Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

Summary

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire tridimensionnelle fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres, permettant ainsi la visualisation de leur morphologie, de leur composition de type cellulaire et de leurs interactions.

Abstract

Les modèles de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) in vitro, tels que les organoïdes et les sphéroïdes, sont des outils précieux pour de nombreuses applications, notamment le développement et la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et la médecine régénérative. Pour exploiter pleinement ces modèles, il est crucial de les étudier aux niveaux cellulaire et subcellulaire. Cependant, la caractérisation de tels modèles de culture cellulaire 3D in vitro peut être techniquement difficile et nécessite une expertise spécifique pour effectuer des analyses efficaces. Ici, cet article fournit des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire 3D in vitro fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres. Ces protocoles sont applicables à une grande variété d’organoïdes et de sphéroïdes qui diffèrent par leurs conditions de cellule d’origine, de morphologie et de culture. De la récolte de structures 3D à l’analyse d’images, ces protocoles peuvent être complétés en 4-5 jours. En bref, les structures 3D sont collectées, fixées et peuvent ensuite être traitées soit par incorporation de paraffine et coloration histologique / immunohistochimique, soit directement immunomarquées et préparées pour le nettoyage optique et la reconstruction 3D (profondeur de 200 μm) par microscopie confocale.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les progrès de la biologie des cellules souches et des technologies de culture 3D in vitro ont annoncé une révolution en biologie et en médecine. Les modèles cellulaires de plus grande complexité en 3D sont devenus très populaires car ils permettent aux cellules de se développer et d’interagir avec un cadre extracellulaire environnant, récapitulant étroitement les aspects des tissus vivants, y compris leur architecture, l’organisation cellulaire et les interactions, ou même les caractéristiques de diffusion. En tant que tels, les modèles de culture cellulaire 3D peuvent fournir des informations uniques sur le comportement des cellules dans les tissus en développement ou malades in vitro. Les organoïdes et les sphéroïdes sont tous deux des structures 3D multicellulaires, allant de plusieurs micromètres à quelques millimètres, et sont les structures 3D in vitro les plus importantes. Les deux peuvent être cultivés dans un échafaudage de support, y compris (i) des hydrogels dérivés d’animaux (extrait de membrane basale, collagène), de plantes (alginate/agarose) ou synthétisés à partir de produits chimiques, ou (ii) des matrices inertes contenant des pores pour favoriser la prolifération et la croissance cellulaires.

Les organoïdes et les sphéroïdes peuvent également se développer sans la présence d’un échafaudage de soutien en s’appuyant sur les cellules pour s’auto-assembler en grappes. Cela repose sur différentes techniques telles que l’utilisation de matériaux non adhésifs pour inhiber la fixation des cellules, la tension superficielle et la force gravitationnelle (par exemple, les techniques de goutte suspendue) ou la rotation circulaire constante des vaisseaux (par exemple, la culture de spinner). Dans tous les cas, ces techniques facilitent les interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour surmonter les limites de la culture cellulaire monocouche traditionnelle¹. Les termes « organoïdes » et « sphéroïdes » ont été utilisés de manière interchangeable dans le passé, mais il existe des différences clés entre ces deux modèles de culture cellulaire 3D. Les organoïdes sont des amas cellulaires 3D in vitro dérivés de cellules souches pluripotentes ou de cellules souches spécifiques aux tissus, dans lesquels les cellules s’auto-organisent spontanément en progéniteurs et types cellulaires différenciés et qui récapitulent au moins certaines fonctions de l’organe d’intérêt². Les sphéroïdes comprennent une gamme plus large de structures 3D multicellulaires formées dans des conditions non adhérentes et peuvent provenir d’une grande diversité de types cellulaires tels que les lignées cellulaires immortalisées ou les cellules primaires³. Par conséquent, inhérents à leurs origines intrinsèques de cellules souches, les organoïdes ont une propension plus élevée à l’auto-assemblage, à la viabilité et à la stabilité que les sphéroïdes.

Néanmoins, en substance, ces deux modèles sont des structures 3D composées de multiples cellules, et les techniques développées pour les étudier sont donc très similaires. Par exemple, des approches d’imagerie puissantes au niveau de résolution d’une seule cellule sont nécessaires pour sonder la complexité cellulaire des organoïdes et des sphéroïdes. Ici, en résumant l’expertise de ce groupe et celle des leaders dans le domaine des organoïdes⁴, cet article décrit en détail les procédures pour effectuer la coloration, l’imagerie et les analyses bidimensionnelles (2D) et 3D à montage entier de la composition cellulaire et subcellulaire et de l’organisation spatiale des organoïdes et des sphéroïdes allant de 100 μm à plusieurs millimètres. En effet, cette procédure présente deux types différents et complémentaires de coloration et d’acquisition d’imagerie pour analyser une grande variété de tailles et de types de modèles de culture cellulaire 3D in vitro. L’utilisation de l’un (analyse 3D monture entière) ou de l’autre (analyse de coupe 2D) dépendra du modèle étudié et des réponses recherchées. L’analyse 3D à montage entier par microscopie confocale peut, par exemple, être appliquée pour visualiser des cellules en culture 3D jusqu’à 200 μm de profondeur, quelle que soit la taille globale de la structure 3D, tandis que l’analyse de coupes 2D fournit des informations sur des échantillons de toute taille, bien qu’au niveau 2D. Cette procédure a été appliquée avec succès à une variété d’organoïdes^4,5 et de sphéroïdes dérivés de cellules humaines et murines^, provenant de différentes couches germinales embryonnaires. La figure 1 présente un aperçu de la procédure. Les grandes étapes, les relations entre elles, les étapes décisives et le calendrier prévu sont indiqués.

Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la procédure. Des modèles de culture cellulaire 3D in vitro sont collectés et fixés, puis préparés pour la coloration 3D sur support entier (option a) ou incorporés dans de la paraffine pour la coupe et la coloration 2D (option b). Pour les expériences de coloration 3D à montage entier, les structures 3D fixes sont immunomarquées après l’étape de fixation. Une étape optionnelle de nettoyage optique peut être effectuée pour améliorer la qualité d’imagerie et la profondeur de la microscopie optique en réduisant la diffusion de la lumière pendant le traitement de l’image. Les images sont capturées sur un microscope confocal inversé ou un système confocal à haut contenu et analysées à l’aide du logiciel approprié. Pour l’encastrement à la paraffine, les structures 3D sont directement traitées (option b.1 pour les grandes structures ≥ 400 μm) ou incluses dans un gel (b.2; petites structures ≤ 400 μm) pour la déshydratation et l’incorporation à la paraffine. Les blocs de paraffine sont ensuite coupés et colorés (coloration histologique ou immunochimique). Les images des coupes 2D sont obtenues sur un scanner numérique à lames ou un microscope droit et analysées sur une plate-forme d’analyse d’images à l’aide d’une analyse quantitative numérique rapide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

REMARQUE: Une perte de ≤25% du nombre initial de structures 3D doit être attendue lors des étapes impliquant les changements de réactifs et le lavage dans la procédure suivante. Prévoyez d’utiliser un nombre final d’au moins dix structures 3D, d’une taille allant de 100 à 500 μm, par condition testée pour effectuer des analyses d’images qualitatives et quantitatives. Si nécessaire, pour les structures plus grandes, coupez les extrémités des embouts de pipette de 1 mL pour éviter de casser les structures. Pour toutes les étapes, si la sédimentation de la structure 3D est trop longue, les cellules peuvent être filées doucement à 50 × g pendant 5 min à température ambiante (RT). Selon la question étudiée, les avantages / inconvénients d’une telle étape de rotation doivent être pris en compte, car la centrifugation peut compromettre la forme des structures 3D. Évitez de tourner à >100 × g.

1. Collecte et fixation de modèles de culture cellulaire 3D

REMARQUE: Veillez à ne pas aspirer les structures 3D, qui ne seront que faiblement fixées à la paroi du tube.

1. Récolte de modèles de culture cellulaire 3D intégrés dans une matrice
   REMARQUE : Cette section décrit la récupération de structures 3D cultivées dans des gouttes d’un extrait de membrane basale du sarcome murin d’Engelbreth-Holm-Swarm (BME), mais peut être adaptée à d’autres matrices. Voir la discussion pour les points cruciaux concernant l’ECM.
   1. Retirez le milieu de culture des puits sans perturber la matrice 3D. Préenduire l’intérieur et l’extérieur d’un embout de pipette de 1 mL avec des protéines (appelé embout préenduit de 1 mL ci-après) en trempant toute la longueur de l’embout dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (appelée solution PBS-BSA à 0,1 % ci-après ) et en pipetant 1 mL de cette solution de haut en bas deux fois.
      REMARQUE: Ce prérevêtement empêchera les cellules de coller à la pointe et minimisera toute perte.
   2. Préenduire l’intérieur d’un tube de centrifugeuse (15 mL) avec des protéines (appelé tube à centrifuger prérevêtu ci-après) en remplissant à plusieurs reprises avec une solution PBS-BSA à 0,1% et en vidant le tube.
      REMARQUE: Cela empêchera les cellules de coller au tube et minimisera toute perte.
   3. À l’aide de l’embout précouché de 1 mL, remettre délicatement en suspension les structures 3D du puits à l’aide de 1 mL de 1x PBS glacé et transférer doucement la suspension contenant les structures 3D dans le tube centrifugeuse prérevêtu.
   4. Ajouter doucement 13 ml de 1x PBS glacé et laisser les structures 3D sédimenter sur la glace pendant au moins 10 minutes.
      NOTE: Si nécessaire, faire tourner pendant 5 min à 50 × g à 4 °C. Évitez de faire tourner >100 × g, car cela compromettrait la forme des structures 3D.
   5. Retirez le surnageant. À l’aide d’une pointe précouchée de 1 mL, remettre doucement les structures 3D en suspension dans 1 mL de 1x PBS glacé. Répétez les étapes 1.1.4 à 1.1.5 pour obtenir une pastille homogène sans aucun résidu de matrice 3D.
      REMARQUE: L’élimination efficace de la matrice est influencée par le type de matrice, le nombre et la taille des structures 3D et nécessite une optimisation pour différentes conditions de culture. Pour les structures 3D cultivées en BME, la récupération de l’élimination de la matrice prend généralement 45 à 60 minutes.
   6. À l’aide d’une pointe précouchée de 1 mL, transférer la suspension 1 mL 1x PBS contenant les structures 3D dans un tube centrifugeuse précouché de 1,5 mL et passer à la section 1.3.
2. Récolte de modèles de culture cellulaire 3D flottants
   1. À l’aide d’une pointe précouchée de 1 mL, prélever et transférer soigneusement les structures 3D dans un tube centrifugeuse prérevêtu de 1,5 mL. Laisser les structures 3D sédimenter, ou tourner pendant 5 min à 50 × g à TA.
   2. Retirez le surnageant. À l’aide d’une pointe précouchée de 1 mL, remettre les structures 3D en suspension dans 1 mL de 1x PBS. Passez à la section 1.3.
3. Fixation de modèles de culture cellulaire 3D
   1. Laissez les structures 3D sédimenter. Retirez délicatement le surnageant; sous une hotte, remettre délicatement en suspension les structures 3D dans 1 mL de formol à l’aide d’un embout précouché de 1 mL.
      REMARQUE: Le formol contient du formaldéhyde, qui est dangereux. Manipuler le produit chimique dans une hotte chimique. Portez des gants en caoutchouc et des lunettes de sécurité.
   2. Incuber les structures 3D pendant 30 min à RT.
      REMARQUE: Une étape de fixation de 30 minutes avec du formol est nécessaire pour l’immunomarquage d’un large éventail de structures 3D (variant en taille, forme et origine). Cependant, en général, des temps de fixation plus longs (>3 h) sont mieux adaptés pour préserver la fluorescence des protéines rapporteures.
   3. Laisser les structures 3D sédimenter, ou tourner pendant 5 min à 50 × g à TA. Retirez délicatement le formol et remplacez-le par 1 mL de 1x PBS. Répétez cette étape de lavage dans 1x PBS deux fois. Conserver les échantillons à 4 °C et passer à la section 2 ou 3.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici et les cellules peuvent être maintenues à 4 ° C pour un stockage à long terme (>1 an).

2.3D coloration, imagerie et analyse de modèles de culture cellulaire 3D

REMARQUE: Comme les organoïdes sont fixés de manière lâche à la paroi du tube, manipulez-les doucement car tous les changements de réactifs suivants peuvent entraîner une perte d’échantillon. Avant de commencer, assurez-vous de la disponibilité des contrôles appropriés pour la coloration. Les témoins positifs et négatifs peuvent être des cellules, dans lesquelles la protéine d’intérêt est connue pour être surexprimée ou absente, respectivement. Incuber des échantillons sans anticorps primaire pour déterminer si le signal observé est dû à une liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. Comme certaines cellules ont tendance à afficher des niveaux élevés d’autofluorescence, utilisez des témoins dépourvus d’anticorps secondaires pour déterminer si la fluorescence observée provient de l’autofluorescence de fond. L’immunomarquage et la visualisation de rapporteurs fluorescents peuvent être combinés.

1. Coloration 3D de monture entière
   1. Préparer la solution de blocage de la perméabilisation (PB) en complétant 1x PBS avec 0,1%-1% d’un tensioactif non ionique (voir le tableau des matériaux), 1% de diméthylsulfoxyde, 1% BSA et 1% de sérum d’âne (ou de l’animal chez lequel les anticorps secondaires ont été élevés).
      NOTE: Optimiser soigneusement la concentration du tensioactif non ionique en fonction de la localisation de la cible: membrane (0-0,5%), cytoplasme (0,5-1%) et noyau (1%). Cette solution peut être conservée à 4°C jusqu’à 1 mois. BSA fonctionne généralement bien pour l’étape de blocage, mais en cas de bruit de fond élevé, effectuer un test empirique pour obtenir les meilleurs résultats possibles pour une combinaison donnée d’anticorps.
   2. Transférer les organoïdes du tube à centrifuger de 1,5 mL dans un tube de 0,5 mL à l’aide d’un embout précouché de 1 mL. Laissez les organoïdes sédimenter, retirez doucement le PBS 1x et remplacez-le par 0,5 mL de solution de PB. Incuber les organoïdes avec une légère agitation horizontale (30-50 rpm) pendant 1 h à TA.
   3. Laisser les organoïdes sédimenter, retirer délicatement la solution PB et laver deux fois dans 1 mL DE PBS-BSA 0,1% pendant 3 min.
      NOTE: Attendre 3 min permet aux structures de sédimenter au fond du tube.
   4. Retirer délicatement le PBS-BSA 0,1 % et ajouter 250 μL d’anticorps primaire dilué à la concentration appropriée dans la solution PB:1x PBS (1:10). Pour préparer 10 mL de PB:1x solution PBS (1:10), diluer 1 mL de solution PB dans 9 mL de 1x PBS. Incuber pendant 2-3 jours avec une légère agitation horizontale (30-50 rpm) à 4 °C.
      REMARQUE: Un temps d’incubation d’anticorps approprié est crucial pour une pénétration appropriée des anticorps car les structures 3D peuvent parfois atteindre de grandes tailles.
   5. Laissez les organoïdes sédimenter et retirez doucement la solution d’anticorps primaire. Laver 5x dans PBS-BSA 0,1% pendant 3 min par lavage puis 2x dans 1 mL PBS-BSA 0,1% pendant 15 min par lavage avec une agitation horizontale douce.
   6. Ajouter 250 μL d’anticorps secondaire dilué à 1:250 dans PB:1x solution PBS (1:10). Incuber pendant 24 h à 4°C avec une légère agitation horizontale (30-50 tr/min). Pour cette étape, protégez les échantillons de la lumière.
   7. Ajouter 250 μL de solution mère Hoechst 33342 (20 μM) dilué à 1:1000 dans PB:1x solution PBS (1:10) et incuber pendant encore 2 h à 4 °C avec une légère agitation horizontale (30-50 tr/min).
   8. Laisser les organoïdes sédimenter, et retirer délicatement la solution contenant l’anticorps secondaire + Hoechst 33342. Laver les organoïdes 5x dans 1 mL de 1x PBS pendant 3 min par lavage, puis 2x dans 1 mL de 1x PBS pendant 15 min par lavage avec une légère agitation horizontale (30-50 rpm).
      REMARQUE: Il est crucial de laver soigneusement les échantillons pour éviter le bruit de fond ou la perte de signal.
   9. Conservez les échantillons dans PBS à 4 °C jusqu’à l’acquisition de l’image. Passez à la section 2.2.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici, et les échantillons peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs mois, à l’abri de la lumière.
2. Préparation des échantillons pour l’imagerie confocale
   1. À l’aide d’une pointe préenduite de 1 mL, transférer soigneusement les organoïdes dans 50 μL du 1x PBS par puits dans une microplaque de polystyrène noir de 96 puits. Passez à l’étape 2.2.3 ou à la section 2.3.
      REMARQUE: À ce stade, l’échantillon peut être protégé de la lumière et conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
   2. Clairière
      REMARQUE: L’étape de nettoyage est facultative et peut être utilisée pour immunomarquer les organoïdes ou pour détecter la fluorescence endogène. Le nettoyage peut provoquer un rétrécissement de la structure 3D, mais ne modifie pas la morphologie générale, sauf pour les organoïdes sphériques monocouches avec de grandes lumières⁴. Pour ces organoïdes kystiques, sautez l’étape de nettoyage et effectuez une imagerie des tissus profonds⁶.
      1. Préparer une solution d’élimination glycérol-fructose à 2,5 M contenant 50 % v/v de glycérol, 11 % v/v d’eau distillée et 45 % p/v de fructose en mélangeant sur un agitateur magnétique au moins pendant une nuit jusqu’à ce que la solution soit complètement solubilisée et homogène. Conserver à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 mois.
      2. Enlevez autant de 1x PBS que possible sans toucher les organoïdes. Ajouter 200 μL de la solution de dégagement à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL après avoir retiré l’extrémité et remettre en suspension doucement pour éviter la formation de bulles. Incuber à RT pendant au moins 12 h et passer à la section 3.
         REMARQUE: Comme la solution de compensation est visqueuse, les petits volumes sont difficiles à manipuler. Pour faciliter la manipulation, assurez-vous que la solution est à RT et pipette lentement. Pour un nettoyage optimal, laisser l’échantillon sédimenter dans la solution de nettoyage pendant au moins 24 heures avant l’imagerie. Si des structures 3D flottent au moment de l’acquisition, effectuez une rotation facultative pendant 10 minutes à < 100 × g à RT, ou prévoyez plus de temps (un à plusieurs jours) pour les laisser sédimenter. Le protocole peut être interrompu à cette étape avant de passer à l’imagerie s’il est protégé de la lumière et stocké à 4 °C (pendant des semaines) ou -20 °C (pendant des mois).
3. Acquisition et analyse d’images
   REMARQUE: La technologie de sectionnement d’image sera nécessaire pour imager des structures 3D.
   1. Utilisez des microscopes confocaux et privilégiez les objectifs d’immersion avec une ouverture numérique (NA) plus élevée que l’air. Choisissez les objectifs d’agrandissement (10x, 20x, 40x) en fonction de la taille des structures 3D, de la reconstruction d’image (assemblage) et des solutions utilisées pour l’analyse.
   2. Lors de la sélection du mode d’acquisition, prendre en considération la profondeur de champ de l’objectif utilisé pour définir l’étape de l’empilement Z; permettent un rendu 3D optimal.
      REMARQUE: Les solutions d’analyse d’images varient et l’analyse devra être ajustée au logiciel utilisé. Par exemple, ce protocole d’analyse a été établi sur un logiciel d’analyse à haut contenu (voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire 1 pour plus de détails) et fournit des données sur la segmentation des objets, le calcul des propriétés et la sélection de la population cellulaire dans un objet reconstruit en 3D.

3. Sectionnement, coloration, imagerie et analyse 2D de modèles de culture cellulaire 3D

REMARQUE: Les modèles de culture cellulaire 3D varient en taille. Passez à la section 3.1 ou 3.2 pour un enrobage efficace de la paraffine (figure 2). Prévoyez suffisamment de temps pour la sédimentation 3D de la structure avant tout lavage et changement de réactif. Attention à ne pas aspirer les organoïdes qui flotteront au fond du tube. Pour l’incorporation de paraffine, reportez-vous à la figure 2 pour obtenir des conseils.

1. Intégration à la paraffine de grands modèles de culture cellulaire 3D (Ø ≥ 400 μm)
   1. La veille de l’encastrement, préchauffez deux flacons de 150 ml remplis de paraffine (bains de paraffine), d’un petit moule d’enrobage métallique par échantillon et de pinces fines à 65 °C.
   2. À l’aide d’un embout précouché de 1 mL, transférer soigneusement les organoïdes dans 1x PBS dans un tube de verre à fond plat avec un bouchon de bouteille doublé de polytétrafluoroéthylène. Laissez les organoïdes sédimenter, retirez soigneusement le 1x PBS et remplacez-le par de l’éthanol à 70%. Incuber pendant au moins 30 min.
   3. Laissez les organoïdes sédimenter et retirez soigneusement l’éthanol à 70%. Remplacez-le par 1 mL de solution d’éosine Y prête à l’emploi. Agiter le tube et tacher pendant au moins 30 minutes. Retirer délicatement la solution d’éosine et déshydrater les organoïdes en trois lavages successifs avec 1 mL d’éthanol à 100% pendant ~30 min chacun.
      REMARQUE : L’éthanol, un liquide inflammable et volatil, provoque une grave irritation des yeux et des voies respiratoires. Manipulez-le dans une hotte et portez des lunettes de protection.
   4. Retirer soigneusement l’éthanol à 100% et, sous une hotte chimique, éliminer les organoïdes en 3 lavages successifs avec 1 mL de xylène pendant ~30 min chacun.
      REMARQUE: Le xylène est un liquide toxique inflammable dont les vapeurs peuvent provoquer une irritation. Manipulez-le dans une hotte. Évitez tout contact direct avec la peau et portez des gants en caoutchouc et des lunettes de protection.
   5. Sous une hotte chimique, préparez une cassette de tissu microtwin blanc en plaçant un morceau de tampon de biopsie (préalablement imbibé de xylène) à l’intérieur de l’un des compartiments de la cassette. Transférer délicatement les structures 3D à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique précouchée de 2 ml sur le tampon de biopsie. Couvrez-les d’un autre tampon de biopsie imbibé de xylène pour empêcher les organoïdes de bouger et fermez la cassette.
   6. Si plusieurs échantillons sont traités, placer la cassette dans un bain de xylène en attendant la poursuite du traitement. Une fois tous les échantillons transférés dans des cassettes, placer les cassettes dans un bain de paraffine préchauffé pendant 30 minutes à 65 °C. Transférer les cassettes dans un bain de paraffine fraîchement préchauffée pendant la nuit.
   7. Après l’imprégnation à la paraffine, prenez un moule d’encastrement préchauffé et ajoutez-y la paraffine chauffée. Placez le tampon de biopsie contenant les structures 3D dans le moule et agitez-le doucement jusqu’à ce que tous les organoïdes tombent au fond du moule. Placez très soigneusement les structures 3D au centre du moule à l’aide de pinces fines préchauffées. Passez à la section 3.3.
      REMARQUE: Veillez à ne pas perturber les structures 3D avec les pinces; Poussez, mais ne les pincez pas.
2. Intégration à la paraffine de petits modèles de culture cellulaire 3D (Ø ≤ 400 μm)
   1. La veille de l’encastrement, préchauffez deux flacons de 150 ml remplis de paraffine (bains de paraffine), d’un petit moule d’enrobage métallique par échantillon et de pinces fines à 65 °C.
   2. Retirez délicatement le 1x PBS de la suspension organoïde. Effectuer délicatement 3 lavages dans 1 mL de 1x solution saline tamponnée Tris (TBS). Enlevez autant de 1x TBS que possible sans toucher les organoïdes.
      REMARQUE: Veillez à ne pas aspirer l’échantillon. Si nécessaire, effectuez un spin de 5 min à 50 x g à TA. Les traces restantes de phosphate interféreront avec les étapes suivantes, empêchant notamment la polymérisation du gel. Par conséquent, n’utilisez pas de solutions PBS pendant une étape de traitement. Pour cette étape, une trousse commerciale, contenant des cassettes, le réactif #1 (fluide clair) et le réactif #2 (fluide coloré), a été utilisée pour faciliter la procédure d’incorporation de paraffine sans perdre de minuscules fragments (voir le tableau des matériaux). Suivez les instructions du kit. Les cassettes sont préassemblées avec des papiers de support et des inserts de carton déjà en place.
   3. Ajouter 2 gouttes de réactif #2 dans le tube, et mélanger doucement en tapotant le tube. Ajouter 2 gouttes de réactif #1, et mélanger à nouveau en tapotant pour solidifier le gel. À l’aide de la pince fine, retirez le gel du tube et placez-le dans le puits de la cassette.
   4. Sous la hotte, déshydrater l’échantillon en plaçant la cassette dans des bains successifs comme suit (utiliser les fioles de 150 mL et utiliser de l’éthanol frais ou du xylène pour chaque bain) : éthanol 70 %, 30 min; éthanol 96%, 30 min; éthanol 100%, trois lavages, 30 min chacun; xylène, trois lavages, 30 min chacun.
   5. Placer les cassettes dans un bain de paraffine préchauffé pendant 30 min à 65 °C et les transférer dans un bain de paraffine fraîchement préchauffé pendant la nuit. Après l’imprégnation à la paraffine, prenez un moule d’encastrement préchauffé et ajoutez-y de la paraffine chauffée. Ouvrez la cassette, délogez soigneusement le gel avec une pince fine et placez le gel contenant les structures 3D au centre du moule d’enrobage. Passez à la section 3.3.
3. Étapes courantes pour l’incorporation de paraffine
   1. Transférez doucement le moule dans une zone froide pour laisser la paraffine se solidifier en une fine couche, ce qui maintiendra les structures 3D dans la position appropriée. Ajoutez une cassette de mouchoir sur le moule et ajoutez de la paraffine chaude pour couvrir cette cassette en plastique. Retirez le moule une fois qu’il est complètement solidifié et passez à la section 3.4.
      REMARQUE: Les blocs de paraffine peuvent être conservés à température ambiante pendant des années.

Figure 2 : Vue d’ensemble de la procédure d’incorporation à la paraffine de modèles de culture cellulaire 3D in vitro, grands et petits.
A) Procédure standard pour l’incorporation de paraffine. Après fixation et déshydratation, les structures 3D sont colorées à l’éosine pour faciliter leur visualisation (en haut et en bas à gauche). Les structures 3D sont soigneusement placées sur le tampon de biopsie (bleu) dans la cassette à l’aide d’une pipette Pasteur de 2 ml (milieu). Après l’imprégnation à la paraffine, les structures 3D sont doucement déposées dans la paraffine liquide à l’aide d’une pince et doucement agitées dans le tampon de biopsie. Les petites structures 3D sont perdues au cours de cette étape car elles ne peuvent pas être libérées du pad (en bas à droite : échec de l’intégration). Seules les grandes structures 3D seront intégrées (en haut à droite : intégration réussie). Les pointes de flèches pointent vers des cultures 3D. (B) Alternative au protocole standard d’incorporation de paraffine. Après avoir fixé de petites structures 3D, un kit commercial est utilisé pour maintenir les cellules dans un gel et faciliter leur transfert dans le moule après imprégnation à la paraffine (à droite : encastrement réussi). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Sectionnement et coloration des blocs
   1. Couper des sections de 4 μm à l’aide d’un microtome standard et exécuter des techniques histologiques et immunohistochimiques standard. Passez à la section 3.5.
      REMARQUE : Des diapositives spécifiques (voir le tableau des matériaux) ont été utilisées pour une meilleure adhérence des sections. Les lames peuvent être conservées à température ambiante ou à 4 °C pendant des années.
5. Acquisition et analyse d’images
   1. Effectuez des images à l’aide d’un scanner numérique à lames ou d’un microscope droit, et analysez les données à l’aide d’une plate-forme d’analyse quantitative numérique rapide qui rapporte les données morphologiques et d’expression multiplexées cellule par cellule sur des sections entières de structure 3D (voir la figure supplémentaire 2 pour plus de détails).
      REMARQUE : L’objectif 20x est utilisé couramment par ce groupe.

Representative Results

Ce protocole fournit une vue d’ensemble des étapes critiques pour la coloration 2D et 3D à monture entière, ainsi que l’imagerie et les analyses quantitatives de modèles de culture cellulaire 3D (Figure 3 et Figure 4). Il est applicable à un large éventail de modèles de culture cellulaire 3D - des sphéroïdes aux organoïdes de différentes espèces ou tissus hôtes - et permet l’acquisition d’informations précises et quantitatives sur l’architecture, l’organisation cellulaire et les interactions aux niveaux cellulaire et subcellulaire (Figure 3 et Figure 4). Les laboratoires peuvent avoir besoin d’optimiser les techniques histologiques et immunohistochimiques 2D et les concentrations d’anticorps en fonction de leurs propres besoins.

Les deux méthodes fournissent des informations biologiques précieuses. La coloration 3D à montage entier et la microscopie confocale fournissent des informations visuelles sur la composition cellulaire et la position spatiale avec un champ de profondeur allant jusqu’à 200 μm (Figure 3B). Cependant, la coupe 2D est pratique pour les grandes structures 3D afin de révéler des traits morphologiques cellulaires détaillés dans toute la section des structures 3D qui peuvent être autrement difficiles à observer in situ en raison de la diffusion de la lumière qui compromet la résolution dans des échantillons plus grands. De plus, les deux techniques peuvent fournir des données quantitatives. En effet, la résolution obtenue permet l’application d’algorithmes de segmentation cellulaire et subcellulaire pour la quantification du nombre de cellules et la détection de la présence de divers marqueurs cellulaires dans différents sous-types cellulaires (Figure 3F et Figure 4). En résumé, les techniques d’imagerie décrites ici sont reproductibles, simples et complémentaires et représentent des outils précieux pour étudier l’hétérogénéité cellulaire.

Figure 3 : Résultats représentatifs pour le montage entier 3D, l’imagerie et les analyses de coupes optiques 3D et 2D. (A) Images confocales de sphéroïdes de gliome humain (h) de haut grade cultivés pendant une semaine et marqués avec Hoechst (bleu), Olig2 (jaune) et Actine (rouge) (objectif d’eau 20x). Pour toutes les images acquises, les réglages du microscope ont été établis à l’aide d’un témoin positif (en haut), puis le contrôle négatif a été imagé en utilisant des paramètres identiques pour contrôler le manque de fluorescence en l’absence d’anticorps primaire (en bas). (B) Représentation orthogonale 3D intégrale de la coloration Ki67 réalisée dans (h) un sphéroïde de gliome de haut grade cultivé pendant une semaine (élimination glycérol-fructose; objectif eau 20x, confocale). (C) Images confocales de (h) gliome sphéroïde de haut grade cultivé pendant une semaine et marqué avec Hoechst (bleu), Olig2 (jaune) et Phalloidine-488 (vert) (élimination glycérol-fructose; objectif 20x eau). (D) Images confocales de sphéroïdes humains (h) rhabdomyosarcomes (en haut) et de souris (m) à cellules de crête neurale (en bas) cultivées pendant une semaine et marquées avec Hoechst (bleu), Actine (rouge) et Ki67 (vert), respectivement (élimination glycérol-fructose; objectif sec 20x). (E) Images confocales de (h) gliome sphéroïde de haut grade cultivé pendant une semaine et étiqueté avec Hoechst (bleu) et Ki67 (vert) (élimination glycérol-fructose; objectif 40x eau) (en haut à gauche). Des images segmentées sur le canal de Hoechst et des régions nucléaires Ki67-positives (+) sur le canal vert ont été générées à l’aide d’un logiciel d’analyse à haut contenu (voir la figure supplémentaire 1 et le tableau des matériaux) (en bas). La sortie donnée est le pourcentage de noyaux Ki67⁺ par structure 3D segmentée (en haut à droite). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats représentatifs pour l’imagerie et l’analyse de coupes optiques 2D. (A, D) Images de coupe 2D d’un modèle cellulaire 3D (sphéroïdes de rhabdomyosarcome humain cultivés pendant un mois) obtenues avec un scanner numérique de lames et analysées sur une plate-forme d’analyse quantitative numérique rapide. (A) Coloration H&E et détection des cellules en fonction de leur taille. Barre d’échelle = 500 μm. (B) L’histogramme montre le pourcentage de cellules < 100 μm 2 et > 100 μm² détectées à l’aide d’un logiciel d’analyse quantitative numérique rapide (à gauche : Halo) ou de comptage manuel (à droite : MC). (C) Coloration Ki67 et détection des cellules en fonction de l’intensité de leur signal 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Négatif (bleu), faiblement positif (jaune), positif (rouge). Barre d’échelle = 500 μm. (D) L’histogramme montre le pourcentage de cellules Ki67-négatives, faiblement positives et positives. Abréviations : H & E = hématoxyline et éosine; MC = comptage manuel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Vue d’ensemble des étapes du logiciel d’analyse d’imagerie. Les analyses sont basées sur l’association de blocs de construction. Chaque bloc de construction correspondant à une fonction - segmentation, calcul, association, définition de sortie - et offre plusieurs algorithmes et sélections de variables pour correspondre à l’échantillon biologique en cours d’image. Le logiciel fournit plusieurs protocoles d’analyse RMS (Ready Made Solution) qui peuvent facilement être utilisés et modifiés. Les protocoles d’analyse d’images intégrés peuvent être enregistrés, appliqués à différents jeux de données et partagés entre les utilisateurs. En bref, le protocole d’analyse implique une segmentation séquentielle des objets : sphéroïdes, noyaux et enfin, poches Ki67 (A488). Ensuite, l’intensité moyenne des poches de Ki67 est calculée pour discriminer davantage les événements positifs. Enfin, les noyaux englobant les poches positives Ki67 sont sélectionnés positivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Vue d’ensemble des étapes de procédure du logiciel d’analyse quantitative. Étape 1. Téléchargez les fichiers à l’aide de l’onglet Études . Les fichiers seront ouverts dans la section Actions d’image . Étape 2. Ouvrez l’onglet Annotations , puis cliquez sur Actions de calque pour concevoir un nouveau calque tout autour de la structure à l’aide de l’outil cercle de la barre d’outils. Pour les structures non circulaires, l’outil Stylo peut être utilisé à la place. Étape 3. La barre d’outils peut être utilisée pour concevoir des annotations et visualiser la quantification avec l’outil . Étape 4. Ouvrez l’onglet Analyse et sélectionnez les meilleures conditions pour l’analyse de l’échantillon (plusieurs essais peuvent être nécessaires ici). Étape 4.1. Utilisez la section Sélection des taches pour configurer l’état de coloration. En cas de plusieurs taches, celles-ci peuvent être ajoutées et renommées, et la couleur virtuelle peut être modifiée. La détection de localisation peut être spécifiée-coloration nucléaire ou cytoplasme. Étape 4.2. Utilisez la section Détection de cellule pour configurer la détection de cellule . Cette section sera la plus importante pour l’analyse. La section Seuil de contraste nucléaire permettra la détection de tous les noyaux. Il faut faire attention au cas où il y aurait plusieurs tailles de population, le logiciel peut détecter plusieurs cellules au lieu d’une grande unique. Les sections Taille nucléaire et Agressivité de segmentation nucléaire peuvent être utilisées pour quantifier les fourchettes de taille de population cellulaire. Étape 5. Description de l’exécution de l’analyse des échantillons. Suivez les étapes indiquées dans la figure. La section Calque d’annotation exécutera le paramètre uniquement sur cette diapositive. La quantification peut être visualisée à l’aide de l’outil . Répétez les étapes 4.1 à 5 jusqu’à ce que la quantification appropriée soit atteinte. Étapes 6-6.1. Ces étapes vous permettent de dessiner une figure à l’aide du logiciel. Étape 7. Les graphiques de quantification obtenus via un logiciel peuvent être enregistrés. Étape 8. Les données peuvent être exportées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La culture cellulaire est un outil indispensable pour découvrir les mécanismes biologiques fondamentaux impliqués dans le développement, la fonction, la régénération et la perturbation des tissus et des organes, et la maladie. Bien que la culture cellulaire 2D monocouche ait prédominé, les recherches récentes se sont orientées vers des cultures générant des structures 3D reflétant davantage les réponses cellulaires in vivo, en raison notamment d’une organisation spatiale supplémentaire et de contacts cellule-cellule qui influencent l’expression des gènes et le comportement cellulaire et pourraient ainsi fournir des données plus prédictives⁷. Néanmoins, de nombreux défis demeurent, notamment le besoin de techniques de coloration et d’imagerie conviviales pour la visualisation microscopique détaillée et l’évaluation de structures 3D complexes aux niveaux cellulaire et subcellulaire. Dans ce contexte, des protocoles détaillés, robustes et complémentaires ont été fournis pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution cellulaire et subcellulaire de modèles de culture cellulaire 3D fixes in vitro allant de 100 μm à plusieurs millimètres.

Cette procédure présente deux stratégies différentes pour traiter une grande variété de tailles et de types de modèles de culture cellulaire 3D in vitro. Le choix de l’un (analyse 3D monture entière) ou de l’autre (analyse de sectionnement 2D) dépendra du modèle utilisé et du problème étudié. L’analyse 3D à monture entière par microscopie confocale permet de visualiser des cellules avec un champ de profondeur allant jusqu’à 200 μm, quelle que soit la taille globale de la structure 3D, tandis que la coupe 2D est applicable aux échantillons de toute taille, mais la visualisation reste dimensionnelle 2D. Vous trouverez ci-dessous quelques suggestions de dépannage et de considérations techniques.

La perte de structures 3D pendant le flux de travail est l’inconvénient le plus courant. Ils peuvent rester adhérents aux embouts et aux tubes, c’est pourquoi les embouts et tubes de prérevêtement avec une solution PBS-BSA à 0,1% sont essentiels. De plus, il est crucial de laisser les structures 3D sédimenter entre les changements de réactifs et d’effectuer tout le pipetage très soigneusement. Comme mentionné dans la procédure, pour toutes les étapes, si la sédimentation de la structure 3D est trop longue, les cellules peuvent être filées doucement à 50 × g pendant 5 min à TA. Selon l’objectif de l’étude, les avantages/inconvénients d’une telle étape de filature doivent être pris en compte car la centrifugation peut compromettre la forme des structures 3D. De plus, il faut veiller à préserver cette morphologie lors de l’étape de fixation car les organoïdes kystiques ont tendance à s’affaisser. La fixation de structures de moins de 400 μm devrait empêcher les changements structurels.

Pour un immunomarquage optimal, la récupération des organoïdes à partir de leurs matrices 3D est une étape cruciale. La matrice 3D peut empêcher une pénétration adéquate des anticorps ou entraîner une coloration de fond élevée en raison d’une liaison non spécifique à la matrice. L’élimination de la MEC peut modifier la morphologie des segments externes des organoïdes (notamment dans le cas de petites protubérances cellulaires s’étendant à partir de structures 3D étudiées) et entraver partiellement les analyses. Pour de telles structures 3D, la matrice peut être conservée tout au long de la procédure; Cependant, les conditions de culture doivent être soigneusement adaptées pour faire pousser des cellules dans une quantité minimale de matrice afin d’éviter une pénétration insuffisante des solutions et des anticorps et d’éviter les étapes successives de lavage visant à réduire le bruit de fond excessif ^6,8.

L’étape de dégagement optique décrite dans ce protocole dans la section de coloration 3D de montage entier est pertinente pour l’imagerie de structures 3D jusqu’à 150-200 μm de profondeur au lieu de 50-80 μm sans effacement. Par rapport à d’autres méthodes de compensation qui nécessitent souvent plusieurs semaines et utilisant des agents de compensation toxiques, une étape de nettoyage rapide et sûre publiée précédemment a été utilisée dans ce protocole ^4,9. De plus, cette étape de compensation est réversible, et de nouveaux anticorps peuvent être ajoutés à la coloration initiale sans perte de résolution ou de luminosité⁴. Néanmoins, selon le modèle de culture cellulaire 3D étudié, une profondeur de 150 à 200 μm pourrait ne pas être suffisante pour imager la structure 3D de manière informative, et ce protocole de nettoyage peut provoquer des changements dans la morphologie générale des organoïdes sphériques monocouches avec de grandes lumières⁴. Les utilisateurs doivent soigneusement concevoir leur expérience et, si nécessaire, optimiser le moment de l’étape de perméabilisation/blocage (pour permettre la pénétration des anticorps et de la solution), l’étape de dégagement (pour pénétrer à plus de 200 μm, les échantillons doivent être totalement effacés) et l’acquisition d’images. Les deux technologies les plus répandues disponibles dans les installations centrales seraient la microscopie à feuille légère et la microscopie confocale. Les utilisateurs devront choisir soigneusement une technologie en fonction de la taille de leurs structures 3D et de leur question biologique¹⁰. Cependant, par rapport à la microscopie confocale, la résolution de la microscopie à feuille de lumière obtenue pour de telles structures profondes reste sous-optimale pour obtenir une résolution subcellulaire.

Ici, un processus détaillé et robuste a été rapporté qui est dédié à l’incorporation de paraffine d’échantillons uniques. Fait intéressant, Gabriel et al. ont récemment développé un protocole intégrant des cultures cellulaires 3D dans de la paraffine avec un débit accru. Ils ont utilisé un moule polydiméthylsiloxane (PDMS) pour confiner 96 structures 3D dans un modèle de microréseau dans un seul bloc, offrant de nouvelles perspectives pour les études sur les modèles tumoraux 3D englobant plus de groupes, de points temporels, de conditions de traitement et de répliques¹¹. Cependant, cette méthode nécessite des compétences et des machines étendues, notamment pour la fabrication du prémoule utilisé pour créer les moules PDMS.

En résumé, cet article décrit deux approches différentes, complémentaires et adaptables permettant l’acquisition d’informations précises et quantitatives sur la composition architecturale et cellulaire des modèles cellulaires 3D. Ces deux paramètres sont cruciaux pour étudier les processus biologiques tels que l’hétérogénéité cellulaire intratumorale et son rôle dans la résistance aux traitements.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Biopsy pad Q Path blue	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin white	VWR	720-2183
Chemical hood	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fine forceps	Pyramid innovation	R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Excellent  for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontal agitation	N-BIOTEK	NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox molds 15x15	VWR	720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panoramic scan II	3dhistech	2397612
Paraffin embedding equipment	Leica	EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Good for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,  solid, provide excellent  stress  crack  and  impact  resistance and have a  good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers  excellent  sealing  characteristics.
Set of micropipettors  (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 inverted confocal microscope	Leica	LSM780
Tissue cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscope	Leica	SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylin type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	CAUTION: Suspected of causing genetic defects.  Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffin Wax tek III	Sakura	4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	CAUTION: Triton X­100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution	Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution	To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.
Permeabilisation-blocking solution (PB solution)	The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X  (1:10) solution	PB:PBS-1X  (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software	Indicalabs	NM 87114
Harmony software	PerkinElmer	HH17000010