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Biology

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए दो-चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर प्रोटोकॉल

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62295
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,3,4, 1, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

Summary

यह काम दो रंग डीडीपीसीआर प्रणाली का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए विभिन्न परख विकसित करने पर चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है। चरण विस्तृत हैं और परख और प्रयोग प्रदर्शन में सुधार करने के तरीके पर नोट्स शामिल किए गए हैं। इन परखों का उपयोग कई सार्स-सीओवी-2 आरटी-डीडीपीसीआर अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Abstract

सार्स-सीओवी-2 महामारी का निदान दुनिया भर के सभी देशों के लिए प्राथमिकता है। वर्तमान में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्वांटिटेटिव पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) सार्स-सीओवी-2 निदान के लिए स्वर्ण मानक है क्योंकि कोई स्थायी समाधान उपलब्ध नहीं है। हालांकि यह तकनीक प्रभावी हो सकती है, अनुसंधान पता लगाने और निदान में अपनी सीमाओं को दिखाते हुए उभरा है, खासकर जब यह कम प्रचुर लक्ष्यों की बात आती है। इसके विपरीत, ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर), क्यूपीसीआर पर बेहतर लाभ के साथ एक हालिया उभरती हुई तकनीक है, जिसे कम प्रचुर मात्रा में लक्षित नमूनों से सार्स-सीओवी-2 के निदान में आरटी-क्यूपीसीआर की चुनौतियों को दूर करने के लिए दिखाया गया है। भावी प्रभाव से, इस लेख में, आरटी-डीडीपीसीआर की क्षमताओं को दो-रंग पहचान प्रणाली का उपयोग करके सिम्प्लेक्स, डुप्लेक्स, ट्रिपलएक्स प्रोब मिक्स और चौगुनी परख विकसित करने के तरीके के बारे में कदम दिखाकर आगे बढ़ाया गया है। सार्स-सीओवी-2 जीनोम (एन, ओआरएफ1एबी, आरपीपी30 और आरबीडी2) के विशिष्ट स्थलों को लक्षित करने वाले प्राइमरों और जांचों का उपयोग करते हुए, इन परखों का विकास संभव दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, एसेस वर्कफ़्लो को बेहतर बनाने और डेटा का विश्लेषण करने के तरीके पर चरण-दर-चरण विस्तृत प्रोटोकॉल, नोट्स और सुझाव प्रदान किए जाते हैं। भविष्य के कार्यों में इस वर्कफ़्लो को अपनाने से यह सुनिश्चित होगा कि लागत और नमूना थ्रूपुट में काफी सुधार करने वाले एक छोटे से नमूने में लक्ष्यों की अधिकतम संख्या का संवेदनशील रूप से पता लगाया जा सकता है।

Introduction

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त तकनीक, न्यूक्लिक एसिड अनुसंधान के उत्तर प्रदान करने में सक्षम एक शक्तिशाली तकनीक बनने के अपने आगमन के बाद से कई परिवर्तनों से गुजरी है। ये परिवर्तन पुरानी तकनीक का निरंतर सुधार रहे हैं। इन परिवर्तनों को तीन पीढ़ियों में संक्षेपित किया जा सकताहै। पहली पीढ़ी पारंपरिक पीसीआर है जो प्रवर्धित लक्ष्यों की मात्रा निर्धारित करने और पता लगाने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन पर निर्भर करती है। दूसरी पीढ़ी मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) है जो वास्तविक समय में नमूनों का पता लगा सकती है और एक नमूने में लक्ष्यों को सीधे निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र पर भरोसा कर सकती है। तीसरी पीढ़ी, डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर), मानक वक्र की आवश्यकता के बिना न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों का पता लगाने और पूर्ण परिमाणीकरण दोनों कर सकती है। डीपीसीआर को एक दीवार के कुओं द्वारा तेल, पानी के इमल्शन में अलग किए जाने वाले प्रतिक्रिया कक्षों से और भी सुधार किया गया है, और उसी कुएं के भीतर रसायनों को स्थिर किया जा रहा है जैसा कि बूंद-आधारित डिजिटल पीसीआर 2 में देखागया है। ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) में, एक नमूने को हजारों नैनोलीटर आकार की बूंदों में विभाजित किया जाता है जिसमें व्यक्तिगत लक्ष्य होते हैं जिन्हें बाद में पॉइसन सांख्यिकी 2,3,4 का उपयोग करके परिमाणित किया जाएगा। यह तकनीक पीसीआर की अन्य पीढ़ियों की तुलना में कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों को निर्धारित करने में डीडीपीसीआर को बढ़त देती है।

हाल ही में, कई अनुप्रयोगों ने कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य 1,5,6 का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करते समय आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले क्यूपीसीआर पर डीडीपीसीआर की श्रेष्ठता पर प्रकाश डाला है। सार्स-सीओवी-2 इन अनुप्रयोगों 7,8,9,10,11,12 का कोई अपवाद नहीं है। सार्स-सीओवी-2 के प्रकोप के बाद से, वैज्ञानिक वायरस का निदान करने और इसे कुशलता से पता लगाने के तरीके पर समाधान के साथ आने के लिए सभी मोर्चों पर काम कर रहे हैं। सोने का मौजूदा मानक अभी भी क्यूपीसीआर13 बना हुआ है। हालांकि आरटी-डीडीपीसीआर को आरटी-क्यूपीसीआर 7,8,9,10,11,12 की तुलना में पर्यावरण और नैदानिक दोनों नमूनों से कम प्रचुर मात्रा में सार्स-सीओवी-2 लक्ष्यों का पता लगाने में अधिक सटीक दिखाया गया है। सार्स-सीओवी-2 डीडीपीसीआर द्वारा प्रकाशित अधिकांश काम वाणिज्यिक परखों के आधार पर मल्टीप्लेक्स के साथ सिम्प्लेक्स परख पर निर्भर करते हैं। इसलिए, सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स आरटी-डीपीसीआर परख विकसित करने के तरीके को समझाने के लिए और अधिक किया जाना चाहिए।

एक उचित परख डिजाइन में, मल्टीप्लेक्सिंग का उपयोग लागत को बचाने, नमूना थ्रूपुट बढ़ाने और लक्ष्यों की संख्या को अधिकतम करने के लिए किया जा सकता है जिन्हें एक छोटे से नमूने के भीतर संवेदनशील रूप से पता लगाया जा सकता है। डीडीपीसीआर के साथ मल्टीप्लेक्सिंग करते समय, किसी को यह ध्यान रखना चाहिए कि किसी विशेष प्रणाली में कितने फ्लोरोफोर का पता लगाया जा सकता है। कुछ डीडीपीसीआर प्लेटफॉर्म तीन चैनलों का समर्थन कर सकते हैं जबकि अन्य केवल दो चैनलों का समर्थन करते हैं। इसलिए, दो चैनलों के साथ मल्टीप्लेक्सिंग करते समय, किसी को दो से अधिकलक्ष्यों 14,15,16 का पता लगाने के लिए उच्च क्रम मल्टीप्लेक्सिंग सहित विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करना पड़ता है। इस काम में, दो रंगों की डीडीपीसीआर डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग विभिन्न सार्स-सीओवी-2 आरटी-डीडीपीसीआर परख विकसित करने के तरीके पर चरण दिखाने के लिए किया जाता है, जिन्हें विभिन्न शोध अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

नैतिक बयान
वुहान इंस्टीट्यूट ऑफ वायरोलॉजी (डब्ल्यूएचआईओवी) उन प्रयोगशालाओं और संस्थानों में से एक है, जिन्हें वुहान शहर के चीन सीडीसी ने सार्स-सीओवी-2 पर शोध करने और नैदानिक नमूनों से कोविड-19 का पता लगाने के लिए अनुमोदित किया है। नैदानिक नमूनों का उपयोग करके कोविड-19 के लिए नई नैदानिक तकनीकों को विकसित करने पर शोध को वुहान इंस्टीट्यूट ऑफ वायरोलॉजी (2020 एफसीए001) की नैतिक समिति द्वारा भी मंजूरी दी गई है।

1. नमूना प्रसंस्करण वर्कफ़्लो (चित्रा 1 ए)

नोट: प्रोटोकॉल के दौरान, क्रॉस संदूषण से बचने के लिए नमूना हैंडलिंग (निष्कर्षण और भंडारण), अभिकर्मक / मास्टरमिक्स तैयारी और भंडारण, प्रतिक्रिया मिश्रण तैयारी (नमूना प्लस मास्टरमिक्स), और पता लगाने के लिए समर्पित पिपेट के साथ अलग-अलग कमरों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। विकसित किए जाने वाले परखों का उपयोग नैदानिक नमूनों या अनुसंधान नमूनों का पता लगाने में किया जा सकता है। सभी नमूनों को इस तरह से माना जाना चाहिए जैसे कि वे सुरक्षित प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का उपयोग करते समय भी संक्रामक एजेंटों को प्रसारित कर सकते हैं। नमूना प्रसंस्करण चरणों को सख्त बीएसएल -2 नियमों का पालन करते हुए जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए, जिसमें उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनना शामिल है।

  1. नमूना निष्क्रियता
    1. बीएसएल-2 प्रयोगशाला में सार्स-सीओवी-2 का 1 एमएल नमूना लें। 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को गर्मी-निष्क्रिय करें।
      नोट: नमूने विभिन्न स्रोतों से आ सकते हैं, इसलिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि निष्क्रिय होने वाली मात्रा बाद में आरएनए निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है। अधिकांश निष्कर्षण किटों को 200 μL तक की एक छोटी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, इसलिए, निष्क्रियता के लिए लगभग 1 एमएल की नमूना मात्रा पर्याप्त होगी। प्रयोगशालाओं के अपने एसओपी के अनुसार प्रत्यक्ष निष्क्रियता और आरएनए निष्कर्षण के लिए सर्फेक्टेंट, किट और लाइसिस बफर का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. नमूने को जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में ले जाएं और संभावित एरोसोल को व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए उन्हें 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें। यदि तुरंत संसाधित नहीं किया जाता है तो 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस में नमूने स्टोर करें।
      नोट: नमूना भंडारण के लिए कोई विशिष्ट कंटेनर की आवश्यकता नहीं है। नमूने निष्क्रियता के दौरान उपयोग किए जाने वाले ट्यूबों या कंटेनरों में संग्रहीत किए जा सकते हैं। इस काम के लिए, अधिकांश नमूने वायरल ट्रांसपोर्ट मीडिया (वीटीएम) ट्यूब या 1.5 एमएल ट्यूबों में संग्रहीत किए गए थे।
  2. आरएनए निष्कर्षण
    नोट: विशिष्ट प्रोटोकॉल के साथ कई आरएनए निष्कर्षण उपकरण और किट तैयार उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। यहां, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक स्वचालित प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है।
    1. पहले से भरी हुई 96-गहरी अच्छी तरह से छिद्र प्लेट को बाहर निकालें; चुंबकीय मोतियों को मिलाने के लिए इसे धीरे-धीरे उल्टा करें। मिश्रण करने के बाद, धीरे से प्लेट को एक सपाट सतह पर हिलाएं ताकि अभिकर्मक और चुंबकीय मोतियों को केंद्रित किया जा सके जो प्लेट के तल तक दीवार पर हो सकते हैं।
    2. प्लेट के कंपन और तरल फैलाव से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी सीलिंग फिल्म को सावधानीपूर्वक फाड़ दें। 96-वेल प्लेट की पंक्ति 2 और 8 में प्रति अच्छी तरह से 20 μL प्रोटीन के 20 μL प्रोटीन और 200 μL नमूने जोड़ें। फिर, 32-चैनल स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण उपकरण के आधार पर 96-वेल प्लेट रखें।
      नोट: नमूना जोड़ने के बाद 1 घंटे के भीतर कंप्यूटर पर प्रोग्राम चलाएँ।
    3. चुंबकीय पट्टी आस्तीन को 32-चैनल स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण उपकरण के कार्ड स्लॉट में डालें। प्रोग्राम GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (त्वरित संस्करण) का चयन करें और इसे चलाएँ।
    4. निष्कर्षण के पूरा होने के बाद, न्यूक्लिक एसिड के नमूने को पंक्ति 6 और 12 (लगभग 100 μL / नमूना) में निकालें और एक साफ न्यूक्लियस मुक्त 96-वेल प्लेट में वितरित करें। नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक स्टोर करें जब तक कि उपयोग न करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक।
      नोट: नमूने को एक नए 100-200 μL प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए 100 μL मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह सीधे नमूना प्लेट के स्तंभों से मेल खा सकता है।
  3. सीडीएनए उत्पादन
    नोट: लंबे समय तक संग्रहीत नमूनों के लिए, कई फ्रीज / पिघलना चक्र से बचें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सीडीएनए किट का उपयोग करके सीडीएनए उत्पादन करें।
    1. शीतलन ब्लॉक पर रखी गई 100 या 200 μL पीसीआर ट्यूब में, 5x RT मास्टर मिक्स (जैसे, सही वास्तविक समय), नमूना RNA के 5 μL, और प्रति प्रतिक्रिया RNase मुक्त ddH2O के 3 μL जोड़ें (कुल मात्रा 10 μL)।
    2. पीसीआर ट्यूब को थर्मल साइकलर सेट में 15 मिनट (रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 सेकंड के लिए 85 डिग्री सेल्सियस (रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस की गर्मी निष्क्रियता), और अनंत समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: नमूने को तुरंत संसाधित करें, या उपयोग तक 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर।

2. डीडीपीसीआर परख और वर्कफ़्लो का अनुकूलन

नोट: बूंदों को पढ़ने से पहले / बाद में परख को अनुकूलित करें। परिणामों पर निर्भर करते हुए, उन्हें बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए काम के किसी भी बिंदु पर अनुकूलित किया जा सकता है। डीडीपीसीआर प्रयोगों को अनुकूलित करते समय विचार किए जाने वाले कुछ सामान्य कारक नीचे दिए गए हैं।

  1. डीडीपीसीआर प्राइमरों और जांच को मान्य करें (तालिका 1)।
    नोट: प्राइमर ORF1ab और N को चीन सीडीसी 17, लू एटअल.18 से मानव अंतर्जात नियंत्रण जीन (RPP30) और Nyaruaba et al.13 से RBD2 से अनुकूलित किया गया था। आरबीडी 2 को छोड़कर सभी प्राइमरों और प्रोब्स को पहले ही डीडीपीसीआर परीक्षण और 7,8,18 अनुकूलित किया गया था।
  2. डीडीपीसीआर परीक्षण नमूना नियंत्रण चलाएं जिसमें एक सकारात्मक नियंत्रण (सभी चार लक्ष्यों के साथ एक नमूना), कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) शामिल है; न्यूक्लियस मुक्त पानी या बिना किसी लक्ष्य के नमूना, और निष्कर्षण / नकारात्मक नियंत्रण (गैर-संक्रामक सुसंस्कृत मानव कोशिका से निकाला गया कुल न्यूक्लिक एसिड या स्वास्थ्य स्वयंसेवकों से एकत्र किए गए नमूने)।
    नोट: लक्ष्य जीन की ज्ञात प्रतियों के साथ मानक नियंत्रण नमूने पसंद किए जाते हैं। हालांकि, मानकों की अनुपस्थिति में, उनके नियंत्रण या नमूना मैट्रिक्स को परिभाषित करने के लिए उपलब्ध नमूनों का उपयोग करें। परीक्षण नमूने के साथ नियंत्रण चलाएँ।
  3. पीसीआर (चरण 3.2) के एनीलिंग चरण में 55 डिग्री सेल्सियस से 65 डिग्री सेल्सियस के तापमान ढाल को सम्मिलित करके एनीलिंग तापमान (चित्रा 2 डी) को अनुकूलित करें।
    नोट: एनीलिंग तापमान अनुकूलन सबसे अच्छा तापमान खोजने में मदद करता है जहां बूंद पृथक्करण न्यूनतम बारिश के साथ अधिकतम (आसान लक्ष्य पहचान) है। परिणाम प्राप्त करने के बाद, बेहतर अनुकूलन के लिए तापमान सीमा को संकीर्ण करें, उदाहरण के लिए, 55 डिग्री सेल्सियस से 60 डिग्री सेल्सियस तक।
  4. प्राइमर और जांच सांद्रता को अनुकूलित करें। यदि परख में सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच इष्टतम पृथक्करण हासिल नहीं किया जाता है, तो प्राइमर (300-900 एनएम) और / या जांच (100-400 एनएम) सांद्रता को अलग-अलग करें।
    नोट: प्राइमर / जांच सांद्रता को कम करने से कम लक्ष्य बूंद आयाम होता है और इसे बढ़ाने से लक्ष्य का आयाम भी बढ़ जाता है। यह आयाम-आधारित मल्टीप्लेक्सिंग में सहायक हो सकता है।
  5. रिक्त स्थान की सीमा (एलओबी), पहचान की सीमा (एलओडी), विशिष्टता, और मानक और परीक्षण नमूने दोनों का उपयोग करके संवेदनशीलता सहित विभिन्न मापदंडों पर विचार करते हुए विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता का परीक्षण करें।

3. डीडीपीसीआर वर्कफ़्लो (चित्रा 1 बी) और परख विकास (तालिका 2)

नोट: अन्य डीडीपीसीआर डिटेक्शन सिस्टम की तरह, इस वर्कफ़्लो में भी चार चरण (चित्रा 1 बी) होते हैं, जिसमें प्रतिक्रिया मिश्रण तैयारी, बूंद पीढ़ी, पीसीआर प्रवर्धन और बूंद पढ़ना शामिल है।

  1. प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करना
    नोट: एक साफ अलग कमरे में और बीएससी के अंदर सभी परख तैयार करें। स्वच्छ दस्ताने, साफ पिपेट, न्यूक्लियस मुक्त पानी और कीटाणुनाशक के उपयोग सहित मानक सावधानियों का पालन करें। अलग-अलग ट्यूबों में एलिकोट अभिकर्मकों को बार-बार फ्रीज पिघलने चक्र से बचने के लिए -20 डिग्री सेल्सियसपर स्टोर करें। तालिका 2 में दिखाए गए अनुसार परख तैयार करें। प्राइमर और प्रोब स्टॉक समाधान ों को 100 μM की उच्च सांद्रता में संग्रहीत किया जाना चाहिए। काम करने वाले समाधानों को 20-40 μM (न्यूक्लियस मुक्त पानी में पतला) के एलिकोट में संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. सभी परीक्षणों में सामान्य कदम
      नोट: परख तैयार करने से पहले, नमूनों की संख्या के आधार पर आवश्यक मास्टरमिक्स की कुल मात्रा की गणना करें। यहां, प्रत्येक मास्टरमिक्स घटक वॉल्यूम को किसी भी पाइपिंग त्रुटियों के लिए 1.05 से गुणा किया गया था।
      1. कमरे के तापमान के लिए प्रतिक्रिया सामग्री को पिघलाना और बराबर करना। वोर्टेक्स समरूपता सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में (30 सेकंड) प्रतिक्रियाएं घटक हैं, और ट्यूब के तल पर सामग्री को इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करते हैं।
      2. कार्यशील समाधानों से तालिका 2 में विस्तृत विशिष्ट प्रतिक्रिया मात्राओं को मिलाकर प्रति परख प्राइमर-प्रोब (पीपी) मिश्रण तैयार करें।
      3. प्रोब्स के लिए 2x ddPCR सुपरमिक्स के 11 μL (1x) को मिलाकर मास्टरमिक्स तैयार करें (कोई dUTP नहीं), PP मिक्स (कार्यशील समाधान से तालिका 2 में दिखाए गए परख पर निर्भर) और न्यूक्लियस मुक्त पानी को 19.8 μL प्रति अच्छी तरह से अंतिम मात्रा में मिलाकर। नमूनों की संख्या के आधार पर न्यूक्लियस-मुक्त 96-वेल डीडीपीसीआर प्लेट के कुओं में मास्टरमिक्स वितरित करें।
        नोट: नमूना प्लेट के लिए, सुनिश्चित करें कि एक कॉलम में सभी 8 कुओं में समाधान है। यदि केवल कुछ कुओं का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, 5 नमूने, तो अन्य 3 कुओं को 22 μL न्यूक्लियस मुक्त पानी या नियंत्रण बफर के साथ भरें।
      4. अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण मात्रा (22 μL) प्राप्त करने के लिए, मास्टरमिक्स युक्त प्रति अच्छी तरह से सीडीएनए नमूना का 2.2 μL जोड़ें। डिस्पोजेबल पीसीआर प्लेट सीलर के साथ प्लेट को सील करें।
        नोट: निर्दिष्ट कमरे में नमूना परिवर्धन करें। नियंत्रण यानी, सकारात्मक, एनटीसी और निष्कर्षण शामिल करें। इसके अतिरिक्त, यदि आरएनए नमूने कम सांद्रता के हैं, तो मास्टरमिक्स में पानी की मात्रा को कम करें और तदनुसार नमूना मात्रा को 5.5 यूएल तक बढ़ाएं।
      5. एक बार प्रतिक्रिया मिश्रण प्रति अच्छी तरह से वितरित होने के बाद, प्लेट के निचले भाग में सामग्री एकत्र करने के लिए भंवर संक्षेप में (15-30 एस), और सेंट्रीफ्यूज (10-15 एस)। बूंद उत्पादन के लिए आगे बढ़ें।
  2. स्वचालित बूंद उत्पादन (पूरक चित्र 1)
    नोट: विभिन्न बूंद जनरेटर का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, यह अध्ययन एक स्वचालित ड्रॉपलेट जनरेटर (ऑटोडीजी) के साथ किया गया था। एम्पलीकॉन संदूषण से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि ड्रॉपलेट जनरेटर और पाठकों के पास अलग-अलग क्षेत्रों में समर्पित स्थान है। उपभोग्य सामग्रियों को लोड करते समय, क्रॉस संदूषण से बचने के लिए उपभोग्य सामग्रियों पर हाथ हिलाने से बचने के लिए सामने की ओर काम करने वाले उपकरण के पीछे से लोड करना शुरू करने की सिफारिश की जाती है।
    1. ऑटोडीजी को स्थापित करने के लिए आवश्यक सभी उपभोग्य सामग्रियों को प्राप्त करें, जिसमें जांच के लिए ऑटोडीजी तेल, डीजी 32 कारतूस, पिपेट टिप्स, कूलिंग ब्लॉक, नमूना प्लेट, ड्रॉपलेट प्लेट (नई साफ डीडीपीसीआर प्लेट), और एक अपशिष्ट बिन शामिल हैं।
    2. AutoDG टच स्क्रीन पर, नमूना प्लेट को कॉन्फ़िगर करें और उन स्तंभों का चयन करें जहाँ नमूने नमूना प्लेट पर स्थित हैं और ठीक दबाएँ.
      नोट: स्क्रीन लोड को दर्शाते हुए पीले रंग में बदल जाएगी जहां उपभोग्य सामग्रियों को लोड किया जाना चाहिए।
    3. ऑटोडीजी दरवाजा खोलें और अपने संबंधित स्थानों पर उपभोग्य सामग्रियों को लोड करें।
      नोट: संबंधित स्थानों पर जहां उपभोग्य सामग्रियों को लोड किया जाना चाहिए, उनमें एक पीला संकेतक होगा जो बाद में हरा हो जाएगा यदि उपभोग्य सामग्री लोड की जाती है। यह टचस्क्रीन के समान है।
    4. नमूना प्लेट और बूंद पीढ़ी प्लेट लोड करें।
      नोट: ड्रॉपलेट जनरेशन प्लेट को कूलिंग ब्लॉक पर रखा जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि शीतलन ब्लॉक बैंगनी (उपयोग के लिए तैयार) है और गुलाबी नहीं है (जब तक रंग बैंगनी में वापस नहीं आ जाता है तब तक फ्रीजर में रखा जाना चाहिए)।
    5. ऑटोडीजी दरवाजा बंद करें, सुनिश्चित करें कि स्क्रीन हरी (उपभोग्य सामग्री भरी हुई) है, और स्टार्ट ड्रॉपलेट जनरेशन दबाने से पहले तेल का प्रकार प्रोब्स के लिए तेल है।
    6. बूंदों के उत्पन्न होने की प्रतीक्षा करें। स्क्रीन ड्रॉपलेट्स रेडी दिखाती है तो दरवाजा खोलें और बूंदों वाली प्लेट को हटा दें।
    7. प्लेट को 5 सेकंड के लिए 185 डिग्री सेल्सियसपर चलाने के लिए प्लेट सीलर सेट का उपयोग करके एक छेद योग्य पन्नी सील के साथ सील करें। पीसीआर प्रवर्धन के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: बूंद उत्पादन के बाद 30 मिनट के भीतर पीसीआर प्रवर्धन शुरू किया जाना चाहिए।
  3. पीसीआर प्रवर्धन
    1. सील की गई बूंद प्लेट को 96-गहरे कुएं थर्मल साइक्लर में डालें, नमूना मात्रा को 40 μL और ढक्कन तापमान को 105 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. पीसीआर कार्यक्रम का उपयोग करके बूंदों को बढ़ाता है: 10 मिनट (एंजाइम सक्रियण) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्र और 57 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट एनीलिंग / विस्तार, 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रियीकरण, और अनिश्चित काल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम रखना। पीसीआर के बाद, बूंदों को पढ़ें या 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: सभी चरणों में 2 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की रैंप दर का उपयोग करें, क्योंकि रैंप दरें विभिन्न थर्मल साइकिलर्स के लिए भिन्न हो सकती हैं। बूंदों को पढ़ने से पहले बूंद स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट तक रखें।
  4. ड्रॉपलेट रीडिंग
    1. थर्मल साइकिल ्ड 96-वेल प्लेट को ड्रॉपलेट रीडर में स्थानांतरित करें, और ड्रॉपलेट रीडर से जुड़े कंप्यूटर पर, साथ वाले सॉफ़्टवेयर को खोलें / शुरू करें।
    2. सेटअप मोड में, नया चुनें और फिर वेल एडिटर संवाद बॉक्स खोलने के लिए किसी भी वेल पर डबल-क्लिक करें। पढ़ने के लिए कुओं का चयन करें और प्रयोग चुनें: एबीएस, सुपरमिक्स: जांच के लिए डीडीपीसीआर सुपरमिक्स (कोई डीयूटीपी नहीं), लक्ष्य 1 प्रकार: सीएच 1 अज्ञात, लक्ष्य 2 प्रकार: सीएच 2 अज्ञात।
      नोट: नियंत्रण नमूने के लिए लक्ष्य 1/2 प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू से नकारात्मक, रिक्त, एनटीसी, या सकारात्मक का चयन किया जा सकता है।
    3. प्लेट लेआउट के आधार पर लक्ष्य या नमूना नाम असाइन करें और लागू करें का चयन करें। जब यह पूरा हो जाए, तो ठीक का चयन करें, और बनाए गए टेम्पलेट को सहेजें। रन पर क्लिक करें और संकेत मिलने पर सही रंग चुनें (FAM / HEX)।
      नोट: चलने से पहले सिस्टम को प्राइमिंग करने की सिफारिश दिन के पहले रन से पहले की जाती है। इसके अलावा, जांचें कि क्या पाठक में सभी रोशनी हरे रंग की हैं और यदि नहीं, तो टूल टिप स्थिति पर अनुशंसित आवेदन का पालन करें।
    4. डेटा अधिग्रहण समाप्त होने के बाद, प्लेट को रीडर से हटा दें। आवश्यकतानुसार डेटा का विश्लेषण करें.
      नोट: चूंकि प्रारंभिक परिणाम स्क्रीन पर देखे जा सकते हैं, इसलिए पहले कुओं में सकारात्मक नमूने चलाने का उपयोग वास्तविक समय की गुणवत्ता जांच के लिए किया जा सकता है।

4. डेटा विश्लेषण (पूरक आंकड़े 2 और 3)

  1. बूंदों की कुल संख्या के लिए सभी कुओं से डेटा की जांच करें। यदि बूंदों की गिनती <10,000 है, तो परिणामों को छोड़ दें और परख को दोहराएं। सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों को स्वीकार करने के लिए एक कट ऑफ सेट करें। उदाहरण के लिए, 3 या अधिक सकारात्मक बूंदों की बूंद गिनती को सकारात्मक परिणामों के लिए कट ऑफ माना जा सकता है।
    नोट: सिंप्लेक्स, डुप्लेक्स, ट्रिपलएक्स प्रोब मिक्स और चौगुनी परख सहित सभी परखों के लिए डेटा साथ के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न किया जाता है। हालांकि, यह सॉफ्टवेयर केवल सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स परख के लिए उपयुक्त है। उच्च क्रम मल्टीप्लेक्स परख (>3 लक्ष्य) के लिए, एक बाहरी सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है।
  2. सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स परख
    नोट: बाहरी सॉफ्टवेयर सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स डेटा का भी विश्लेषण कर सकते हैं। हालांकि, इन परखों के लिए साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करना आसान है, इसलिए इस लेख में उपयोग किया गया है।
    1. विश्लेषण की जाने वाली .qlp फ़ाइल पर डबल क्लिक करें और विश्लेषण का चयन करें।
    2. सही चैनल में प्रत्येक कुएं के लिए सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच अंतर करने के लिए 1 डी आयाम और 2 डी आयाम में थ्रेशोल्ड टूल का उपयोग करें। एनटीसी और सकारात्मक नियंत्रण नमूने को दहलीज सेटिंग के लिए मार्गदर्शन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: एफएएम परिणाम चैनल 1 में देखे जाते हैं जबकि एचईएक्स / वीआईसी चैनल 2 में।
    3. थ्रेशोल्ड सेटिंग के बाद, परिणामों को .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है और एक्सेल में आगे विश्लेषण किया जा सकता है या परिणाम विंडो पर सीधे पढ़कर रिकॉर्ड किया जा सकता है।
  3. ट्रिपलएक्स जांच मिश्रण (पूरक चित्रा 2) और चौगुना परख (पूरक चित्र 2)
    नोट: ट्रिपलएक्स जांच मिश्रण और चौगुनी परख का विश्लेषण करने से पहले, बाहरी सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें। स्थापना से पहले न्यूनतम सिस्टम आवश्यकताओं का संदर्भ लें।
    1. .qlp फ़ाइल को राइट क्लिक करके और बाहरी सॉफ़्टवेयर के साथ खोलें चुनकर, या बाहरी सॉफ़्टवेयर को खोलकर और अपने फ़ोल्डर में .qlp फ़ाइल का पता लगाने के लिए ब्राउज़ विकल्प पर क्लिक करके, या बस .qlp फ़ाइल को खींचकर और इसे पहले से खुले बाहरी सॉफ़्टवेयर पर छोड़कर खोलें।
    2. प्लेट संपादक टैब में, टैब के दाईं ओर विश्लेषण किए जाने वाले कुओं का चयन करें।
      1. ट्रिपलएक्स प्रोब मिक्स के लिए, प्रयोग प्रकार के रूप में डायरेक्ट परिमाणीकरण (डीक्यू) का चयन करें, परख जानकारी के रूप में प्रोब मिक्स ट्रिपलएक्स का चयन करें और तदनुसार लक्ष्य नाम दर्ज करें, और फिर लागू करें पर क्लिक करें।
      2. चौगुनी के लिए, प्रयोग प्रकार के रूप में प्रत्यक्ष परिमाणीकरण (डीक्यू) का चयन करें, परख जानकारी के रूप में आयाम मल्टीप्लेक्स का चयन करें और तदनुसार लक्ष्य नाम दर्ज करें, और फिर लागू करें पर क्लिक करें।
    3. 2D आयाम टैब के बाईं ओर, क्लस्टर विंडो पॉप अप सुझावों को असाइन करने के लिए चयन करें के बाद विभिन्न लक्ष्य समूहों को विशिष्ट रंग असाइन करने के लिए ग्राफ़ उपकरण का उपयोग करें ।
      नोट: पसंदीदा क्लस्टर मोड उपयोगकर्ताओं की वरीयता के आधार पर लागू किया जा सकता है।
    4. एक बार लक्ष्य रंग असाइन किए जाने के बाद, परिमाणीकरण डेटा को निचले दाईं ओर वेल डेटा विंडो में पढ़ा जा सकता है। वेल डेटा तालिका के ऊपरी दाएं हाथ पर ट्रिपल-बार आइकन का उपयोग करके आगे के विश्लेषण के लिए एक्सेल / सीएसवी को डेटा निर्यात करें।

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Representative Results

एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन में, मल्टीप्लेक्स परख विश्लेषणात्मक प्रदर्शन नैदानिक और अनुसंधान नमूनों19 पर परीक्षण किया गया था। मल्टीप्लेक्स परख का प्रदर्शन आरटी-पीसीआर19 की तुलना में बेहतर था। चूंकि बूंदों की कम संख्या बूंद उत्पादन के दौरान एक समस्या का संकेत दे सकती है, इसलिए इस लेख में अनुभवजन्य डेटा के आधार पर प्रति कुएं 10,000 बूंदों का कटऑफ निर्धारित किया गया था।

न्यूनतम बारिश के हस्तक्षेप के साथ सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच एक अच्छा अलगाव डेटा विश्लेषण में मदद कर सकता है। इसलिए, एक अच्छे प्रयोग में, परख अनुकूलन महत्वपूर्ण19 है। जैसा कि चित्रा 2 डी में तापमान ढाल विश्लेषण परिणामों में देखा गया है, उच्च एनीलिंग तापमान (जैसे, 65 डिग्री सेल्सियस) सकारात्मक बूंदों को नकारात्मक बूंदों से स्पष्ट रूप से अलग नहीं कर सका जब एक डुप्लेक्स परख (एन (एफएएम) और आरपीपी 30 (एचईएक्स)) चलाया गया था। हालांकि, एनीलिंग तापमान में कमी के साथ, सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच इष्टतम पृथक्करण हासिल किया गया था। 57 डिग्री सेल्सियस का तापमान इष्टतम पाया गया। यह अन्यपरखों 19 में भी देखा जा सकता है।

दो रंगों (एफएएम/एचईएक्स) आरटी-डीडीपीसीआर डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके, एक नमूने के भीतर एक (चित्रा 2 ए, बी), दो (चित्रा 2 सी), तीन (चित्रा 3 ए), और चार (चित्रा 3 बी) सार्स-सीओवी-2 लक्ष्यों का पता लगाना संभव है। डेटा विश्लेषण के दौरान, बूंदों को पढ़ने के लिए उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर केवल सिंप्लेक्स और डुप्लेक्स परख का विश्लेषण कर सकता है जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है। इसका मतलब यह है कि उच्च क्रम मल्टीप्लेक्स परख (>3 लक्ष्य) के लिए, डेटा विश्लेषण के लिए एक बाहरी सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाना चाहिए जैसा कि आंकड़े 3, एस 2 और एस 3 में दिखाया गया है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बाहरी सॉफ्टवेयर का उपयोग सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स डेटा का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है। सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स डेटा के लिए, विश्लेषण काफी सरल है क्योंकि लक्ष्यों को उनके संबंधित चैनलों में सकारात्मक या नकारात्मक बूंदों के रूप में अलग किया जाता है जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। एक एनटीसी नमूना नकारात्मक बूंदों के स्थान में मदद कर सकता है जो बदले में डेटा विश्लेषण के लिए थ्रेसहोल्ड सेट करने में मदद कर सकता है जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। डुप्लेक्स परख के लिए, विश्लेषण अलग-अलग चैनलों (चित्रा 2 बी आई, ii) या 2 डी आयाम (चित्रा 2 बी iii) में किया जा सकता है।

उच्च क्रम मल्टीप्लेक्स परख के लिए, डेटा विश्लेषण सीधा नहीं है, और ध्यान ड्रॉपलेट लक्ष्य असाइनमेंट पर केंद्रित होना चाहिए। बाहरी सॉफ़्टवेयर स्थापित करने के बाद, विश्लेषण किए जाने वाले कुओं का चयन करें, उपयुक्त प्रयोग प्रकार का चयन करें, और चित्रा एस 2 और एस 3 में दिखाए गए प्रयोग प्रकार के आधार पर लक्ष्य क्लस्टर असाइन करें। सेलेक्ट टू असाइन क्लस्टर विंडो पॉप उच्च मल्टीप्लेक्स परख में क्लस्टर असाइन करने के तरीके पर मार्गदर्शन करेगा। ट्रिपलएक्स प्रोब मिक्स परख (चित्रा 3 ए) के लिए 8 बूंद समूहों को असाइन करने के लिए ग्राफ टूल का उपयोग करें, और चौगुनी आयाम-आधारित परख (चित्रा 3 बी) के लिए 16 बूंद समूहों तक।

क्लस्टर और थ्रेसहोल्ड असाइन करने के बाद, प्रत्येक लक्ष्य के लिए प्रतियों / μL के रूप में परिमाणीकरण डेटा को बाहरी सॉफ्टवेयर के निचले दाईं ओर अच्छी तरह से डेटा विंडो में पढ़ा जा सकता है। इस डेटा का उपयोग शुरुआती नमूने में लक्ष्यों की प्रतियों की संख्या का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि नमूने के 2.2 μL का उपयोग 22 μL की अंतिम मात्रा में किया गया था, और सॉफ्टवेयर ने ORF1ab के लिए 30.5 प्रतियां / μL दर्ज की थीं, तो पीसीआर मिश्रण में ORF1ab की 30.5 x 22 = 671 प्रतियां थीं। मिश्रण में मूल नमूने का 2.2 μL था, इसलिए, शुरुआती नमूने में ORF1ab की 671 प्रतियां थीं, और मूल नमूने में ORF1ab की 671/2.2 = 305 प्रतियां / इस विधि का उपयोग सभी परखों में प्रत्येक लक्ष्य की एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।

लक्ष्य अनुक्रम 5' से 3' प्रोब डाई (ओं) उत्पाद की लंबाई (बीपी) रेफरी
ORF1ab आगे CCCTGTGGGTT
TTACACTTAA		 5'- एफएएम और बीएचक्यू 1-3'
5'- HEX और BHQ1-3'		 119 [16]
उल्टा ACGATTGTGCAT
CAGCTGA
सलाई CCGTCTGCGGT
ATGTGGAAAGG
TTATGG
N आगे GGGGAACTTC
CTGCTAGAAT		 5'- एफएएम और बीएचक्यू 1-3'
5'- HEX और BHQ1-3'		 99 [16]
उल्टा CAGACATTTTGC
TCTCAAGCTG
सलाई टीटीजीसीटीजीसीटीजीसीटी
TGACAGATT
RPP30 आगे AGTGCATGCTTA
TCTCTGACAG		 5'- HEX और BHQ1-3' 87 [8]
उल्टा GCAGGGCTATAG
ACAAGTTCA
सलाई TTTCCTGTGAAG
GCG ATTGACCGA
RBD2 आगे CTCAAGTGTCT
GTGGATCACG		 5'- एफएएम और बीएचक्यू 1-3' 121 [17]
उल्टा CCTGTGCCTGT
TAAACCATTG
सलाई ACAGCATCAGT
AGTGTCAGCAA
TGTCTC

तालिका 1: प्राइमर और जांच अनुक्रम ों का उपयोग विभिन्न सार्स-सीओवी-2 परखों को विकसित करने के लिए किया जाता है।

एनएम ए में प्रति परख प्राइमर-प्रोब की अंतिम एकाग्रता
लक्ष्य प्राइमर/जांच सिम्प्लेक्सबी डुप्लेक्ससी ट्रिपलएक्स जांच मिश्रणडी फोरप्लेक्स आयामe
ORF1ab ORF1ab F 800
ORF1ab R 800
ORF1ab FAM
ORF1ab HEX 250
N N F 800 800 800
एन आर 800 800 800
N FAM 250 125 250
N HEX 125
RPP30 RPP30 F 800 800 800 800
RPP30 R 800 800 800 800
RPP30 FAM
RPP30 HEX 250 250 250 125
RBD2 RBD2 F 800 800 800
RBD2 R 800 800 800
RBD2 FAM 250 250 125
RBD2 HEX
सभी परखों में, उपयोगकर्ताओं की प्राथमिकता के आधार पर लक्ष्यों को आपस में बदला जा सकता है। उपयोग किए गए लक्ष्य इस प्रयोग के प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए हैं।
बी एफएएम या एचईएक्स चैनल में सिम्प्लेक्स परख में एक समय में केवल एक लक्ष्य का पता लगाया जा सकता है। आरबीडी 2 का उपयोग एफएएम चैनल परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है जबकि आरपीपी 30 का उपयोग एचईएक्स चैनल के लिए किया जाता है।
सी एफएएम और एचईएक्स चैनल में डुप्लेक्स परख में एक समय में दो लक्ष्य का पता लगाया जा सकता है।
दोनों चैनलों का उपयोग करके तीन लक्ष्यों का पता लगाया जा सकता है यानी लक्ष्य 1 को एफएएम (1× जांच एकाग्रता) में, लक्ष्य दो को एचईएक्स में (1× जांच एकाग्रता), और दोनों चैनलों में लक्ष्य 3 (अंतिम 1× बनाने के लिए 0.5× एचईएक्स और 0.5× एफएएम जांच कॉन्सेंट्रेटिन का मिश्रण) का पता लगाया जाएगा।
प्रत्येक चैनल (एफएएम और एचईएक्स) में दो लक्ष्यों का पता लगाया जाता है, जिसमें प्रत्येक चैनल में 1× और ओ.5× जांच एकाग्रता होती है।

तालिका 2: प्रति परख विभिन्न प्राइमर और जांच जोड़े की अंतिम एकाग्रता।

Figure 1
चित्रा 1: नमूना प्रसंस्करण और ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर वर्कफ़्लो। (ए) नमूना प्रसंस्करण वर्कफ़्लो में बीएसएल -2 सुविधा में नमूना संग्रह और परिवहन, निष्क्रियता, निष्कर्षण और सीडीएनए उत्पादन शामिल हैं। (बी) ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर वर्कफ़्लो मास्टरमिक्स की तैयारी के साथ शुरू होता है, मास्टरमिक्स को डीडीपीसीआर प्लेट में लोड करता है और नमूना (ओं) को जोड़ता है, बूंदों को उत्पन्न करता है, पीसीआर द्वारा बूंदों के अंदर लक्ष्य को बढ़ाता है, और अंत में ड्रॉपलेट रीडर का उपयोग करके प्रवर्धित बूंदों को पढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स परख परिणाम, जिसमें एनीलिंग तापमान अनुकूलन भी शामिल है। (ए) सिम्प्लेक्स परख परिणाम तब होता है जब एकल लक्ष्य (आरबीडी 2) को एफएएम लेबल किया गया था। (बी) सिम्प्लेक्स परख के परिणाम तब होते हैं जब एक एकल लक्ष्य (आरपीपी 30) एचईएक्स लेबल किया गया था। (C) 1D और 2D में दो लक्ष्यों के डुप्लेक्स परख परिणाम (iii) N (i) के बाद चैनलों को FAM लेबल किया गया था और RPP30 (ii) को HEX लेबल किया गया था। (डी) ओआरएफ 1 एबी (एफएएम) और आरपीपी 30 (एचईएक्स) के साथ लेबल किए गए डुप्लेक्स परख के एनीलिंग तापमान ढाल (65 डिग्री सेल्सियस से 55 डिग्री सेल्सियस) परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रिपलएक्स जांच मिश्रण और चौगुनी आयाम-आधारित मल्टीप्लेक्स परख परिणाम। (ए) ट्रिपलएक्स जांच मिश्रण परख परिणाम जब तीन लक्ष्यों को एफएएम: एचईएक्स के निम्नलिखित अनुपातों के साथ लेबल किया गया था; आरबीडी 2 (1: 0), एन (0.5: 0.5), और आरपीपी 30 (0: 1)। (बी) चार लक्ष्यों के बाद चौगुनी आयाम-आधारित परख परिणामों को एफएएम: एचईएक्स के निम्नलिखित अनुपातों के साथ लेबल किया गया था; RBD2 (0.5:0), N (1:0), RPP30 (0:0.5), और ORF1ab (0:1)। 1 और 0.5 क्रमशः 250 एनएम और 125 एनएम जांच सांद्रता हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: एक स्वचालित बूंद जनरेटर का उपयोग करके बूंद उत्पादन। (ए) ऑटोडीजी स्थापित करने के लिए आवश्यक उपभोग्य सामग्री। (बी) ऑटोडीजी टच स्क्रीन पर, नमूना प्लेट को कॉन्फ़िगर करें और उन स्तंभों का चयन करें जहां नमूने नमूना प्लेट पर स्थित हैं और ओके दबाएं। (सी) एक बार चुने जाने के बाद, स्क्रीन पीले रंग की हो जाती है जो दर्शाता है कि उपभोग्य सामग्रियों को कहां लोड किया जाना चाहिए। (डी) ऑटोडीजी दरवाजा खोलें और संबंधित स्थानों पर उपभोग्य सामग्रियों को लोड करें। सामने की ओर काम करते हुए पीछे से उपभोग्य सामग्रियों को लोड करें। सुनिश्चित करें कि हर बार जब एक उपभोग्य जोड़ा जाता है तो प्रकाश उस स्थान पर पीले से हरे रंग में बदल जाता है। (ई) सुनिश्चित करें कि जांच के लिए उपयोग किया जाने वाला तेल प्रकार तेल है। (एफ) ऑटोडीजी दरवाजा बंद करें और सुनिश्चित करें कि ऑटोडीजी टच स्क्रीन हरे रंग की है या नहीं, यह जांचकर सभी अभिकर्मकों को सेट किया गया है। (छ) बूंदों को उत्पन्न करने के लिए स्टार्ट ड्रॉपलेट जनरेशन दबाएं। (एच) ड्रॉपलेट जनरेशन पूरा होने के बाद, ऑटोडीजी खोलें और ड्रॉपलेट प्लेट को हटा दें। (I) एक छेद योग्य पन्नी गर्मी सील का उपयोग करके बूंद प्लेट को सील करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: बाहरी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आयाम-आधारित मल्टीप्लेक्स डीडीपीसीआर परख परिणामों के विश्लेषण पर कदम। (A) किसी कंप्यूटर पर बाहरी सॉफ़्टवेयर स्थापित करें। (B) .qlp फ़ाइल को या तो उस पर राइट क्लिक करके खोलें और स्थापित बाहरी सॉफ़्टवेयर के साथ खोलें या बाहरी सॉफ़्टवेयर खोलें और अपने फ़ोल्डर में फ़ाइल का पता लगाने के लिए ब्राउज़ करें विकल्प पर क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से, कोई .qlp फ़ाइल को खींच सकता है और इसे खोलने के लिए इसे खुला बाहरी सॉफ़्टवेयर छोड़ सकता है। (सी) एक बार खोलने के बाद, प्लेट एडिटर टैब के दाईं ओर, ड्रॉप-डाउन मेनू से प्रोब मिक्स ट्रिपलएक्स चुनें और तदनुसार लक्ष्य जानकारी असाइन करें, और लागू करें पर क्लिक करें। (डी) 2 डी आयाम टैब के बाईं ओर, पहचान और परिमाणीकरण के लिए विभिन्न लक्ष्यों को विशिष्ट रंग असाइन करने के लिए ग्राफ टूल का उपयोग करें। एक बार ड्रॉपलेट क्लस्टर लक्ष्यों की पहचान हो जाने के बाद, परिमाणीकरण परिणाम उसी 2 डी आयाम टैब में वेल डेटा विंडो पर देखे जा सकते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: बाहरी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आयाम आधारित मल्टीप्लेक्स डीडीपीसीआर परख परिणामों के विश्लेषण पर कदम। (A) किसी कंप्यूटर पर बाहरी सॉफ़्टवेयर स्थापित करें। (B) .qlp फ़ाइल को या तो उस पर राइट क्लिक करके खोलें और स्थापित बाहरी सॉफ़्टवेयर के साथ खोलें , या बाहरी सॉफ़्टवेयर को खोलकर और अपने फ़ोल्डर में फ़ाइल का पता लगाने के लिए ब्राउज़ विकल्प पर क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से, कोई .qlp फ़ाइल को खींच सकता है और इसे खोलने के लिए पहले से खुले बाहरी सॉफ़्टवेयर में छोड़ सकता है। (सी) एक बार खोलने के बाद, प्लेट एडिटर टैब के दाईं ओर, ड्रॉप-डाउन मेनू से आयाम मल्टीप्लेक्स चुनें और तदनुसार लक्ष्य जानकारी असाइन करें, और लागू करें पर क्लिक करें। (डी) 2 डी आयाम टैब के बाईं ओर, पहचान और परिमाणीकरण के लिए विभिन्न लक्ष्यों को विशिष्ट रंग असाइन करने के लिए ग्राफ टूल का उपयोग करें। एक बार ड्रॉपलेट क्लस्टर लक्ष्यों की पहचान हो जाने के बाद, परिमाणीकरण परिणाम उसी 2 डी आयाम टैब में वेल डेटा विंडो पर देखे जा सकते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए आरटी-डीडीपीसीआर परख विकसित करने के तरीके पर कुछ संसाधन उपलब्ध हैं। हालांकि इस लेख में उपयोग नहीं किया गया है, ज्ञात प्रतियों के साथ मानक नमूने का उपयोग परख विकसित करने और अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस काम में, वेरो-ई 6 कोशिकाओं में उगाए गए सार्स-सीओवी-2 नमूनों को मानव जीनोमिक आरएनए की पृष्ठभूमि में स्पाइक किया गया था और परख विकसित करने के लिए मानक नमूने के रूप में उपयोग किया गया था। परख विकसित करते समय उचित प्राइमर और जांच अनुक्रम आवश्यक हैं। चूंकि सार्स-सीओवी-2 आरटी-डीडीपीसीआर पर अधिकांश प्रारंभिक कार्यों में ओआरएफ1एबी और एन जीन को लक्षित करने वाले चीन सीडीसी प्राइमर और जांच का उपयोग किया गया था, इसलिए उन्होंने उन्हेंइस काम में शामिल होने के लिए फिट पाया था। इन प्राइमरों की विश्लेषणात्मक विशिष्टता और संवेदनशीलता की तुलना पिछले काम 7 में डीडीपीसीआर का उपयोग करके भी की गईहै। आरबीडी 2 प्राइमर और प्रोब13 को इन-हाउस विकसित किया गया था और आरटी-डीडीपीसीआर के लिए फिट पाया गया था। चूंकि परख का उपयोग निदान सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, इसलिए राइबोन्यूक्लिज़ पी प्रोटीन सबयूनिट पी 30 (आरपीपी 30) विशिष्ट मानव जीन को सभी मल्टीप्लेक्स परखों में शामिल किया गया था। इन जीनों का उपयोग नैदानिक प्रयोगों के लिए मानव अंतर्जात नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, पर्यावरणीय नमूने या अन्य शोध के मामले में जिन्हें मानव संदर्भ जीन की आवश्यकता नहीं है, कोई इस लक्ष्य को दूसरे सार्स-सीओवी-2 लक्ष्य के साथ बदल सकता है।

सभी परखों में, परख और प्रयोगात्मक डेटा को मान्य करने के लिए नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है। इन नियंत्रणों में शामिल हो सकते हैं: एनटीसी (नमूने के रूप में न्यूक्लियस मुक्त पानी) थ्रेसहोल्ड सेट करने और नकारात्मक बूंद क्लस्टर का पता लगाने में मदद करने के लिए; अभिकर्मक विफलता, प्राइमर और जांच अखंडता का आकलन करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण (मानव संदर्भ जीन सहित सभी सार्स-सीओवी-2 लक्ष्यों के साथ नमूना), और सकारात्मक बूंद लक्ष्यों के पर्याप्त रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन डिटेक्शन / स्थान; और निष्कर्षण चरण विफलता या सफलता का पता लगाने के लिए निष्कर्षण नियंत्रण (स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र किए गए मानव नमूने या एक गैर-संक्रामक सुसंस्कृत मानव कोशिका से निकाले गए कुल न्यूक्लिक एसिड)।

QX200 सिस्टम सहित अधिकांश DDPCR सिस्टम में 1 से 120,000 प्रतियों / 20 μL प्रतिक्रिया से एक संकीर्ण गतिशील सीमा होती है। अज्ञात नमूनों का पता लगाते समय, शुरुआती नमूने में लक्ष्य एकाग्रता अक्सर अज्ञात होती है और अत्यधिक केंद्रित नमूनों की मात्रा निर्धारित करते समय यह चुनौतियां पैदा कर सकती है। इसे दूर करने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि उच्च मात्रा में लक्ष्य अणुओं (जैसे सेल कल्चर) वाले संदिग्ध नमूनों की मात्रा निर्धारित करते समय, किसी को तदनुसार शुरुआती नमूने को कम करने की योजना बनानी चाहिए। उस मामले में जहां लक्ष्य प्रतिलिपि संख्या / जीनोम अज्ञात है, किसी को अपेक्षित डिजिटल रेंज पर प्रत्येक नमूने के चार दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने की श्रृंखला के माध्यम से इष्टतम प्रारंभिक राशि निर्धारित करनी चाहिए। इन चार बिंदुओं को परखकर, यह सुनिश्चित किया जाता है कि डेटा बिंदुओं में से एक इष्टतम डिजिटल सीमा के भीतर है।

उच्च प्राइमर और कम जांच एकाग्रता का उपयोग करना अधिकांश सिम्प्लेक्स और डुप्लेक्स डीडीपीसीआर प्रयोगों का एक अनुलाभ है। एकाग्रता में यह अंतर सकारात्मक और नकारात्मक बूंद समूहों के बीच आयाम पृथक्करण दूरी को बढ़ाता है, इसलिए डेटा का विश्लेषण करना आसान हो जाता है। हालांकि, उच्च क्रम मल्टीप्लेक्स परख विकसित करते समय, इन सांद्रता में परिवर्तन से सकारात्मक बूंद लक्ष्यों की स्थिति में परिवर्तन हो सकता है जैसा कि चित्र 3 और 4 में दिखाया गया है। नतीजतन, एनीलिंग तापमान के अलावा एक परख अनुकूलन विकल्प बूंदों को अलग करने के लिए लक्ष्य प्राइमर या जांच एकाग्रता को बदलना होगा। इस घटना का उपयोग 14,15,16 से पहले किया गया है और समझाया गया है।

परख प्रदर्शन के बावजूद, यह काम दो-चरण आरटी-डीडीपीसीआर वर्कफ़्लो है। डीडीपीसीआर से पहले अतिरिक्त रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण, नमूनों के संदूषण के लिए जगह देता है। हालांकि, यदि सावधानीपूर्वक और उचित नमूना हैंडलिंग तकनीकों का उपयोग किया जाता है, तो यह एक गैर-मुद्दा होगा। सकारात्मक रूप से, डीएनए को आरएनए की तुलना में अधिक स्थिर माना जाता है। आरएनए को सीडीएनए में बदलने से आरएनए की तुलना में भंडारण के दौरान नमूने की शेल्फ लाइफ बढ़ सकती है। एक दो-चरण आरटी-डीडीपीसीआर प्रयोग भी एक-चरण आरटी-डीडीपीसीआर प्रयोग की तुलना में सस्ता है।

आरटी-क्यूपीसीआर की तुलना में, आरटी-डीडीपीसीआर महंगा है। इसलिए, आरटी-डीडीपीसीआर करते समय विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, निदान के दौरान, कोई उस मामले में आरटी-डीडीपीसीआर का उपयोग कर सकता है जहां उनके नमूनों में कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य होते हैं। हालांकि, एक संभावना है कि डीपीसीआर उपकरणों और अभिकर्मकों की लागत जल्द ही गिर जाएगी, और तकनीक को कई प्रयोगशालाओं में अनुकूलित किया जाएगा, जैसा कि अतीत में नियमित पीसीआर और क्यूपीसीआर के साथ हुआ था। इसलिए, डीपीसीआर के वर्तमान और भविष्य के उपयोगकर्ताओं के लिए इस तरह के प्रोटोकॉल सेट करना महत्वपूर्ण है। अंत में, विकसित परख संभावित उपयोगकर्ताओं को उनके अनुप्रयोगों के आधार पर लक्ष्यों को अलग-अलग करने के लिए जगह देते हैं। मल्टीप्लेक्सिंग यह सुनिश्चित करेगा कि कोई एक ही प्रतिक्रिया में एक नमूने के भीतर कई लक्ष्यों का कुशलतापूर्वक पता लगा सके। अब तक, यह पहला प्रोटोकॉल हो सकता है जो सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने में बाहरी सॉफ्टवेयर सहित ऑटोडीजी सिस्टम का उपयोग करने के तरीके पर पूर्ण विवरण देता है। चौगुनी परख में बेहतर पृथक्करण प्राप्त करने के लिए परख अनुकूलन पर अधिक काम करने की आवश्यकता है। मानकों के उपयोग से विकसित परखों को बेहतर बनाने में भी मदद मिलेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को चीन के स्वास्थ्य मंत्रालय से संक्रामक रोग नियंत्रण के मेगाप्रोजेक्ट, अनुदान संख्या 2017 जेडएक्स 10302301-005 और चीन-अफ्रीका संयुक्त अनुसंधान केंद्र, अनुदान संख्या एसएजेसी 201605 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 Genfine Biotech FHT101-32 Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes BioRad 12003017 QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates BioRad 12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) BioRad 1863024 Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges BioRad 1864108 QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot Beijing Changfeng Instrument and Meter Company XMTD-8000 Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit Genfine Biotech FMY502T5 Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals BioRad 1814040
Pipet Tips for the AutoDG BioRad 1864120 QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG BioRad 1864125 QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) TaKaRa RR036A cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer BioRad 1814000 Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software BioRad 10026368 Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0 BioRad N/A Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) BioRad 1864101 QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader BioRad 1864003 Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096 Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation

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References

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Nyaruaba, R., Li, X., Mwaliko, C., Li, C., Mwau, M., Odiwour, N., Muturi, E., Muema, C., Li, J., Yu, J., Wei, H. Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification. J. Vis. Exp. (169), e62295, doi:10.3791/62295 (2021).

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