Färgning och högupplöst avbildning av tredimensionella organoid- och sfäroidmodeller

Summary

Här tillhandahåller vi detaljerade, robusta och kompletterande protokoll för att utföra färgning och subcellulär upplösningsavbildning av fasta tredimensionella cellodlingsmodeller som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter, vilket möjliggör visualisering av deras morfologi, celltypskomposition och interaktioner.

Abstract

In vitro tredimensionella (3D) cellodlingsmodeller, såsom organoider och sfäroider, är värdefulla verktyg för många tillämpningar, inklusive utveckling och sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och regenerativ medicin. För att fullt ut utnyttja dessa modeller är det viktigt att studera dem på cellulära och subcellulära nivåer. Att karakterisera sådana in vitro 3D-cellodlingsmodeller kan dock vara tekniskt utmanande och kräver specifik expertis för att utföra effektiva analyser. Här tillhandahåller detta dokument detaljerade, robusta och kompletterande protokoll för att utföra färgning och subcellulär upplösningsavbildning av fasta in vitro 3D-cellodlingsmodeller som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter. Dessa protokoll är tillämpliga på en mängd olika organoider och sfäroider som skiljer sig åt i deras ursprungscell, morfologi och odlingsförhållanden. Från 3D-strukturskörd till bildanalys kan dessa protokoll slutföras inom 4-5 dagar. Kortfattat samlas 3D-strukturer, fixeras och kan sedan bearbetas antingen genom paraffinininbäddning och histologisk / immunhistokemisk färgning, eller direkt immunomärkta och förberedda för optisk clearing och 3D-rekonstruktion (200 μm djup) genom konfokalmikroskopi.

Introduction

Under de senaste decennierna har framsteg inom stamcellsbiologi och in vitro 3D-odlingsteknik förebådat en revolution inom biologi och medicin. Cellmodeller med högre komplexitet i 3D har blivit mycket populära eftersom de tillåter celler att växa och interagera med ett omgivande extracellulärt ramverk, nära rekapitulerande aspekter av levande vävnader inklusive deras arkitektur, cellorganisation och interaktioner, eller till och med diffusionsegenskaper. Som sådan kan 3D-cellodlingsmodeller ge unika insikter i beteendet hos celler i utvecklande eller sjuka vävnader in vitro. Organoider och sfäroider är båda multicellulära 3D-strukturer, som sträcker sig från flera mikrometer till millimeter, och är de mest framträdande in vitro 3D-strukturerna. Båda kan odlas i en stödjande ställning inklusive (i) hydrogeler härrörande från djur (basalmembranextrakt, kollagen), växter (alginat / agaros) eller syntetiseras från kemikalier, eller (ii) inerta matriser som innehåller porer för att främja cellproliferation och tillväxt.

Organoider och sfäroider kan också utvecklas utan närvaro av en stödjande ställning genom att förlita sig på celler för att självmontera i kluster. Detta bygger på olika tekniker såsom användning av icke-vidhäftande material för att hämma cellfästning, ytspänning och gravitationskraft (t.ex. hängande dropptekniker) eller konstant cirkulär rotation av kärl (t.ex. spinnkultur). I samtliga fall underlättar dessa tekniker cell-cell och cell-matrisinteraktioner för att övervinna begränsningarna i traditionell monolagercellodling¹. Termerna "organoider" och "sfäroider" har använts omväxlande tidigare, men det finns viktiga skillnader mellan dessa två 3D-cellodlingsmodeller. Organoider är in vitro 3D-cellulära kluster härledda från pluripotenta stamceller eller vävnadsspecifika stamceller, där celler spontant självorganiserar sig i förfäder och differentierade celltyper och som rekapitulerar åtminstone vissa funktioner hos det organ som är av intresse². Sfäroider innefattar ett bredare spektrum av multicellulära 3D-strukturer bildade under icke-vidhäftande förhållanden och kan uppstå från en stor mångfald av celltyper, såsom odödliga cellinjer eller primära celler³. Organoider har därför en högre benägenhet för självmontering, livskraft och stabilitet än sfäroider.

Ändå är dessa två modeller i huvudsak 3D-strukturer som består av flera celler, och de tekniker som utvecklats för att studera dem är således mycket lika. Till exempel är kraftfulla avbildningsmetoder på encellsupplösningsnivå nödvändiga för att undersöka den cellulära komplexiteten hos både organoider och sfäroider. Här, genom att sammanfatta denna grupps expertis och ledare inom organoider⁴, beskriver detta dokument detaljerade procedurer för att utföra tvådimensionell (2D) och 3D helmonterad färgning, avbildning och analyser av den cellulära och subcellulära sammansättningen och rumsliga organisationen av organoider och sfäroider som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter. Faktum är att denna procedur presenterar två olika och komplementära typer av färgning och bildförvärv för att analysera en mängd olika storlekar och typer av in vitro 3D-cellodlingsmodeller. Användningen av den ena (3D-helmonteringsanalys) eller den andra (2D-sektionsanalys) beror på den studerade modellen och de sökta svaren. 3D-helmonteringsanalys med konfokalmikroskopi kan till exempel tillämpas för att visualisera celler i 3D-kultur upp till 200 μm djup, oavsett 3D-strukturens totala storlek, medan analysen av 2D-sektioner ger insikter i prover av alla storlekar, om än på 2D-nivå. Denna procedur har framgångsrikt tillämpats på en mängd olika organoider^4,5 och sfäroider härrörande från humana och murina celler^, som härrör från olika embryonala könslager. Översikten över förfarandet visas i figur 1. De stora stadierna, relationerna mellan dem, avgörande steg och den förväntade tidpunkten anges.

Figur 1: Schematisk översikt över förfarandet. In vitro 3D-cellodlingsmodeller samlas in och fixeras, sedan antingen förberedda för 3D-helmonteringsfärgning (alternativ a) eller inbäddade i paraffin för 2D-snittning och färgning (alternativ b). För 3D-färgningsexperiment med helmontering immunmärks fasta 3D-strukturer efter fixeringssteget. Ett valfritt optiskt rensningssteg kan utföras för att förbättra bildkvaliteten och djupet i optisk mikroskopi genom att minska ljusspridningen under bildbehandling. Bilder fångas på ett inverterat konfokalmikroskop eller ett konfokalt höginnehållssystem och analyseras med lämplig programvara. För paraffininbäddning bearbetas 3D-strukturer direkt (alternativ b.1 för stora strukturer ≥ 400 μm) eller ingår i en gel (b.2; små strukturer ≤ 400 μm) för dehydrering och paraffininbäddning. Paraffinblock skärs sedan och färgas (histologisk eller immunokemisk färgning). Bilder av 2D-sektioner erhålls på en digital bildskanner eller ett upprätt mikroskop och analyseras på en bildanalysplattform med snabb digital kvantitativ analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

OBS: En förlust på ≤25% av det ursprungliga antalet 3D-strukturer bör förväntas under stegen som involverar reagensbyte och tvättning i följande procedur. Planera att använda ett slutligt antal av minst tio 3D-strukturer, med en storlek från 100 till 500 μm, per testat tillstånd för att utföra kvalitativa och kvantitativa bildanalyser. Om det behövs, för större strukturer, skär ändarna på 1 ml pipettspetsar för att undvika att bryta strukturerna. För alla steg, om 3D-struktursedimentering är för lång, kan celler försiktigt snurras vid 50 × g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Beroende på vilken fråga som undersöks bör fördelar/nackdelar med ett sådant spinnsteg övervägas, eftersom centrifugering kan äventyra formen på 3D-strukturerna. Undvik att snurra vid > 100 × g.

1. Insamling och fixering av 3D-cellodlingsmodeller

OBS: Var försiktig så att du inte aspirerar 3D-strukturerna, som bara är löst fästa vid rörväggen.

1. Skörd av 3D-cellodlingsmodeller inbäddade i en matris
   OBS: Detta avsnitt beskriver återhämtningen av 3D-strukturer odlade i droppar av ett basalmembranextrakt från murin Engelbreth-Holm-Swarm sarkom (BME), men kan anpassas till andra matriser. Se diskussionen för viktiga punkter angående ECM.
   1. Ta bort odlingsmediet från brunnarna utan att störa 3D-matrisen. Förbelägg insidan och utsidan av en 1 ml pipettspets med protein (nedan kallad förbelagd 1 ml spets ) genom att doppa hela spetsens längd i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffrad saltlösning ( PBS) (kallad PBS-BSA 0,1% lösning nedan) och pipettera 1 ml av denna lösning upp och ner två gånger.
      OBS: Denna förbeläggning förhindrar att cellerna fastnar på spetsen och minimerar eventuell förlust.
   2. Förbelägg insidan av ett centrifugrör (15 ml) med protein (nedan kallat förbelagt centrifugrör ) genom att upprepade gånger fylla på PBS-BSA 0,1% lösning och tömma röret.
      OBS: Detta förhindrar att cellerna fastnar på röret och minimerar eventuell förlust.
   3. Använd den förbelagda 1 ml spetsen, återsuspendera försiktigt brunnens 3D-strukturer med 1 ml iskall 1x PBS och överför försiktigt suspensionen som innehåller 3D-strukturerna till det förbelagda centrifugröret.
   4. Tillsätt försiktigt 13 ml iskall 1x PBS och låt 3D-strukturerna sedimentera på is i minst 10 minuter.
      OBS: Om det behövs, snurra i 5 minuter vid 50 × g vid 4 °C. Undvik att snurra >100 × g, eftersom detta kommer att äventyra formen på 3D-strukturerna.
   5. Ta bort supernatanten. Använd en förbelagd 1 ml spets, försiktigt resuspendera 3D-strukturerna i 1 ml iskall 1x PBS. Upprepa steg 1.1.4 till 1.1.5 för att erhålla en homogen pellet utan någon 3D-matrisrest.
      OBS: Effektiv matrisborttagning påverkas av typen av matris, antalet och storleken på 3D-strukturer och kräver optimering för olika odlingsförhållanden. För 3D-strukturer odlade i BME tar återhämtningen från matrisavlägsnandet vanligtvis 45-60 minuter.
   6. Använd en förbelagd 1 ml spets, överför 1 ml 1x PBS-suspensionen som innehåller 3D-strukturerna till ett förbelagt 1,5 ml centrifugrör och fortsätt med avsnitt 1.3.
2. Skörda flytande 3D-cellodlingsmodeller
   1. Använd en förbelagd 1 ml spets, samla försiktigt upp och överför 3D-strukturerna till ett förbelagt 1,5 ml centrifugrör. Låt 3D-strukturerna sedimentera, eller snurra i 5 minuter vid 50 × g vid RT.
   2. Ta bort supernatanten. Använd en förbelagd 1 ml spets, resuspendera 3D-strukturerna i 1 ml 1x PBS. Fortsätt med avsnitt 1.3.
3. Fixering av 3D-cellodlingsmodeller
   1. Låt 3D-strukturerna sedimentera. Ta försiktigt bort supernatanten; under ett dragskåp, återsuspendera försiktigt 3D-strukturerna i 1 ml formalin med en förbelagd 1 ml spets.
      OBS: Formalin innehåller formaldehyd, vilket är farligt. Manipulera kemikalien i en kemisk huva. Använd gummihandskar och skyddsglasögon.
   2. Inkubera 3D-strukturerna i 30 minuter vid rumstemperatur.
      OBS: Ett 30 minuters fixeringssteg med formalin krävs för immunfärgning av ett brett spektrum av 3D-strukturer (varierande i storlek, form och ursprung). I allmänhet är dock längre fixeringstider (>3 timmar) bättre lämpade för att bevara fluorescensen hos rapportproteiner.
   3. Låt 3D-strukturerna sedimentera, eller snurra i 5 minuter vid 50 × g vid RT. Ta försiktigt bort formalinet och ersätt det med 1 ml 1x PBS. Upprepa detta tvättsteg i 1x PBS två gånger. Förvara proverna vid 4 °C och fortsätt med avsnitt 2 eller avsnitt 3.
      OBS: Protokollet kan pausas här, och cellerna kan hållas vid 4 ° C för långvarig lagring (>1 år).

2.3D färgning, avbildning och analys av 3D-cellodlingsmodeller

OBS: Eftersom organoiderna är löst fästa vid rörväggen, hantera dem försiktigt eftersom alla följande reagensförändringar kan orsaka provförlust. Innan du börjar, se till att det finns rätt kontroller för färgning. Positiva och negativa kontroller kan vara celler, där proteinet av intresse är känt för att vara antingen överuttryckt respektive frånvarande. Inkubera prover utan den primära antikroppen för att avgöra om den observerade signalen beror på icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen. Eftersom vissa celler tenderar att visa höga nivåer av autofluorescens, använd kontroller utan sekundär antikropp för att avgöra om den observerade fluorescensen kommer från bakgrundsautofluorescens. Immunolabeling och fluorescerande reportervisualisering kan kombineras.

1. 3D-färgning av hela fästet
   1. Bered den permeabiliseringsblockerande lösningen (PB) genom att komplettera 1x PBS med 0,1% -1% av ett icke-joniskt ytaktivt medel (se materialtabellen), 1% dimetylsulfoxid, 1% BSA och 1% åsneserum (eller från djuret i vilket de sekundära antikropparna höjdes).
      OBS: Optimera noggrant koncentrationen av det icke-joniska ytaktiva ämnet beroende på lokaliseringen av målet: membran (0-0,5%), cytoplasma (0,5-1%) och kärna (1%). Denna lösning kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad. BSA fungerar vanligtvis bra för blockeringssteget, men vid högt bakgrundsbrus, utför ett empiriskt test för att få bästa möjliga resultat för en given kombination av antikroppar.
   2. Överför organoiderna från 1,5 ml centrifugröret till ett 0,5 ml rör med en förbelagd 1 ml spets. Låt organoiderna sedimentera, ta försiktigt bort 1x PBS och ersätt den med 0,5 ml PB-lösning. Inkubera organoiderna med mild horisontell omrörning (30-50 rpm) i 1 h vid RT.
   3. Låt organoiderna sedimentera, ta försiktigt bort PB-lösningen och tvätta två gånger i 1 mL PBS-BSA 0,1% i 3 min.
      OBS: Att vänta i 3 minuter gör att strukturerna kan sedimentera i botten av röret.
   4. Ta försiktigt bort PBS-BSA 0,1% och tillsätt 250 μL primär antikropp utspädd i lämplig koncentration i PB: 1x PBS (1:10) lösning. För att bereda 10 ml PB: 1x PBS (1:10) lösning, späd 1 ml PB-lösning i 9 ml 1x PBS. Inkubera i 2–3 dagar med mild horisontell omrörning (30–50 varv/min) vid 4 °C.
      OBS: En lämplig antikroppsinkubationstid är avgörande för en lämplig antikroppspenetration eftersom 3D-strukturer ibland kan nå stora storlekar.
   5. Låt organoiderna sedimentera och ta försiktigt bort den primära antikroppslösningen. Tvätta 5x i PBS-BSA 0,1% i 3 min per tvätt och sedan 2x i 1 mL PBS-BSA 0,1% i 15 min per tvätt med mild horisontell omrörning.
   6. Tillsätt 250 μl sekundär antikropp utspädd vid 1:250 i PB:1x PBS (1:10) lösning. Inkubera i 24 timmar vid 4 °C med mild horisontell omrörning (30-50 rpm). För detta steg, skydda proverna från ljus.
   7. Tillsätt 250 μl Hoechst 33342 (20 μM stamlösning) utspädd vid 1:1000 i PB:1x PBS (1:10)-lösning och inkubera i ytterligare 2 timmar vid 4 °C med mild horisontell omrörning (30–50 varv/min).
   8. Låt organoiderna sedimentera och ta försiktigt bort lösningen innehållande sekundär antikropp + Hoechst 33342. Tvätta organoiderna 5x i 1 ml 1x PBS i 3 min per tvätt och sedan 2x i 1 ml 1x PBS i 15 min per tvätt med mild horisontell omrörning (30-50 rpm).
      OBS: Det är viktigt att tvätta proverna i stor utsträckning för att undvika bakgrundsbrus eller signalförlust.
   9. Förvara proverna i PBS vid 4 °C tills bilden hämtas. Fortsätt med avsnitt 2.2.
      OBS: Protokollet kan pausas här, och proverna kan förvaras vid 4 ° C i flera månader, skyddade från ljus.
2. Provberedning för konfokal avbildning
   1. Använd en förbelagd 1 ml spets, överför försiktigt organoiderna till 50 μL av 1x PBS per brunn i en 96-brunns svart polystyrenmikroplatta. Fortsätt med steg 2.2.3 eller avsnitt 2.3.
      OBS: I detta skede kan provet skyddas från ljus och förvaras vid 4 ° C i många veckor.
   2. Glänta
      OBS: Clearingsteget är valfritt och kan användas för att antingen immunmärka organoider eller för att detektera endogen fluorescens. Rensning kan orsaka krympning av 3D-strukturen, men ändrar inte den allmänna morfologin förutom sfäriska monoskiktade organoider med stora lumen⁴. För dessa cystiska organoider, hoppa över rensningssteget och utför djupvävnadsavbildning⁶.
      1. Bered 2,5 M glycerol-fruktosrensningslösning innehållande 50% v/v glycerol, 11% v/v destillerat vatten och 45% w/v fruktos genom att blanda på en magnetomrörare åtminstone över natten tills lösningen är fullständigt löslig och homogen. Förvaras vid 4 °C i mörker i upp till 1 månad.
      2. Ta bort så mycket 1x PBS som möjligt utan att röra organoiderna. Tillsätt 200 μL av rensningslösningen med en 1 ml pipettspets efter att änden har tagits bort och suspendera försiktigt för att förhindra att bubblor bildas. Inkubera vid rumstemperatur i minst 12 timmar och fortsätt med avsnitt 3.
         OBS: Eftersom clearinglösningen är viskös är små volymer svåra att hantera. För att underlätta hanteringen, se till att lösningen är vid rumstemperatur och pipettera långsamt. För optimal röjning, låt provet sedimentera i rensningslösningen i minst 24 timmar före avbildning. Om 3D-strukturer flyter vid förvärvstillfället, utför en valfri snurrning i 10 minuter vid < 100 × g vid RT, eller ge mer tid (en till flera dagar) för att låta dem sedimentera. Protokollet kan pausas i detta steg innan du fortsätter till avbildning om det skyddas från ljus och lagras vid 4 ° C (i veckor) eller -20 ° C (i månader).
3. Bildinsamling och analys
   OBS: Bildsektionsteknik kommer att krävas för att avbilda 3D-strukturer.
   1. Använd konfokalmikroskop och föredra nedsänkningsmål med högre numerisk bländare (NA) jämfört med luft. Välj förstoringsmål (10x, 20x, 40x) beroende på storleken på 3D-strukturer, bildrekonstruktion (sömnad) och lösningar som används för analysen.
   2. När du väljer förvärvsläge, ta hänsyn till fokusdjupet för målet som används för att definiera steget för Z-stapling; möjliggör optimal 3D-rendering.
      OBS: Bildanalyslösningar varierar, och analysen måste anpassas till den programvara som används. Till exempel etablerades detta analysprotokoll på en programvara för analys med högt innehåll (se Materialtabell och kompletterande figur 1 för detaljer) och ger data om objektsegmentering, beräkning av egenskaper och cellpopulationsval inom ett 3D-rekonstruerat objekt.

3. 2D-sektionering, färgning, avbildning och analys av 3D-cellodlingsmodeller

OBS: 3D-cellodlingsmodeller varierar i storlek. Fortsätt med avsnitt 3.1 eller 3.2 för effektiv paraffinininbäddning (figur 2). Ge tillräckligt med tid för sedimentering av 3D-strukturen innan några tvättar och reagens ändras. Var försiktig så att du inte aspirerar organoiderna som kommer att flyta längst ner på röret. För paraffininbäddning, se figur 2 för vägledning.

1. Paraffinbäddning av stora (Ø ≥ 400 μm) 3D-cellodlingsmodeller
   1. Dagen före inbäddning, förvärm två 150 ml kolvar fyllda med paraffin (paraffinbad), en liten metallinbäddningsform per prov och fina pincett till 65 °C.
   2. Använd en förbelagd 1 ml spets, överför försiktigt organoiderna i 1x PBS till ett glasrör med platt botten med ett polytetrafluoretylenfodrat flasklock. Låt organoiderna sedimentera, ta försiktigt bort 1x PBS och ersätt den med 70% etanol. Inkubera i minst 30 minuter.
   3. Låt organoiderna sedimentera och ta försiktigt bort 70% etanol. Byt ut den mot 1 ml färdig eosin Y-lösning. Knäpp på röret och fläcka i minst 30 minuter. Ta försiktigt bort eosinlösningen och torka ut organoiderna i tre på varandra följande tvättar med 1 ml 100% etanol i ~ 30 minuter vardera.
      OBS: Etanol, en brandfarlig och flyktig vätska, orsakar allvarlig irritation i ögon och luftvägar. Manipulera den i en dragskåp och använd skyddsglasögon.
   4. Ta försiktigt bort 100% etanol och rensa organoiderna under en kemisk huva i 3 på varandra följande tvättar med 1 ml xylen i ~ 30 minuter vardera.
      Xylen är en giftig, flytande brandfarlig vars ångor kan orsaka irritation. Manipulera den i en dragskåp. Undvik direktkontakt med huden och använd gummihandskar och skyddsglasögon.
   5. Under en kemisk huva, förbered en vit mikrotvillingvävnadskassett genom att placera en bit biopsidyna (tidigare blöt i xylen) inuti ett av kassettens fack. Överför försiktigt 3D-strukturerna med en förbelagd 2 ml plastpasteurpipett till biopsidynan. Täck dem med en annan biopsiplatta blöt i xylen för att förhindra att organoiderna rör sig och stäng kassetten.
   6. Om flera prover bearbetas, placera kassetten i ett xylenbad för att vänta på ytterligare bearbetning. När alla prover har överförts till kassetter, placera kassetterna i ett förvärmt paraffinbad i 30 minuter vid 65 °C. Överför kassetterna till ett nytt förvärmt paraffinbad över natten.
   7. Efter paraffinimpregnering, ta en förvärmd inbäddningsform och tillsätt det uppvärmda paraffinet till det. Placera biopsiplattan som innehåller 3D-strukturerna i formen och skaka försiktigt tills alla organoider faller till botten av formen. Placera mycket försiktigt 3D-strukturerna i mitten av formen med förvärmda fina pincett. Fortsätt med avsnitt 3.3.
      OBS: Var försiktig så att du inte stör 3D-strukturerna med pincetten; tryck, men kläm inte fast dem.
2. Paraffinbäddning av små (Ø ≤ 400 μm) 3D-cellodlingsmodeller
   1. Dagen före inbäddning, förvärm två 150 ml kolvar fyllda med paraffin (paraffinbad), en liten metallinbäddningsform per prov och fina pincett till 65 °C.
   2. Ta försiktigt bort 1x PBS från organoidsuspensionen. Utför försiktigt 3 tvättar i 1 ml 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS). Ta bort så mycket 1x TBS som möjligt utan att röra organoiderna.
      OBS: Var försiktig så att du inte aspirerar provet. Om nödvändigt, utför en 5 min snurrning vid 50 x g vid RT. Återstående spår av fosfat kommer att störa följande steg, särskilt förhindra gelpolymerisation. Använd därför inte PBS-lösningar under något bearbetningssteg. För detta steg användes ett kommersiellt kit, innehållande kassetter, reagens #1 (klar vätska) och reagens #2 (färgad vätska), för att underlätta paraffininbäddad procedur utan att potentiellt förlora små fragment (se materialförteckning). Följ instruktionerna i satsen. Kassetterna är förmonterade med stödpapper och skivinsatser som redan finns på plats.
   3. Tillsätt 2 droppar Reagens #2 i röret och blanda försiktigt genom att knacka på röret. Tillsätt 2 droppar reagens #1 och blanda igen genom att knacka så att gelen stelnar. Ta bort gelén från röret med de fina pincetterna och placera den i kassettens brunn.
   4. Under dragskåpet, torka provet genom att placera kassetten i på varandra följande bad enligt följande (använd 150 ml kolvarna och använd färsk etanol eller xylen för varje bad): etanol 70%, 30 min; etanol 96%, 30 min; etanol 100%, tre tvättar, 30 min vardera; xylen, tre tvättar, 30 min vardera.
   5. Placera kassetterna i ett förvärmt paraffinbad i 30 minuter vid 65 °C och överför dem till ett färskt förvärmt paraffinbad över natten. Efter paraffinimpregnering, ta en förvärmd inbäddningsform och tillsätt uppvärmd paraffin i den. Öppna kassetten, lossa försiktigt gelén med fina pincett och placera gelén som innehåller 3D-strukturerna på mitten av inbäddningsformen. Fortsätt med avsnitt 3.3.
3. Vanliga steg för paraffinininbäddning
   1. Överför försiktigt formen till ett kallt område för att låta paraffinet stelna i ett tunt lager, vilket håller 3D-strukturerna i rätt läge. Lägg till en vävnadskassett ovanpå formen och tillsätt varm paraffin för att täcka denna plastkassett. Ta bort formen när den är helt stelnad och fortsätt med avsnitt 3.4.
      OBS: Paraffinblock kan förvaras vid rumstemperatur i flera år.

Figur 2: Översikt över proceduren för paraffinininbäddning av stora och små in vitro 3D-cellodlingsmodeller.
(A) Standardförfarande för inbäddning av paraffin. Efter fixering och uttorkning färgas 3D-strukturer med eosin för att underlätta deras visualisering (uppe och nere till vänster). 3D-strukturer placeras försiktigt på biopsidynan (blå) i kassetten med en 2 ml pasteurpipett (mitten). Efter paraffinimpregnering tappas 3D-strukturerna försiktigt i det flytande paraffinet med hjälp av pincett och omrörs försiktigt i biopsidynan. Små 3D-strukturer går förlorade under det här steget eftersom de inte kan släppas från dynan (nere till höger: misslyckad inbäddning). Endast stora 3D-strukturer kommer att bäddas in (överst till höger: lyckad inbäddning). Pilspetsar pekar på 3D-kulturer. (B) Alternativ till standardprotokollet för inbäddning av paraffin. Efter att ha fixerat små 3D-strukturer används ett kommersiellt kit för att hålla celler i en gel och underlätta deras överföring till formen efter paraffinimpregnering (höger: framgångsrik inbäddning). Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Blocksektionering och färgning
   1. Skär 4 μm sektioner med en vanlig mikrotom och utför histologiska och immunhistokemiska standardtekniker. Fortsätt med avsnitt 3.5.
      OBS: Specifika glas (se materialförteckning) användes för bättre vidhäftning av sektioner. Objektglasen kan förvaras i rumstemperatur eller vid 4 °C i flera år.
5. Bildinsamling och analys
   1. Utför avbildning med hjälp av en digital bildskanner eller upprätt mikroskop och analysera data med hjälp av en plattform för snabb digital kvantitativ analys som rapporterar morfologiska och multiplexerade uttrycksdata cell för cell över hela 3D-struktursektioner (se kompletterande figur 2 för detaljer).
      OBS: 20x-målet används rutinmässigt av denna grupp.

Representative Results

Detta protokoll ger en översikt över de kritiska stegen för 2D- och 3D-helmonteringsfärgning, samt bildbehandling och kvantitativa analyser av 3D-cellodlingsmodeller (figur 3 och figur 4). Det är tillämpligt på ett brett spektrum av 3D-cellodlingsmodeller - från sfäroider till organoider från olika värdarter eller vävnader - och möjliggör förvärv av exakt och kvantitativ information om arkitektur, cellorganisation och interaktioner på cellulära och subcellulära nivåer (figur 3 och figur 4). Laboratorier kan behöva optimera 2D-histologiska och immunhistokemiska tekniker och antikroppskoncentrationer enligt sina egna behov.

Båda metoderna ger värdefull biologisk information. 3D-färgning och konfokalmikroskopi ger visuell information om cellulär sammansättning och rumslig position med ett djupfält på upp till 200 μm (figur 3B). 2D-sektionering är dock lämplig för större 3D-strukturer för att avslöja detaljerade cellulära morfologiska egenskaper i hela sektionen av 3D-strukturer som annars kan vara utmanande att observera in situ på grund av ljusspridning som äventyrar upplösningen i större prover. Dessutom kan båda teknikerna tillhandahålla kvantitativa data. Faktum är att den erhållna upplösningen möjliggör tillämpning av cellulära och subcellulära segmenteringsalgoritmer för kvantifiering av antalet celler och detektering av närvaron av olika cellmarkörer i olika cellulära subtyper (figur 3F och figur 4). Sammanfattningsvis är de avbildningstekniker som beskrivs här reproducerbara, enkla och komplementära och representerar värdefulla verktyg för att studera cellulär heterogenitet.

Figur 3: Representativa resultat för 3D-helmontering, avbildning och analyser av optiska 3D- och 2D-sektioner. (A) Konfokala bilder av människa h) Höggradigt gliomsfäroid odlat i en vecka och märkt med Hoechst (blå), Olig2 (gul) och aktin (röd) (20x vattenmål). För alla förvärvade bilder fastställdes mikroskopinställningar med hjälp av en positiv kontroll (överst), och sedan avbildades den negativa kontrollen med identiska inställningar för att kontrollera bristen på fluorescens i frånvaro av primär antikropp (botten). (B) Ortogonal 3D-helmonteringsrepresentation av Ki67-färgning utförd i (h) höggradig gliomsfäroid odlad i en vecka (glycerol-fruktosrensning; 20x vattenmål, konfokal). (C) Konfokala bilder av (h) höggradigt gliomsfäroid odlat i en vecka och märkt med Hoechst (blå), Olig2 (gul) och Phalloidine-488 (grön) (glycerol-fruktosrensning; 20x vattenmål). (D) Konfokala bilder av humana (h) rabdomyosarkom (överst) och mus (m) neurala kamceller (botten) sfäroider odlade i en vecka och märkta med Hoechst (blå), aktin (röd) respektive Ki67 (grön) (glycerol-fruktosrensning; 20x torrt mål). (E) Konfokala bilder av h) höggradigt gliomsfäroid odlat i en vecka och märkt med Hoechst (blått) och Ki67 (grönt) (glycerol-fruktosröjning; 40x vattenmål) (överst till vänster). Segmenterade bilder på Hoechst-kanalen och Ki67-positiva (+) kärnkraftsregioner på den gröna kanalen genererades med hjälp av programvara för analys med högt innehåll (se kompletterande figur 1 och materialförteckning) (nederst). Utgången som anges är procentandelen Ki67⁺ -kärnor per segmenterad 3D-struktur (uppe till höger). Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Representativa resultat för avbildning och analys av 2D-optiska sektioner. (A, D) 2D-sektionsbilder av en 3D-cellmodell (humana rabdomyosarkomsfäroider odlade i en månad) erhållna med en digital bildskanner och analyserade på en plattform för snabb digital kvantitativ analys. (A) H&E-färgning och detektion av celler i enlighet med deras storlek. Skalstapel = 500 μm. (B) Histogram visar procentandelen celler < 100 μm 2 och > 100 μm² detekterade med hjälp av programvara för snabb digital kvantitativ analys (vänster: Halo) eller manuell räkning (höger: MC). (C) Ki67-färgning och detektion av celler i enlighet med intensiteten hos deras 3,3'-diaminobensidinsignal (DAB). Negativ (blå), svagt positiv (gul), positiv (röd). Skalstapel = 500 μm. (D) Histogram visar procentandelen Ki67-negativa, svagt positiva och positiva celler. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; MC = manuell räkning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Översikt över stegen i programvaran för bildanalys. Analyserna bygger på associationen mellan byggstenar. Varje byggsten motsvarar en funktionssegmentering, beräkning, association, utdatadefinition - och erbjuder flera algoritmer och variabelval för att matcha det biologiska provet som avbildas. Programvaran tillhandahåller flera RMS-analysprotokoll (Ready Made Solution) som enkelt kan användas och modifieras. Integrerade bildanalysprotokoll kan sparas, tillämpas på olika datauppsättningar och delas mellan användare. Kortfattat innebär analysprotokollet sekventiell objektsegmentering: sfäroid, kärnor och slutligen Ki67-fickor (A488). Därefter beräknas den genomsnittliga intensiteten hos Ki67-fickorna för att ytterligare diskriminera de positiva händelserna. Slutligen väljs kärnor som omfattar Ki67-positiva fickor positivt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Översikt över procedurstegen i programvaran för kvantitativ analys. Steg 1. Ladda upp filerna med hjälp av fliken Studier. Filer öppnas i avsnittet Bildåtgärder. Steg 2. Öppna fliken Anteckningar och klicka sedan på Lageråtgärder för att designa ett nytt lager runt strukturen med hjälp av cirkelverktyget i verktygsfältet. För icke-cirkulära strukturer kan pennverktyget användas istället. Steg 3. Verktygsfältet kan användas för att designa anteckningar och visualisera kvantifieringen med verktyget. Steg 4. Öppna fliken Analys och välj de bästa förutsättningarna för analys av provet (flera försök kan vara nödvändiga här). Steg 4.1. Använd avsnittet Fläckmarkering för att ställa in färgningstillståndet. I händelse av flera fläckar kan dessa läggas till och byta namn, och den virtuella färgen kan ändras. Lokaliseringsdetekteringen kan specificeras - nukleär eller cytoplasmafärgning. Steg 4.2. Använd avsnittet Cellidentifiering för att konfigurera cellidentifieringen. Detta avsnitt kommer att vara det viktigaste för analysen. Avsnittet Nuclear Contrast Threshold möjliggör detektion av alla kärnor. Uppmärksamhet måste ägnas om det finns flera befolkningsstorlekar, programvaran kan upptäcka flera celler istället för en unik stor. Avsnitt om kärnstorlek och kärnsegmenteringsaggressivitet kan användas för att kvantifiera populationsintervall för cellstorlek. Steg 5. Beskrivning av hur du kör provanalys. Följ stegen som visas i figuren. Avsnittet Anteckningslager kör bara inställningen på den här bilden. Kvantifieringen kan visualiseras med hjälp av verktyget. Upprepa steg 4.1-5 tills lämplig kvantifiering uppnås. Steg 6–6.1. Med dessa steg kan du rita en figur med programvaran. Steg 7. Kvantifieringsgrafik som erhållits via programvara kan sparas. Steg 8. Data kan exporteras. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Cellodling är ett oumbärligt verktyg för att avslöja grundläggande biologiska mekanismer som är involverade i vävnads- och organutveckling, funktion, regenerering och störning samt sjukdom. Även om monoskiktad 2D-cellodling har dominerat, har ny forskning skiftat mot kulturer som genererar 3D-strukturer som är mer reflekterande av in vivo-cellulära svar, särskilt på grund av ytterligare rumslig organisation och cell-cellkontakter som påverkar genuttryck och cellulärt beteende och därmed kan ge mer prediktiva data⁷. Ändå kvarstår många utmaningar, inklusive behovet av användarvänliga färgnings- och avbildningstekniker för detaljerad mikroskopisk visualisering och utvärdering av komplexa 3D-strukturer på cellulär och subcellulär nivå. I detta sammanhang har detaljerade, robusta och kompletterande protokoll tillhandahållits för att utföra färgning och cellulär och subcellulär upplösningsavbildning av fasta in vitro 3D-cellodlingsmodeller som sträcker sig från 100 μm till flera millimeter i storlek.

Denna procedur presenterar två olika strategier för att hantera en mängd olika storlekar och typer av in vitro 3D-cellodlingsmodeller. Valet av den ena (3D-helmonteringsanalys) eller den andra (2D-sektionsanalys) beror på vilken modell som används och vilken fråga som undersöks. 3D-helmonteringsanalys med konfokalmikroskopi möjliggör visualisering av celler med ett djupfält på upp till 200 μm, oavsett den totala storleken på 3D-strukturen, medan 2D-sektionering är tillämplig på prover av alla storlekar, men visualisering förblir 2D-dimensionell. Nedan följer några förslag på felsökning och tekniska överväganden.

Förlust av 3D-strukturer under arbetsflödet är den vanligaste nackdelen. De kan förbli vidhäftande på spetsarna och rören, varför förbeläggningsspetsar och rör med PBS-BSA 0,1% lösning är nyckeln. Dessutom är det viktigt att låta 3D-strukturerna sedimentera mellan reagensbyten och att utföra all pipettering mycket noggrant. Som nämnts i proceduren kan cellerna för alla steg, om 3D-struktursedimenteringen är för lång, snurras försiktigt vid 50 × g i 5 minuter vid RT. Beroende på syftet med studien bör fördelarna / nackdelarna med ett sådant spinnsteg övervägas eftersom centrifugering kan äventyra formen på 3D-strukturerna. Dessutom bör man se till att bevara denna morfologi under fixeringssteget eftersom cystiska organoider tenderar att kollapsa. Fixering av strukturer under 400 μm i storlek bör förhindra strukturella förändringar.

För optimal immunmärkning är återvinning av organoider från deras 3D-matriser ett avgörande steg. 3D-matrisen kan hindra adekvat antikroppspenetration eller leda till hög bakgrundsfärgning på grund av ospecifik bindning till matrisen. ECM-avlägsnande kan förändra morfologin hos de yttre segmenten av organoider (särskilt vid små cellulära utsprång som sträcker sig från studerade 3D-strukturer) och delvis försvåra analyser. För sådana 3D-strukturer kan matrisen behållas under hela proceduren; Odlingsförhållandena bör dock noggrant anpassas för att odla celler i en minimal mängd matris för att förhindra otillräcklig penetration av lösningar och antikroppar och för att undvika på varandra följande tvättsteg som syftar till att minska alltför stort bakgrundsbuller ^6,8.

Det optiska rensningssteget som beskrivs i detta protokoll i 3D-färgningssektionen för hela monteringen är relevant för avbildning av 3D-strukturer upp till 150-200 μm djup istället för 50-80 μm utan röjning. Jämfört med andra clearingmetoder som ofta kräver flera veckor och använder giftiga clearingmedel, användes ett tidigare publicerat snabbt och säkert clearingsteg i detta protokoll ^4,9. Dessutom är detta rensningssteg reversibelt och nya antikroppar kan läggas till den initiala färgningen utan förlust av upplösning eller ljusstyrka⁴. Beroende på den studerade 3D-cellodlingsmodellen kanske ett djup på 150-200 μm inte är tillräckligt för att avbilda 3D-strukturen på ett informativt sätt, och detta clearingprotokoll kan orsaka förändringar i den allmänna morfologin hos sfäriska, monoskiktade organoider med stora lumen⁴. Användare bör noggrant utforma sitt experiment och vid behov optimera tidpunkten för permeabiliserings- / blockeringssteget (för att möjliggöra penetration av antikroppar och lösning), rensningssteget (för att penetrera djupare än 200 μm, prover bör rensas helt) och bildförvärv. De två vanligaste teknikerna som finns tillgängliga i kärnanläggningar skulle vara ljusplåt och konfokalmikroskopi. Användare måste noggrant välja en teknik baserad på storleken på deras 3D-strukturer och deras biologiska fråga¹⁰. Jämfört med konfokalmikroskopi förblir emellertid ljusarkmikroskopiupplösningen erhållen för sådana djupa strukturer suboptimal för att erhålla subcellulär upplösning.

Här har en detaljerad och robust process rapporterats som är dedikerad till paraffinininbäddning av enstaka prover. Intressant nog utvecklade Gabriel et al. nyligen ett protokoll som bäddar in 3D-cellkulturer i paraffin med ökad genomströmning. De använde en polydimetylsiloxan (PDMS) -form för att begränsa 96 3D-strukturer i ett mikroarraymönster i ett block, vilket gav nya perspektiv för studier av 3D-tumörmodeller som omfattar fler grupper, tidpunkter, behandlingsförhållanden och replikerar¹¹. Denna metod kräver dock omfattande färdigheter och maskiner, särskilt för tillverkning av förformen som används för att skapa PDMS-formar.

Sammanfattningsvis beskriver detta dokument två olika, kompletterande och anpassningsbara tillvägagångssätt som möjliggör förvärv av exakt och kvantitativ information om arkitektonisk och cellulär sammansättning av 3D-cellulära modeller. Båda parametrarna är avgörande för att studera biologiska processer såsom intratumoral cellulär heterogenitet och dess roll i resistens mot behandlingar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Biopsy pad Q Path blue	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin white	VWR	720-2183
Chemical hood	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fine forceps	Pyramid innovation	R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Excellent  for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontal agitation	N-BIOTEK	NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox molds 15x15	VWR	720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panoramic scan II	3dhistech	2397612
Paraffin embedding equipment	Leica	EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Good for environmental    samples,    pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid,  solid, provide excellent  stress  crack  and  impact  resistance and have a  good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers  excellent  sealing  characteristics.
Set of micropipettors  (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 inverted confocal microscope	Leica	LSM780
Tissue cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscope	Leica	SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylin type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	CAUTION: Suspected of causing genetic defects.  Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffin Wax tek III	Sakura	4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	CAUTION: Triton X­100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution	Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution	To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.
Permeabilisation-blocking solution (PB solution)	The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X  (1:10) solution	PB:PBS-1X  (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software	Indicalabs	NM 87114
Harmony software	PerkinElmer	HH17000010