisering for forskjellige kulturforhold. For 3D-strukturer dyrket i BME tar gjenoppretting fra matrisefjerningen vanligvis 45-60 min.
   6. Bruk en forhåndsbelagt spiss på 1 ml til å overføre 1 ml 1x PBS-suspensjonen som inneholder 3D-strukturene til et forhåndsbelagt 1,5 ml sentrifugerør, og fortsett med avsnitt 1.3.
2. Høsting av flytende 3D-cellekulturmodeller
   1. Bruk en forhåndsbelagt spiss på 1 ml til å samle og overfør 3D-strukturene forsiktig til et forhåndsbelagt 1,5 ml sentrifugerør. La 3D-strukturene sedimentere, eller spinne i 5 minutter ved 50 × g ved RT.
   2. Fjern supernatanten. Bruk en forhåndsbelagt spiss på 1 ml til å resuspendere 3D-strukturene i 1 ml 1x PBS. Gå videre til punkt 1.3.
3. Fiksering av 3D-cellekulturmodeller
   1. La 3D-strukturene sedimentere. Fjern forsiktig supernatanten; under en avtrekkshette resuspenderer du 3D-strukturene forsiktig i 1 ml formalin ved hjelp av en forhåndsbelagt spiss på 1 ml.
      MERK: Formalin inneholder formaldehyd, som er farlig. Manipuler kjemikaliet i en kjemisk hette. Bruk gummihansker og vernebriller.
   2. Inkuber 3D-strukturene i 30 min ved RT.
      MERK: Et 30 minutters fikseringstrinn med formalin er nødvendig for immunfarging av et bredt spekter av 3D-strukturer (varierende i størrelse, form og opprinnelse). Imidlertid er lengre fikseringstider (>3 timer) generelt bedre egnet til å bevare fluorescensen av reporterproteiner.
   3. La 3D-strukturene sedimentere, eller spinne i 5 minutter ved 50 × g ved RT. Fjern formalinet forsiktig, og erstatt det med 1 ml 1x PBS. Gjenta dette vasketrinnet i 1x PBS to ganger. Oppbevar prøvene ved 4 °C, og fortsett med avsnitt 2 eller avsnitt 3.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her, og cellene kan opprettholdes ved 4 °C for langtidslagring (>1 år).

2.3D farging, avbildning og analyse av 3D-cellekulturmodeller

MERK: Siden organoidene er løst festet til rørveggen, håndter dem forsiktig, da alle følgende reagensendringer kan forårsake prøvetap. Før du starter, må du kontrollere tilgjengeligheten av de riktige kontrollene for farging. Positive og negative kontroller kan være celler, hvor proteinet av interesse er kjent for å være henholdsvis overuttrykt eller fraværende. Inkuber prøver uten det primære antistoffet for å avgjøre om det observerte signalet skyldes ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoffet. Siden noen celler har en tendens til å vise høye nivåer av autofluorescens, bruk kontroller uten sekundært antistoff for å avgjøre om den observerte fluorescensen kommer fra bakgrunnsautofluorescens. Visualisering av immunmerking og fluorescerende reportervisualisering kan kombineres.

1. 3D helmontering farging
   1. Forbered permeabiliseringsblokkerende (PB) -løsningen ved å supplere 1x PBS med 0,1% -1% av et ikke-ionisk overflateaktivt middel (se materialfortegnelsen), 1% dimetylsulfoksid, 1% BSA og 1% eselserum (eller fra dyret der de sekundære antistoffene ble hevet).
      MERK: Optimaliser forsiktig konsentrasjonen av det ikke-ioniske overflateaktive middelet avhengig av lokaliseringen av målet: membran (0-0,5%), cytoplasma (0,5-1%) og kjerne (1%). Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. BSA fungerer vanligvis bra for blokkeringstrinnet, men i tilfelle høy bakgrunnsstøy, utfør en empirisk test for å oppnå best mulig resultat for en gitt kombinasjon av antistoffer.
   2. Overfør organoidene fra 1,5 ml sentrifugerøret til et 0,5 ml rør ved bruk av en forhåndsbelagt 1 ml spiss. La organoidene sedimentere, fjern forsiktig 1x PBS, og erstatt den med 0,5 ml PB-løsning. Inkuber organoidene med mild horisontal omrøring (30-50 rpm) i 1 time ved RT.
   3. La organoidene sedimentere, fjern forsiktig PB-oppløsningen og vask to ganger i 1 ml pbs-bsa 0,1% i 3 minutter.
      MERK: Venter i 3 min gjør at strukturene kan sedimentere i bunnen av røret.
   4. Fjern forsiktig PBS-BSA 0,1 %, og tilsett 250 mikrol primært antistoff fortynnet ved riktig konsentrasjon i PB:1x PBS (1:10) oppløsning. For å klargjøre 10 ml PB:1x PBS (1:10) løsning, fortynn 1 ml PB-oppløsning i 9 ml 1x PBS. Inkuber i 2-3 dager ved lett horisontal omrøring (30-50 rpm) ved 4 °C.
      MERK: En passende antistoffinkubasjonstid er avgjørende for en passende antistoffpenetrasjon, da 3D-strukturer noen ganger kan nå store størrelser.
   5. La organoidene sedimentere, og fjern forsiktig den primære antistoffløsningen. Vask 5x i PBS-BSA 0,1% i 3 min per vask og deretter 2x i 1 ml pbs-bsa 0,1% i 15 min per vask med mild horisontal omrøring.
   6. Tilsett 250 mikrol sekundært antistoff fortynnet ved 1:250 i PB:1x PBS (1:10) løsning. Inkuber i 24 timer ved 4 °C med lett horisontal omrøring (30-50 o / min). For dette trinnet, beskytt prøvene mot lys.
   7. Tilsett 250 μL Hoechst 33342 (20 μM stamløsning) fortynnet ved 1:1000 i PB:1x PBS (1:10) løsning, og inkuber i ytterligere 2 timer ved 4 °C med mild horisontal omrøring (30-50 rpm).
   8. La organoidene sedimentere, og fjern forsiktig løsningen som inneholder sekundært antistoff + Hoechst 33342. Vask organoidene 5x i 1 ml 1x PBS i 3 min per vask og deretter 2x i 1 ml 1x PBS i 15 min per vask med mild horisontal omrøring (30-50 o / min).
      MERK: Det er avgjørende å vaske prøvene grundig for å unngå bakgrunnsstøy eller tap av signal.
   9. Lagre prøvene i PBS ved 4 °C til bildeopptak. Gå videre til punkt 2.2.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her, og prøvene kan lagres ved 4 °C i flere måneder, beskyttet mot lys.
2. Prøveklargjøring for konfokal avbildning
   1. Bruk en forhåndsbelagt 1 ml spiss, overfør organoidene forsiktig til 50 μL av 1x PBS per brønn i en 96-brønns svart polystyrenmikroplate. Gå videre til trinn 2.2.3 eller avsnitt 2.3.
      MERK: På dette stadiet kan prøven beskyttes mot lys og oppbevares ved 4 °C i mange uker.
   2. Lysning
      MERK: Clearing-trinnet er valgfritt og kan brukes til å enten immunmerke organoider eller for å oppdage endogen fluorescens. Rydding kan forårsake krymping av 3D-struktur, men endrer ikke den generelle morfologien bortsett fra sfæriske monolagsorganoider med store lumen⁴. For disse cystiske organoider, hopp over clearing-trinnet, og utfør dypvevsavbildning⁶.
      1. Tilbered 2,5 M glyserol-fruktosefjerningsoppløsning som inneholder 50% v/v glyserol, 11% v/v destillert vann og 45% w/v fruktose ved å blande på en magnetomrører minst over natten til løsningen er fullstendig løselig og homogen. Oppbevares ved 4 °C i mørket i opptil 1 måned.
      2. Fjern så mye 1x PBS som mulig uten å berøre organoider. Tilsett 200 mikrol av ryddeløsningen ved hjelp av en 1 ml pipettespiss etter at enden er fjernet, og resuspender forsiktig for å forhindre dannelse av bobler. Inkuber ved RT i minst 12 timer, og fortsett med seksjon 3.
         MERK: Siden clearingløsningen er tyktflytende, er små volumer vanskelige å håndtere. For å lette håndteringen, sørg for at løsningen er på RT, og pipette sakte. For optimal clearing, la prøven sedimentere i clearingløsningen i minst 24 timer før avbildning. Hvis 3D-strukturer flyter på oppkjøpstidspunktet, utfør et valgfritt spinn i 10 minutter ved <100 × g ved RT, eller la dem få mer tid (en til flere dager) for å la dem sedimentere. Protokollen kan settes på pause på dette trinnet før du går videre til avbildning hvis den er beskyttet mot lys og oppbevares ved 4 °C (i uker) eller -20 °C (i flere måneder).
3. Bildeinnsamling og analyse
   MERK: Bildesnittingsteknologi kreves for å avbilde 3D-strukturer.
   1. Bruk konfokalmikroskoper, og favoriser nedsenkningsmål med høyere numerisk blenderåpning (NA) sammenlignet med luft. Velg forstørrelsesmål (10x, 20x, 40x) i henhold til størrelsen på 3D-strukturer, bilderekonstruksjon (stitching) og løsninger som brukes til analysen.
   2. Når du velger anskaffelsesmodus, må du ta hensyn til fokusdybden til målet som brukes til å definere trinnet for Z-stabling; muliggjør optimal 3D-gjengivelse.
      MERK: Bildeanalyseløsninger varierer, og analysen må justeres til programvaren som brukes. For eksempel ble denne analyseprotokollen etablert på et analyseprogram med høyt innhold (se materialliste og tilleggsfigur 1 for detaljer) og gir data om objektsegmentering, beregning av egenskaper og cellepopulasjonsvalg i et 3D-rekonstruert objekt.

3. 2D-seksjonering, farging, avbildning og analyse av 3D-cellekulturmodeller

MERK: 3D-cellekulturmodeller varierer i størrelse. Gå videre med pkt. 3.1 eller 3.2 for effektiv innebygging av parafin (figur 2). Tillat tilstrekkelig tid til sedimentering av 3D-struktur før vask og reagensendringer. Vær forsiktig så du ikke aspirerer organoider som skal flyte på bunnen av røret. For innebygging av parafin, se figur 2 for veiledning.

1. Parafininnebygging av store (Ø ≥ 400 μm) 3D-cellekulturmodeller
   1. Dagen før forankring forvarmer du to 150 ml kolber fylt med parafin (parafinbad), en liten metallstøpeform per prøve og fin tang til 65 °C.
   2. Bruk en forhåndsbelagt spiss på 1 ml og overfør organoidene forsiktig i 1x PBS til et flatbunnet glassrør med polytetrafluoretylenforet flaskekork. La organoidene sedimentere, fjern forsiktig 1x PBS, og erstatt den med 70% etanol. Inkuber i minst 30 min.
   3. La organoidene sedimentere, og fjern forsiktig 70% etanol. Bytt den ut med 1 ml klar til bruk eosin Y-løsning. Knips røret, og beis i minst 30 min. Fjern forsiktig eosinoppløsningen, og dehydrer organoidene i tre påfølgende vasker med 1 ml 100% etanol i ~ 30 min hver.
      MERK: Etanol, en brennbar og flyktig væske, forårsaker alvorlig irritasjon i øyne og luftveier. Manipuler den i en avtrekkshette, og bruk beskyttende øyevernbriller.
   4. Fjern forsiktig 100% etanol, og under en kjemisk hette, fjern organoidene i 3 påfølgende vasker med 1 ml xylen i ~ 30 min hver.
      MERK: Xylen er en giftig, flytende brannfarlig hvis damper kan forårsake irritasjon. Manipuler den i en avtrekkshette. Unngå direkte kontakt med huden, og bruk gummihansker og beskyttende øyebriller.
   5. Under en kjemisk hette, klargjør en hvit mikrotwin vevskassett ved å plassere et stykke biopsipute (tidligere gjennomvåt i xylen) inne i et av rommene i kassetten. Overfør forsiktig 3D-strukturene ved hjelp av en forhåndsbelagt 2 ml plast Pasteur-pipette til biopsiputen. Dekk dem med en annen biopsipute dynket i xylen for å forhindre at organoidene beveger seg, og lukk kassetten.
   6. Hvis flere prøver behandles, legg kassetten i et xylenbad for å avvente videre behandling. Når alle prøvene er overført til kassetter, legges kassettene i et forvarmet parafinbad i 30 minutter ved 65 °C. Overfør kassettene til et ferskt forvarmet parafinbad over natten.
   7. Etter parafinimpregnering, ta en forvarmet innebyggingsform, og tilsett den oppvarmede parafinen. Plasser biopsiputen som inneholder 3D-strukturer i formen, og rør den forsiktig til alle organoidene faller til bunnen av formen. Plasser 3D-strukturene veldig forsiktig i midten av formen ved hjelp av forvarmede fine tang. Gå videre til punkt 3.3.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer 3D-strukturene med tangen; Trykk, men ikke klem dem.
2. Parafininnebygging av små (Ø ≤ 400 μm) 3D-cellekulturmodeller
   1. Dagen før forankring forvarmer du to 150 ml kolber fylt med parafin (parafinbad), en liten metallstøpeform per prøve og fin tang til 65 °C.
   2. Fjern forsiktig 1x PBS fra organoidsuspensjonen. Utfør forsiktig 3 vasker i 1 ml 1x Tris-bufret saltvann (TBS). Fjern så mye 1x TBS som mulig uten å berøre organoider.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke aspirerer prøven. Utfør om nødvendig en 5 minutters spinn ved 50 x g ved RT. Gjenværende spor av fosfat vil forstyrre følgende trinn, spesielt for å forhindre gelpolymerisering. Bruk derfor ikke PBS-løsninger under behandlingstrinn. For dette trinnet ble et kommersielt sett, som inneholder kassetter, reagens #1 (klar væske) og reagens #2 (farget væske), brukt for å lette den parafininnebygde prosedyren uten potensielt å miste små fragmenter (se materialtabell). Følg instruksjonene for settet. Kassettene er forhåndsmontert med bakpapir og pappinnsatser allerede på plass.
   3. Tilsett 2 dråper reagens #2 i røret, og bland forsiktig ved å banke på røret. Tilsett 2 dråper reagens #1, og bland igjen ved å banke for å få gelen til å stivne. Bruk de fine tangene, fjern gelen fra røret og legg den i kassettens brønn.
   4. Under avtrekkshetten, dehydrer prøven ved å plassere kassetten i påfølgende bad som følger (bruk 150 ml kolber, og bruk fersk etanol eller xylen for hvert bad): etanol 70%, 30 min; etanol 96%, 30 min; etanol 100%, tre vasker, 30 min hver; xylen, tre vasker, 30 min hver.
   5. Legg kassettene i et forvarmet parafinbad i 30 minutter ved 65 °C, og overfør dem til et ferskt forvarmet parafinbad over natten. Etter parafinimpregnering, ta en forvarmet innebyggingsform, og tilsett oppvarmet parafin i den. Åpne kassetten, løsne gelen forsiktig med fine tang, og plasser gelen som inneholder 3D-strukturene på midten av innebyggingsformen. Gå videre til punkt 3.3.
3. Vanlige trinn for innebygging av parafin
   1. Overfør formen forsiktig til et kaldt område for å la parafinen størkne i et tynt lag, som vil opprettholde 3D-strukturene i riktig posisjon. Legg en vevskassett på toppen av formen, og tilsett varm parafin for å dekke denne plastkassetten. Fjern formen når den er helt størknet, og fortsett med pkt. 3.4.
      MERK: Parafinblokker kan lagres ved romtemperatur i årevis.

Figur 2: Oversikt over prosedyren for parafininnebygging av store og små in vitro 3D-cellekulturmodeller.
(A) Standard prosedyre for innebygging av parafin. Etter fiksering og dehydrering er 3D-strukturer farget med eosin for å lette visualiseringen (øverst og nederst til venstre). 3D-strukturer plasseres forsiktig på biopsiputen (blå) i kassetten ved hjelp av en 2 ml Pasteur-pipet (midten). Etter parafinimpregnering slippes 3D-strukturene forsiktig ned i den flytende parafinen ved hjelp av tang og omrøres forsiktig i biopsiputen. Små 3D-strukturer går tapt i dette trinnet, siden de ikke kan frigjøres fra puten (nederst til høyre: mislykket innebygging). Bare store 3D-strukturer bygges inn (øverst til høyre: vellykket innebygging). Pilspisser peker på 3D-kulturer. (B) Alternativ til standard protokoll for innebygging av parafin. Etter å ha fikset små 3D-strukturer, brukes et kommersielt sett for å opprettholde celler i en gel og lette overføringen til formen etter parafinimpregnering (til høyre: vellykket innebygging). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Blokkseksjonering og farging
   1. Skjær 4 μm seksjoner ved hjelp av en standard mikrotom, og utfør standard histologiske og immunhistokjemiske teknikker. Gå videre til avsnitt 3.5.
      MERK: Spesifikke lysbilder (se Materialfortegnelse) ble brukt for bedre vedheft av seksjoner. Skliene kan oppbevares i romtemperatur eller ved 4 °C i årevis.
5. Bildeinnsamling og analyse
   1. Utfør avbildning ved hjelp av en digital lysbildeskanner eller stående mikroskop, og analyser data ved hjelp av en plattform for rask digital kvantitativ analyse som rapporterer morfologiske og multipleksede uttrykksdata på celle-for-celle-basis over hele 3D-strukturseksjoner (se tilleggsfigur 2 for detaljer).
      MERK: 20x-målsettingen brukes rutinemessig av denne gruppen.

Representative Results

Denne protokollen gir en oversikt over de kritiske trinnene for 2D- og 3D-helmonterte farginger, samt avbildning og kvantitative analyser av 3D-cellekulturmodeller (figur 3 og figur 4). Det gjelder for et bredt spekter av 3D-cellekulturmodeller - fra sfæroider til organoider fra forskjellige vertsarter eller vev - og muliggjør oppkjøp av nøyaktig og kvantitativ informasjon om arkitektur, celleorganisasjon og interaksjoner på cellulære og subcellulære nivåer (figur 3 og figur 4). Laboratorier kan trenge å optimalisere 2D histologiske og immunhistokjemiske teknikker og antistoffkonsentrasjoner i henhold til deres egne behov.

Begge metodene gir verdifull biologisk informasjon. 3D helmontert farging og konfokalmikroskopi gir visuell informasjon om cellulær sammensetning og romlig posisjon med et dybdefelt på opptil 200 μm (figur 3B). Imidlertid er 2D-seksjonering praktisk for større 3D-strukturer for å avsløre detaljerte cellulære morfologiske egenskaper i hele delen av 3D-strukturer som ellers kan være utfordrende å observere in situ på grunn av lysspredning som kompromitterer oppløsningen i større prøver. Videre kan begge teknikkene gi kvantitative data. Faktisk tillater den oppnådde oppløsningen anvendelse av cellulære og subcellulære segmenteringsalgoritmer for kvantifisering av antall celler og deteksjon av tilstedeværelsen av forskjellige cellemarkører i forskjellige cellulære subtyper (figur 3F og figur 4). Oppsummert er bildebehandlingsteknikkene beskrevet her reproduserbare, enkle og komplementære og representerer verdifulle verktøy for å studere cellulær heterogenitet.

Figur 3: Representative resultater for 3D helmontering, avbildning og analyser av 3D og 2D optiske seksjoner. (A) Konfokale bilder av humant (h) høygradig gliom-sfæroid dyrket i en uke og merket med Hoechst (blå), Olig2 (gul) og aktin (rød) (20x vannmål). For alle oppkjøpte bilder ble mikroskopinnstillinger etablert ved hjelp av en positiv kontroll (øverst), og deretter ble den negative kontrollen avbildet ved hjelp av identiske innstillinger for å kontrollere mangelen på fluorescens i fravær av primært antistoff (nederst). (B) Ortogonal 3D helmontert representasjon av Ki67-farging utført i (h) høyverdig gliom-sfæroid dyrket i en uke (glyserol-fruktose-clearing; 20x vannmål, konfokal). (C) Konfokale bilder av (h) høyverdig gliom-sfæroid dyrket i en uke og merket med Hoechst (blå), Olig2 (gul) og Phalloidine-488 (grønn) (glyserol-fruktose-clearing; 20x vannmål). (D) Konfokale bilder av humane (h) rabdomyosarkom (øverst) og mus (m) nevrale kamceller (nederst) sfæroider dyrket i en uke og merket med henholdsvis Hoechst (blå), aktin (rød) og Ki67 (grønn) (glyserol-fruktose-clearing; 20x tørr mål). (E) Konfokale bilder av (h) høygradig gliom-sfæroid dyrket i en uke og merket med Hoechst (blå) og Ki67 (grønn) (glyserol-fruktose-clearing; 40x vannmål) (øverst til venstre). Segmenterte bilder på Hoechst-kanalen og Ki67-positive (+) kjernefysiske regioner på den grønne kanalen ble generert ved hjelp av analyseprogramvare med høyt innhold (se tilleggsfigur 1 og materialfortegnelse) (nederst). Output gitt er prosentandelen av Ki67⁺ kjerner per segmentert 3D-struktur (øverst til høyre). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representative resultater for avbildning og analyser av optiske 2D-snitt. (A, D) 2D-seksjonsbilder av en 3D-cellemodell (humane rhabdomyosarcoma sfæroider dyrket i en måned) oppnådd med en digital lysbildeskanner og analysert på en plattform for rask digital kvantitativ analyse. (A) H&E-farging og deteksjon av celler i henhold til deres størrelse. Skala bar = 500 μm. (B) Histogram viser prosentandel av celler < 100 μm 2 og > 100 μm² oppdaget ved hjelp av programvare for rask digital kvantitativ analyse (venstre: Halo) eller manuell telling (høyre: MC). (C) Ki67 farging og påvisning av celler i henhold til intensiteten av deres 3,3'-diaminobenzidin (DAB) signal. Negativ (blå), svakt positiv (gul), positiv (rød). Skala bar = 500 μm. (D) Histogram viser prosentandel av Ki67-negative, svakt positive og positive celler. Forkortelser: H&E = hematoksylin og eosin; MC = manuell telling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Oversikt over trinnene i programvaren for bildeanalyse. Analysene er basert på assosiasjonen av byggeklosser. Hver byggestein tilsvarer en funksjonssegmentering, beregning, assosiasjon, utgangsdefinisjon - og tilbyr flere algoritmer og variable valg for å matche den biologiske prøven som avbildes. Programvaren gir flere RMS (Ready Made Solution) analyseprotokoller som enkelt kan brukes og endres. Integrerte bildeanalyseprotokoller kan lagres, brukes på forskjellige datasett og deles mellom brukere. Kort fortalt innebærer analyseprotokollen sekvensiell objektsegmentering: sfæroid, kjerner og til slutt Ki67-lommer (A488). Deretter beregnes den gjennomsnittlige intensiteten til Ki67-lommene for å diskriminere de positive hendelsene ytterligere. Til slutt velges kjerner som omfatter Ki67 positive lommer positivt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Oversikt over prosedyretrinnene i programvaren for kvantitativ analyse. Trinn 1. Last opp filene ved hjelp av kategorien Studier . Filer åpnes i delen Bildehandlinger . Trinn 2. Åpne kategorien Merknader , og klikk deretter på Laghandlinger for å designe et nytt lag rundt strukturen ved hjelp av sirkelverktøyet på verktøylinjen. For ikke-sirkulære strukturer kan pennverktøyet brukes i stedet. Trinn 3. Verktøylinjen kan brukes til å utforme merknader og visualisere kvantifiseringen med verktøyet. Trinn 4. Åpne kategorien Analyse , og velg de beste betingelsene for analysen av utvalget (flere forsøk kan være nødvendige her). Trinn 4.1. Bruk delen Flekkvalg til å definere fargetilstanden. Ved flere flekker kan disse legges til og omdøpes, og den virtuelle fargen kan endres. Lokaliseringsdeteksjonen kan spesifiseres - nukleær eller cytoplasmafarging. Trinn 4.2. Bruk delen Cellegjenkjenning til å konfigurere celledeteksjonen. Denne delen vil være den viktigste for analysen. Nuclear Contrast Threshold-delen vil muliggjøre deteksjon av alle kjerner. Oppmerksomhet må betales i tilfelle det er flere populasjonsstørrelser, programvaren kan oppdage flere celler i stedet for en unik stor. Nukleær størrelse og kjernefysisk segmentering aggressivitet seksjoner kan brukes til å kvantifisere cellestørrelse befolkningsområder. Trinn 5. Beskrivelse av hvordan du kjører prøveanalyse. Følg trinnene som vises på figuren. Annotation Layer-delen kjører innstillingen bare på dette lysbildet. Kvantifiseringen kan visualiseres ved hjelp av verktøyet. Gjenta trinn 4.1-5 til passende kvantifisering er oppnådd. Trinn 6-6.1. Disse trinnene lar deg tegne en figur ved hjelp av programvaren. Trinn 7. Kvantifiseringsgrafikk oppnådd via programvare kan lagres. Trinn 8. Data kan eksporteres. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Cellekultur er et uunnværlig verktøy for å avdekke grunnleggende biologiske mekanismer involvert i vev og organutvikling, funksjon, regenerering og forstyrrelse og sykdom. Selv om monolayered 2D-cellekultur har dominert, har nyere forskning skiftet mot kulturer som genererer 3D-strukturer som reflekterer mer in vivo cellulære responser, spesielt på grunn av ytterligere romlig organisasjon og cellekontakter som påvirker genuttrykk og cellulær oppførsel og kan dermed gi mer prediktive data⁷. Likevel gjenstår mange utfordringer, inkludert behovet for brukervennlige farge- og avbildningsteknikker for detaljert mikroskopisk visualisering og evaluering av komplekse 3D-strukturer på cellulært og subcellulært nivå. I den sammenheng har detaljerte, robuste og komplementære protokoller blitt gitt for å utføre farging og cellulær og subcellulær oppløsningsavbildning av faste in vitro 3D-cellekulturmodeller fra 100 μm til flere millimeter i størrelse.

Denne prosedyren presenterer to forskjellige strategier for å håndtere et stort utvalg av størrelser og typer in vitro 3D-cellekulturmodeller. Valget av den ene (3D-helmonteringsanalysen) eller den andre (2D-seksjoneringsanalyse) vil avhenge av modellen som brukes og problemstillingen som undersøkes. 3D-helmontert analyse ved konfokalmikroskopi muliggjør visualisering av celler med et dybdefelt på opptil 200 μm, uavhengig av den totale størrelsen på 3D-strukturen, mens 2D-seksjonering gjelder for prøver av hvilken som helst størrelse, men visualisering forblir 2D-dimensjonal. Nedenfor finner du noen forslag til feilsøking og tekniske vurderinger.

Tap av 3D-strukturer under arbeidsflyten er den vanligste ulempen. De kan forbli festet til spissene og rørene, og det er derfor precoating tips og rør med PBS-BSA 0,1% løsning er nøkkelen. Videre er det avgjørende å la 3D-strukturene sedimentere mellom reagensendringer og å utføre all pipettering svært nøye. Som nevnt i prosedyren, for alle trinn, hvis 3D-struktursedimentering er for lang, kan celler forsiktig spinnes ved 50 × g i 5 minutter ved RT. Avhengig av målet med studien, bør fordelene / ulempene ved et slikt spinnetrinn vurderes, da sentrifugering kan kompromittere formen på 3D-strukturene. Videre bør det tas hensyn til å bevare denne morfologien under fikseringstrinnet fordi cystiske organoider har en tendens til å kollapse. Festekonstruksjoner under 400 μm i størrelse bør forhindre strukturelle endringer.

For optimal immunmerking er gjenoppretting av organoider fra deres 3D-matriser et avgjørende skritt. 3D-matrisen kan hindre tilstrekkelig antistoffpenetrasjon eller føre til høy bakgrunnsfarging på grunn av uspesifikk binding til matrisen. ECM-fjerning kan endre morfologien til de ytre segmentene av organoider (spesielt ved små cellulære fremspring som strekker seg fra studerte 3D-strukturer) og delvis hemme analyser. For slike 3D-strukturer kan matrisen beholdes gjennom hele prosedyren; Imidlertid bør kulturforholdene nøye tilpasses for å vokse celler i en minimumsmengde matrise for å forhindre utilstrekkelig penetrasjon av løsninger og antistoffer og for å unngå påfølgende vasketrinn for å redusere overdreven bakgrunnsstøy ^6,8.

Det optiske ryddetrinnet beskrevet i denne protokollen i 3D-fargeseksjonen for helmontering er relevant for avbildning av 3D-strukturer opp til 150-200 μm i dybden i stedet for 50-80 μm uten rydding. Sammenlignet med andre clearingmetoder som ofte krever flere uker og bruker giftige clearingmidler, ble et tidligere publisert raskt og sikkert clearingtrinn brukt i denne protokollen ^4,9. I tillegg er dette clearingtrinnet reversibelt, og nye antistoffer kan legges til den opprinnelige fargingen uten tap av oppløsning eller lysstyrke⁴. Likevel, avhengig av den studerte 3D-cellekulturmodellen, kan det hende at en dybde på 150-200 μm ikke er tilstrekkelig til å avbilde 3D-strukturen på en informativ måte, og denne clearingprotokollen kan forårsake endringer i den generelle morfologien til sfæriske, monolags organoider med store lumen⁴. Brukere bør nøye utforme eksperimentet sitt, og om nødvendig optimalisere tidspunktet for permeabiliserings- / blokkeringstrinnet (for å tillate penetrasjon av antistoffer og løsning), ryddetrinnet (for å trenge dypere enn 200 μm, bør prøvene være helt ryddet) og bildeoppkjøp. De to mest utbredte teknologiene som er tilgjengelige i kjernefasiliteter, vil være lysark og konfokalmikroskopi. Brukere må nøye velge en teknologi basert på størrelsen på deres 3D-strukturer og deres biologiske spørsmål¹⁰. Imidlertid, sammenlignet med konfokalmikroskopi, forblir lysarkmikroskopioppløsning oppnådd for slike dype strukturer suboptimal for å oppnå subcellulær oppløsning.

Her er det rapportert om en detaljert og robust prosess som er dedikert til parafininnstøping av enkeltprøver. Interessant nok har Gabriel et al. nylig utviklet en protokoll som bygger inn 3D-cellekulturer i parafin med økt gjennomstrømning. De brukte en polydimetylsiloksan (PDMS) form for å begrense 96 3D-strukturer i et mikroarraymønster i en blokk, noe som gir nye perspektiver for studier på 3D-tumormodeller som omfatter flere grupper, tidspunkter, behandlingsforhold og replikater¹¹. Imidlertid krever denne metoden omfattende ferdigheter og maskiner, spesielt for fremstilling av premold som brukes til å lage PDMS-former.

Oppsummert beskriver denne artikkelen to forskjellige, komplementære og tilpasningsdyktige tilnærminger som muliggjør oppkjøp av nøyaktig og kvantitativ informasjon om arkitektonisk og cellulær sammensetning av 3D-cellulære modeller. Begge parametrene er avgjørende for å studere biologiske prosesser som intratumoral cellulær heterogenitet og dens rolle i resistens mot behandlinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Biopsy pad Q Path blue	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin white	VWR	720-2183
Chemical hood	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fine forceps	Pyramid innovation	R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Excellent  for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontal agitation	N-BIOTEK	NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox molds 15x15	VWR	720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panoramic scan II	3dhistech	2397612
Paraffin embedding equipment	Leica	EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Good for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,  solid, provide excellent  stress  crack  and  impact  resistance and have a  good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers  excellent  sealing  characteristics.
Set of micropipettors  (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 inverted confocal microscope	Leica	LSM780
Tissue cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscope	Leica	SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylin type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	CAUTION: Suspected of causing genetic defects.  Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffin Wax tek III	Sakura	4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	CAUTION: Triton X­100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution	Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution	To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.
Permeabilisation-blocking solution (PB solution)	The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X  (1:10) solution	PB:PBS-1X  (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software	Indicalabs	NM 87114
Harmony software	PerkinElmer	HH17000010