Summary
Este trabajo resume los pasos para desarrollar diferentes ensayos para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Los pasos son elaborados y se han incluido notas sobre cómo mejorar los ensayos y el rendimiento del experimento. Estos ensayos se pueden utilizar para múltiples aplicaciones RT-ddPCR del SARS-CoV-2.
Abstract
El diagnóstico de la actual pandemia de SARS-CoV-2 es una prioridad para todos los países del mundo. Actualmente, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es el estándar de oro para el diagnóstico del SARS-CoV-2, ya que no hay una solución permanente disponible. Por muy efectiva que pueda ser esta técnica, han surgido investigaciones que muestran sus limitaciones en la detección y el diagnóstico, especialmente cuando se trata de objetivos poco abundantes. Por el contrario, se ha demostrado que la PCR digital por gotas (ddPCR), una tecnología emergente reciente con ventajas superiores a la qPCR, supera los desafíos de la RT-qPCR en el diagnóstico del SARS-CoV-2 a partir de muestras objetivo poco abundantes. Prospectivamente, en este artículo, las capacidades de RT-ddPCR se amplían aún más al mostrar los pasos sobre cómo desarrollar ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruples utilizando un sistema de detección de dos colores. Usando cebadores y sondas dirigidas a sitios específicos del genoma del SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 y RBD2), se demuestra que el desarrollo de estos ensayos es posible. Además, se proporcionan protocolos detallados paso a paso, notas y sugerencias sobre cómo mejorar el flujo de trabajo de ensayos y analizar datos. La adaptación de este flujo de trabajo en trabajos futuros garantizará que el número máximo de objetivos se pueda detectar con sensibilidad en una muestra pequeña, lo que mejorará significativamente el costo y el rendimiento de la muestra.
Introduction
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica bien reconocida, ha sufrido varias transformaciones desde su advenimiento para convertirse en una técnica poderosa capaz de proporcionar respuestas a la investigación de ácidos nucleicos. Estas transformaciones han sido una mejora constante de la vieja técnica. Estas transformaciones se pueden resumir en tres generaciones1. La primera generación es la PCR convencional que se basa en la electroforesis en gel para cuantificar y detectar objetivos amplificados. La segunda generación es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) que puede detectar muestras en tiempo real y basarse en una curva estándar para cuantificar directamente los objetivos en una muestra. La tercera generación, la PCR digital (dPCR), puede realizar tanto la detección como la cuantificación absoluta de objetivos de ácidos nucleicos sin necesidad de una curva estándar. La dPCR también se ha mejorado aún más a partir de cámaras de reacción separadas por los pozos de una pared en emulsiones de aceite, agua y productos químicos estabilizadores dentro del mismo pozo, como se ve en laPCR digital 2 basada en gotas. En la PCR digital de gotas (ddPCR), una muestra se divide en miles de gotas de tamaño nanolitro que contienen objetivos individuales que luego se cuantificarán utilizando las estadísticas de Poisson 2,3,4. Esta técnica le da a ddPCR una ventaja en la cuantificación de objetivos poco abundantes en comparación con las otras generaciones de PCR.
Recientemente, múltiples aplicaciones han puesto de relieve la superioridad de la ddPCR sobre la qPCR comúnmente utilizada al detectar y cuantificar objetivos de baja abundancia 1,5,6. El SARS-CoV-2 no es una excepción a estas aplicaciones 7,8,9,10,11,12. Desde el brote de SARS-CoV-2, los científicos han estado trabajando en todos los frentes para encontrar soluciones sobre cómo diagnosticar el virus y detectarlo de manera eficiente. El estándar de oro actual sigue siendo qPCR13. Sin embargo, se ha demostrado que la RT-ddPCR es más precisa en la detección de objetivos de SARS-CoV-2 de baja abundancia tanto en muestras ambientales como clínicas en comparación con RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La mayoría de los trabajos publicados de ddPCR del SARS-CoV-2 dependen de ensayos simples, y los multiplexores dependen de ensayos comerciales. Por lo tanto, se debe hacer más para explicar cómo desarrollar ensayos RT-dPCR multiplex para la detección del SARS-CoV-2.
En un diseño de ensayo adecuado, la multiplexación se puede utilizar para ahorrar costos, aumentar el rendimiento de la muestra y maximizar el número de objetivos que se pueden detectar con sensibilidad dentro de una muestra pequeña. Al multiplexar con ddPCR, se debe tener en cuenta cuántos fluoróforos se pueden detectar en un sistema en particular. Algunas plataformas ddPCR pueden admitir hasta tres canales, mientras que otras solo admiten dos canales. Por lo tanto, cuando se multiplexa con dos canales, uno tiene que usar diferentes enfoques, incluida la multiplexación de orden superior para detectar más de dos objetivos14,15,16. En este trabajo, se utiliza un sistema de detección ddPCR de dos colores para mostrar los pasos sobre cómo desarrollar diferentes ensayos RT-ddPCR del SARS-CoV-2 que se pueden adaptar para diferentes aplicaciones de investigación.
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Protocol
Declaración ética
El Instituto de Virología de Wuhan (WHIOV) se encuentra entre los laboratorios e institutos aprobados por los CDC de China de la ciudad de Wuhan para realizar investigaciones sobre el SARS-CoV-2 y detectar COVID-19 a partir de muestras clínicas. La investigación sobre el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico para COVID-19 utilizando muestras clínicas también ha sido aprobada por el comité ético del Instituto de Virología de Wuhan (2020FCA001).
1. Flujo de trabajo de procesamiento de muestras (Figura 1A)
NOTA: En todo el protocolo, es importante utilizar salas separadas con pipetas dedicadas para la manipulación de muestras (extracción y almacenamiento), preparación y almacenamiento de reactivos/mastermix, preparación de mezclas de reacción (muestra más mastermix) y detección, para evitar la contaminación cruzada. Los ensayos a desarrollar se pueden utilizar en la detección de muestras clínicas o muestras de investigación. Todas las muestras deben tratarse como si pudieran transmitir agentes infecciosos, incluso cuando se utilizan procedimientos de laboratorio seguros. Los pasos de procesamiento de muestras deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) siguiendo las estrictas reglas BSL-2, incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado.
- Inactivación de la muestra
- Lleve 1 ml de muestra de SARS-CoV-2 a un laboratorio BSL-2. Inactivar las muestras por calor a 65 °C durante 30 min.
NOTA: Las muestras pueden provenir de varias fuentes, por lo tanto, uno debe asegurarse de que el volumen a inactivar sea suficiente para asegurar la extracción posterior de ARN. La mayoría de los kits de extracción requieren un pequeño volumen de muestra de hasta 200 μL, por lo tanto, un volumen de muestra de aproximadamente 1 ml sería suficiente para la inactivación. Los surfactantes, kits y tampones de lisis también se pueden usar para la inactivación directa y la extracción de ARN de acuerdo con el propio POE de laboratorio. - Lleve las muestras a un gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelas reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que los aerosoles potenciales se asienten. Almacenar las muestras a 4 °C durante un máximo de 24 h si no se procesan inmediatamente.
NOTA: No se requiere ningún contenedor específico para el almacenamiento de muestras. Las muestras pueden almacenarse en los tubos o recipientes utilizados durante la inactivación. Para este trabajo, la mayoría de las muestras se almacenaron en tubos de medios de transporte viral (VTM) o tubos de 1,5 ml.
- Lleve 1 ml de muestra de SARS-CoV-2 a un laboratorio BSL-2. Inactivar las muestras por calor a 65 °C durante 30 min.
- Extracción de ARN
NOTA: Muchos instrumentos y kits de extracción de ARN con protocolos específicos están disponibles para su uso inmediato. Aquí, se presenta un procedimiento automatizado siguiendo las instrucciones del fabricante.- Saque la placa de orificio de pozo precargada de 96 profundidades; Invierta suavemente boca abajo para mezclar las perlas magnéticas. Después de mezclar, agite suavemente la placa sobre una superficie plana para concentrar el reactivo y las perlas magnéticas que puedan estar en la pared hasta la parte inferior de la placa.
- Arranque con cuidado la película de sellado de papel de aluminio para evitar la vibración de la placa y el derrame de líquido. Añadir 20 μL de proteinasa K y 200 μL de la muestra por pocillo en las filas 2 y 8 de la placa de 96 pocillos. Luego, coloque la placa de 96 pocillos en la base del instrumento automático de extracción automática de ácidos nucleicos de 32 canales.
Nota : ejecute el programa en el equipo dentro de 1 h después de agregar el ejemplo. - Inserte la funda de la barra magnética en la ranura para tarjetas del instrumento de extracción automática de ácidos nucleicos de 32 canales. Seleccione el programa GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (versión rápida) y ejecútelo.
- Una vez completada la extracción, extraer las muestras de ácido nucleico en las filas 6 y 12 (aproximadamente 100 μL/muestra) y distribuir en una placa limpia de 96 pocillos libre de nucleasas. Conservar las muestras a 4 °C durante un máximo de 24 h hasta su uso o a -20 °C durante más tiempo.
NOTA: Se recomienda utilizar una pipeta multicanal de 100 μL para transferir muestras a una nueva placa de 100-200 μL, ya que puede coincidir directamente con las columnas de la placa de muestra.
- Generación de ADNc
NOTA: Para muestras almacenadas durante mucho tiempo, evite múltiples ciclos de congelación/descongelación. Realice la generación de ADNc utilizando un kit de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante.- En un tubo de PCR de 100 o 200 μL colocado sobre hielo/bloque de enfriamiento, agregue 2 μL de mezcla maestra 5x RT (por ejemplo, Perfect Real Time), 5 μL de ARN de muestra y 3 μL de ddH2O libre de RNasa por reacción (volumen total 10 μL).
- Coloque el tubo de PCR en un termociclador configurado para funcionar a 37 °C durante 15 min (transcripción inversa), 85 °C durante 5 s (inactivación térmica de la transcriptasa inversa) y 4 °C durante un tiempo infinito.
NOTA: Procese las muestras inmediatamente o guárdelas a 4 °C durante un máximo de 24 h hasta su uso o a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
2. Optimización del ensayo y flujo de trabajo de ddPCR
NOTA: Optimice los ensayos antes/después de leer las gotas. Dependiendo de los resultados, se pueden optimizar en cualquier punto del trabajo para lograr mejores resultados. A continuación se presentan algunos factores comunes a considerar al optimizar los experimentos de ddPCR.
- Validar los cebadores y sondas ddPCR (Tabla 1).
NOTA: Los cebadores ORF1ab y N fueron adaptados de China CDC17, el gen de control endógeno humano (RPP30) de Lu et al.18, y RBD2 de Nyaruaba et al.13. Todos los cebadores y sondas, excepto RBD2, ya habían sido probados y optimizados por ddPCR 7,8,18. - Ejecute los controles de muestra de prueba ddPCR que comprenden un control positivo (una muestra con los cuatro objetivos), Sin control de plantilla (NTC; Agua libre de nucleasa o muestra sin objetivos), y extracción/control negativo (ácido nucleico total extraído de una célula humana cultivada no infecciosa o muestras agrupadas de voluntarios sanitarios).
NOTA: Se prefieren las muestras de control estándar con copias conocidas de genes diana. Sin embargo, en ausencia de estándares, utilice las muestras disponibles para definir sus controles o matriz de muestras. Ejecute los controles junto con muestras de prueba. - Optimice la temperatura de recocido (Figura 2D) insertando un gradiente de temperatura de 55 °C a 65 °C en la etapa de recocido de la PCR (paso 3.2).
NOTA: La optimización de la temperatura de recocido ayuda a encontrar la mejor temperatura donde la separación de gotas es máxima (fácil identificación del objetivo) con una lluvia mínima. Después de obtener los resultados, reduzca el rango de temperatura para una mejor optimización, por ejemplo, de 55 °C a 60 °C. - Optimice las concentraciones de cebador y sonda. Si no se logra una separación óptima entre gotitas positivas y negativas en los ensayos, varíe las concentraciones de cebador (300-900 nM) y/o sonda (100-400 nM).
NOTA: La reducción de las concentraciones de cebador/sonda da como resultado una menor amplitud de gota objetivo y aumentarla también aumenta la amplitud del objetivo. Esto puede ser útil en la multiplexación basada en amplitud. - Pruebe la sensibilidad analítica teniendo en cuenta diferentes parámetros, incluidos, límite de espacio en blanco (LoB), límite de detección (LoD), especificidad y sensibilidad utilizando muestras estándar y de prueba, según se prefiera.
3. flujo de trabajo de ddPCR (Figura 1B) y desarrollo del ensayo (Tabla 2)
NOTA: Al igual que otros sistemas de detección de ddPCR, este flujo de trabajo también consta de cuatro pasos (Figura 1B), que incluyen la preparación de la mezcla de reacción, la generación de gotas, la amplificación por PCR y la lectura de gotas.
- Preparación de la mezcla de reacción
NOTA: Prepare todos los ensayos en una habitación limpia y separada y dentro de un BSC. Observe las precauciones estándar, incluido el uso de guantes limpios, pipetas limpias, agua libre de nucleasas y desinfectantes. Reactivos alícuotas en tubos separados y almacenar a -20 oC para evitar ciclos repetidos de descongelación por congelación. Prepare los ensayos como se muestra en la Tabla 2. Las soluciones madre de cebador y sonda deben almacenarse en altas concentraciones de 100 μM. Las soluciones de trabajo pueden almacenarse en alícuotas de 20-40 μM (diluidas en agua libre de nucleasas).- Pasos comunes en todos los ensayos
NOTA: Antes de preparar los ensayos, calcule el volumen total de mastermix necesario en función del número de muestras. Aquí, cada volumen de componente de mastermix se multiplicó por 1,05 para tener en cuenta cualquier error de pipeteo.- Descongelar y equilibrar los materiales de reacción a temperatura ambiente. Vortex los componentes de las reacciones brevemente (30 s) para asegurar la homogeneidad, y centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.
- Prepare una mezcla de cebador-sonda (PP) por ensayo mezclando volúmenes de reacción específicos como se detalla en la Tabla 2 de las soluciones de trabajo.
- Prepare la mezcla maestra mezclando 11 μL (1x) de supermezcla 2x ddPCR para sondas (sin dUTP), mezcla de PP (dependiendo del ensayo como se muestra en la Tabla 2 de la solución de trabajo) y agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 19.8 μL por pocillo. Distribuya la mezcla maestra en los pocillos de una placa ddPCR de 96 pocillos libre de nucleasas en función del número de muestras.
NOTA: Para la placa de muestra, asegúrese de que los 8 pocillos en una columna tengan la solución. Si solo se usan unos pocos pozos, por ejemplo, 5 muestras, llene los otros 3 pocillos con 22 μL de agua libre de nucleasas o controle cada uno. - Para obtener el volumen de la mezcla de reacción final (22 μL), agregue 2.2 μL de muestra de ADNc por pocillo que contenga mastermix. Selle la placa con un sellador de placas de PCR desechable.
NOTA: Realice las adiciones de muestra en la sala designada. Incluya los controles, es decir, positivo, NTC y extracción. Además, si las muestras de ARN son de baja concentración, reduzca el volumen de agua en la mezcla maestra y aumente el volumen de la muestra en consecuencia hasta 5,5 uL. - Una vez que la mezcla de reacción se distribuye por pozo, vórtice brevemente (15-30 s) y centrifuga (10-15 s) para recoger el contenido en el fondo de la placa. Proceda a la generación de gotas.
- Pasos comunes en todos los ensayos
- Generación automatizada de gotas (Figura suplementaria 1)
NOTA: Se pueden utilizar diferentes generadores de gotas; sin embargo, este estudio se realizó con un generador automático de gotas (AutoDG). Para evitar la contaminación del amplicón, asegúrese de que el generador de gotas y los lectores tengan espacio dedicado en áreas separadas. Al cargar consumibles, se recomienda comenzar a cargar desde la parte posterior del instrumento trabajando hacia el frente para evitar mover las manos sobre los consumibles para evitar la contaminación cruzada.- Obtenga todos los consumibles necesarios para configurar el AutoDG, incluido el aceite AutoDG para sondas, los cartuchos DG32, las puntas de pipeta, el bloque de refrigeración, la placa de muestra, la placa de gotas (nueva placa ddPCR limpia) y un contenedor de basura.
- En la pantalla táctil de AutoDG, toque Configurar placa de muestra y seleccione las columnas donde se encuentran las muestras en la placa de muestra y pulse OK.
NOTA: La pantalla se volverá amarilla indicando LOAD donde se deben cargar los consumibles. - Abra la puerta de AutoDG y cargue los consumibles en sus respectivos lugares.
NOTA: Los respectivos lugares donde se deben cargar los consumibles tendrán un indicador amarillo que luego se volverá verde si se cargan los consumibles. Esto es similar a la pantalla táctil. - Cargue la placa de muestra y la placa de generación de gotas.
NOTA: La placa de generación de gotas debe colocarse en el bloque de enfriamiento. Asegúrese de que el bloque de enfriamiento sea púrpura (listo para usar) y no rosa (debe mantenerse en un congelador hasta que el color vuelva a ser púrpura). - Cierre la puerta de AutoDG, asegúrese de que la pantalla esté verde (consumibles cargados) y seleccione/asegúrese de que el tipo de aceite sea Aceite para sondas antes de pulsar Iniciar generación de gotas.
- Espere a que se generen las gotas. Abra la puerta una vez que la pantalla muestre Droplets Ready y retire la placa que contiene las gotas.
- Selle la placa con un sello de lámina perforable utilizando un sellador de placas configurado para funcionar a 185 oC durante 5 s. Proceda a la amplificación por PCR.
NOTA: La amplificación por PCR debe iniciarse dentro de los 30 minutos posteriores a la generación de gotas.
- Amplificación por PCR
- Inserte la placa de gotas sellada en un termociclador de pozo de 96 profundidades, ajuste el volumen de muestra a 40 μL y la temperatura de la tapa a 105 °C.
- La PCR amplifica las gotitas utilizando el programa: 95 °C durante 10 min (activación enzimática), 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s y 1 min de recocido/extensión a 57 °C, desactivación enzimática a 98 °C durante 10 min, y paso de retención a 4 °C indefinidamente. Después de la PCR, leer las gotitas o almacenar a 4 °C durante un máximo de 24 h.
NOTA: Utilice una velocidad de rampa de 2 °C / s en todos los pasos, ya que las tasas de rampa pueden diferir para diferentes termocicladores. Mantenga la placa durante al menos 30 minutos a 4 °C para permitir la estabilización de las gotas antes de leer las gotas.
- Lectura de gotitas
- Transfiera la placa de 96 pocillos con ciclo térmico a un lector de gotas y, en una computadora conectada al lector de gotas, abra / inicie el software que lo acompaña.
- En el modo de configuración, seleccione Nuevo y, a continuación, haga doble clic en cualquier pozo para abrir el cuadro de diálogo Editor de pozos . Seleccione los pocillos a leer y elija Experimento: ABS, Supermix: ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP), Tipo de objetivo 1: Ch1 desconocido, Tipo de objetivo 2: Ch2 desconocido.
NOTA: Se puede seleccionar negativo, en blanco, NTC o positivo en el menú desplegable de tipo 1/2 de destino para las muestras de control. - Asigne los nombres de destino o de muestra según el diseño de la placa y seleccione Aplicar. Cuando haya terminado, seleccione Aceptar y guarde la plantilla creada. Haga clic en Ejecutar y, cuando se le solicite, elija el color correcto (FAM / HEX).
NOTA: Se recomienda preparar el sistema antes de correr antes de la primera ejecución del día. Además, compruebe si todas las luces del lector son verdes y, si no, siga la aplicación recomendada en el estado de la información sobre herramientas. - Una vez finalizada la adquisición de datos, retire la placa del lector. Analice los datos según sea necesario.
NOTA: Dado que los resultados preliminares se pueden ver en la pantalla, la ejecución de las muestras positivas en los primeros pozos se puede utilizar para el control de calidad en tiempo real.
4. Análisis de datos (figuras complementarias 2 y 3)
- Verifique los datos de todos los pozos para ver el número total de gotas. Si el recuento de gotitas es <10,000, descarte los resultados y repita el ensayo. Establezca un corte para aceptar resultados positivos y negativos. Por ejemplo, un recuento de gotitas de hasta 3 o más gotitas positivas puede considerarse como el límite para obtener resultados positivos.
NOTA: Los datos de todos los ensayos, incluidos los ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruplex, se generan utilizando el software adjunto. Sin embargo, este software solo es adecuado para ensayos simplex y dúplex. Para ensayos multiplexores de alto orden (>3 objetivos), se necesita un software externo. - Ensayos símplex y dúplex
NOTA: El software externo también puede analizar datos símplex y dúplex. Sin embargo, el uso del software que lo acompaña es más fácil para estos ensayos, por lo tanto, se utiliza en este artículo.- Haga doble clic en el archivo .qlp a analizar para abrirlo y seleccione Analizar.
- Utilice las herramientas de umbral en Amplitud 1D y Amplitud 2D para distinguir entre gotas positivas y negativas para cada pocillo en el canal correcto. Las muestras NTC y de control positivo se pueden utilizar como guía para el establecimiento de umbrales.
NOTA: Los resultados de FAM se ven en el Canal 1, mientras que HEX/VIC en el canal 2. - Después de establecer el umbral, los resultados se pueden exportar como un archivo .csv y analizarse en Excel o grabarse leyendo directamente en la ventana de resultados.
- Mezcla de sondas triplex (Figura complementaria 2) y ensayos cuádruples (Figura complementaria 2)
NOTA: Antes de analizar la mezcla de sondas triplex y el ensayo cuádruple, descargue el software externo. Consulte los requisitos mínimos del sistema antes de realizar la instalación.- Abra el archivo .qlp haciendo clic derecho sobre él y eligiendo Abrir con el software externo, o abriendo el software externo y haciendo clic en la opción Examinar para localizar el archivo .qlp en su carpeta, o simplemente arrastrando el archivo .qlp y soltándolo en el software externo ya abierto.
- En la pestaña del editor de placas, seleccione los pozos que se analizarán en el lado derecho de la pestaña.
- Para la mezcla de sondas triplex, seleccione Cuantificación directa (DQ) como tipo de experimento, seleccione Probe Mix Triplex como información de ensayo e ingrese los nombres de los objetivos en consecuencia, y luego haga clic en Aplicar.
- Para cuádruplex, seleccione Cuantificación directa (DQ) como tipo de experimento, seleccione Multiplex de amplitud como información de ensayo e ingrese los nombres de los objetivos en consecuencia, y luego haga clic en Aplicar.
- En el lado izquierdo de la pestaña Amplitud 2D, utilice las Herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes clústeres de destino siguiendo las sugerencias emergentes de la ventana Seleccionar para asignar clúster .
NOTA: El modo de clúster preferido se puede aplicar según las preferencias de los usuarios. - Una vez que se asignan los colores objetivo, los datos de cuantificación se pueden leer en la ventana de datos de pozo en la parte inferior derecha. Exporte datos a Excel / csv para su posterior análisis utilizando el icono de triple barra en la parte superior derecha de la tabla de datos del pozo.
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Representative Results
En un estudio de prueba de concepto, el rendimiento analítico de los ensayos multiplex se probó en muestras clínicas y de investigación19. El rendimiento de los ensayos multiplex fue superior al de una RT-PCR19. Dado que un número bajo de gotitas puede indicar un problema durante la generación de gotas, en este artículo se estableció un límite de 10,000 gotas por pocillo basado en datos empíricos.
Una buena separación entre gotas positivas y negativas con una interferencia de lluvia mínima puede ayudar en el análisis de datos. Por lo tanto, en un buen experimento, la optimización del ensayo es clave19. Como se ve en los resultados del análisis del gradiente de temperatura en la Figura 2D, las altas temperaturas de recocido (por ejemplo, 65 °C) no pudieron distinguir claramente las gotas positivas de las negativas cuando se realizó un ensayo dúplex (N (FAM) y RPP30 (HEX)). Sin embargo, con una disminución en la temperatura de recocido, se logró una separación óptima entre gotas positivas y negativas. Se encontró una temperatura de 57 °C óptima. Esto también se puede observar en otros ensayos19.
Utilizando un sistema de detección RT-ddPCR de dos colores (FAM/HEX), es posible detectar uno (Figura 2A, B), dos (Figura 2C), tres (Figura 3A) y cuatro (Figura 3B) objetivos de SARS-CoV-2 dentro de una sola muestra. Durante el análisis de datos, el software adjunto utilizado para leer gotas solo puede analizar ensayos símplex y dúplex, como se muestra en la Figura 2. Esto significa que para ensayos multiplex de orden superior (>3 objetivos), se debe utilizar un software externo para el análisis de datos, como se muestra en las figuras 3, S2 y S3. Es importante tener en cuenta también que el software externo también se puede utilizar para analizar datos símplex y dúplex. Para los datos símplex y dúplex, el análisis es bastante simple, ya que los objetivos se separan como gotas positivas o negativas en sus respectivos canales, como se muestra en la Figura 2. Una muestra NTC puede ayudar en la localización de gotitas negativas que a su vez pueden ayudar a establecer umbrales para el análisis de datos como se muestra en la Figura 2A. Para el ensayo dúplex, el análisis se puede realizar en canales individuales (Figura 2B i,ii) o en la Amplitud 2D (Figura 2B iii).
Para los ensayos multiplex de orden superior, el análisis de datos no es sencillo, y la atención debe centrarse en la asignación de objetivos de gotas. Después de instalar el software externo, seleccione los pozos que se van a analizar, seleccione el tipo de experimento apropiado y asigne grupos de destino según el tipo de experimento, como se muestra en las figuras S2 y S3. La ventana emergente Seleccionar para asignar clúster le guiará sobre cómo asignar clústeres en los ensayos multiplexores superiores. Utilice las herramientas gráficas para asignar hasta 8 grupos de gotas para el ensayo de mezcla de sondas triplex (Figura 3A) y hasta 16 grupos de gotas para el ensayo basado en amplitud cuádruple (Figura 3B).
Después de asignar clústeres y umbrales, los datos de cuantificación para cada objetivo en forma de copias/μL se pueden leer en la ventana de datos del pozo en la parte inferior derecha del software externo. Estos datos se pueden utilizar para estimar el número de copias de objetivos en la muestra inicial. Por ejemplo, si se utilizaron 2,2 μL de la muestra en un volumen final de 22 μL, y el software registró 30,5 copias/μL para ORF1ab, hubo 30,5 x 22 = 671 copias de ORF1ab en la mezcla de PCR. La mezcla contenía 2,2 μL de muestra original, por lo tanto, había 671 copias de ORF1ab en la muestra inicial, y 671/2,2 = 305 copias/μL de ORF1ab en la muestra original. Este método se puede utilizar para estimar la concentración de cada objetivo en todos los ensayos.
| Blanco | Secuencia 5' a 3' | Colorante(s) de sondeo | Longitud del producto (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Adelante | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM y BHQ1-3' 5'- HEX y BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Marcha atrás | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sonda | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Adelante | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM y BHQ1-3' 5'- HEX y BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Marcha atrás | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sonda | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Adelante | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX y BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Marcha atrás | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sonda | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Adelante | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM y BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Marcha atrás | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sonda | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabla 1: Secuencias de cebadores y sondas utilizadas para desarrollar los diferentes ensayos de SARS-CoV-2.
| Concentración final de cebador-sonda por ensayo en nMa | |||||
| Blanco | Cebador/sonda | Símplexb | Dúplexc | Mezcla de sonda triplexd | Amplitud de Fourplexe |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a En todos los ensayos, los objetivos pueden intercambiarse según las preferencias de los usuarios. Los objetivos utilizados son para fines de demostración de este experimento. | |||||
| b Sólo se puede detectar un objetivo a la vez en el ensayo símplex en el canal FAM o HEX. RBD2 se utiliza para demostrar los resultados del canal FAM, mientras que RPP30 se utiliza para el canal HEX. | |||||
| c Se pueden detectar dos objetivos a la vez en el ensayo dúplex en los canales FAM y HEX. | |||||
| d Se pueden detectar tres objetivos utilizando ambos canales, es decir, el objetivo 1 se detectará en FAM (concentración de sonda de 1×), el objetivo dos en HEX (concentración de sonda de 1×) y el objetivo 3 en ambos canales (una mezcla de 0,5× HEX y 0,5× concentratins de sonda FAM para constituir el 1× final). | |||||
| e Se detectan dos objetivos en cada canal (FAM y HEX) con una concentración de sonda de 1× y O.5× en cada canal. | |||||
Tabla 2: Concentración final de diferentes pares de cebadores y sondas por ensayo.
Figura 1: Procesamiento de muestras y flujo de trabajo de PCR digital de gotas. (A) El flujo de trabajo de procesamiento de muestras incluye la recolección de muestras y el transporte a una instalación BSL-2, inactivación, extracción y generación de ADNc. (B) El flujo de trabajo de PCR digital de gotas comienza con la preparación de la mezcla maestra, cargando la mezcla maestra en una placa de ddPCR y agregando muestras (s), generando gotas, amplificando objetivos dentro de gotas por PCR y, finalmente, leyendo las gotas amplificadas usando un lector de gotas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados del ensayo símplex y dúplex, incluida la optimización de la temperatura de recocido. (A) Resultados del ensayo símplex cuando un solo objetivo (RBD2) fue etiquetado FAM. (B) Resultados del ensayo símplex cuando un solo objetivo (RPP30) fue marcado HEX. (C) Resultado del ensayo dúplex de dos objetivos en 1D y 2D (iii) canales después de que N (i) fue marcado FAM y RPP30 (ii) fue marcado HEX. (D) Gradiente de temperatura de recocido (65 °C a 55 °C) resultados de un ensayo dúplex marcado con ORF1ab (FAM) y RPP30 (HEX). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de la mezcla de sondas triplex y del ensayo multiplex basado en amplitud cuádruplex. (A) Resultados del ensayo de mezcla de sonda triplex cuando se etiquetaron tres objetivos con las siguientes proporciones de FAM:HEX; RBD2 (1:0), N (0.5:0.5) y RPP30 (0:1). (B) Resultados del ensayo cuádruple basado en amplitud después de que cuatro objetivos se etiquetaron con las siguientes proporciones de FAM: HEX; RBD2(0.5:0), N (1:0), RPP30 (0:0.5) y ORF1ab (0:1). 1 y 0,5 son concentraciones de sonda de 250 nM y 125 nM, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Generación de gotas utilizando un generador automatizado de gotas. (A) Consumibles necesarios para configurar el AutoDG. (B) En la pantalla táctil de AutoDG, toque Configurar placa de muestra y seleccione las columnas donde se encuentran las muestras en la placa de muestra y pulse OK. (C) Una vez seleccionado, la pantalla se vuelve amarilla indicando dónde deben cargarse los consumibles. (D) Abra la puerta AutoDG y cargue los consumibles en los lugares respectivos. Cargue consumibles desde la parte posterior trabajando hacia el frente. Asegúrese de que cada vez que se agrega un consumible, la luz cambia de amarillo a verde en esa ubicación. (E) Asegúrese de que el tipo de aceite utilizado es aceite para sondas. (F) Cierre la puerta de AutoDG y asegúrese de que todos los reactivos estén colocados en su lugar comprobando si la pantalla táctil de AutoDG es verde. (G) Presione START Droplet Generation para generar droplets. (H) Una vez completada la generación de gotas, abra el AutoDG y retire la placa de gotas. (I) Selle la placa de gotas con un sello térmico de lámina perforable. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Pasos para el análisis de los resultados del ensayo multiplex ddPCR basado en amplitud utilizando un software externo. (A) Instale el software externo en una computadora. (B) Abra el archivo .qlp haciendo clic derecho sobre él y eligiendo Abrir con el software externo instalado o abriendo el software externo y haciendo clic en la opción Examinar para localizar el archivo en su carpeta. Alternativamente, uno puede arrastrar el archivo .qlp y soltarlo el software externo abierto para abrirlo. (C) Una vez abierto, en el lado derecho de la pestaña Editor de placas , elija tríplex de mezcla de sonda en el menú desplegable y asigne información de destino en consecuencia, y haga clic en Aplicar. (D) En el lado izquierdo de la pestaña de amplitud 2D, use las Herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes objetivos para su detección y cuantificación. Una vez que se identifican los objetivos del clúster de gotas, los resultados de la cuantificación se pueden ver en la ventana Datos del pozo en la misma pestaña de amplitud 2D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Pasos en el análisis de los resultados del ensayo multiplex ddPCR basado en amplitud utilizando un software externo. (A) Instale el software externo en una computadora. (B) Abra el archivo .qlp haciendo clic derecho sobre él y seleccionando Abrir con el software externo instalado, o abriendo el software externo y haciendo clic en la opción Examinar para localizar el archivo en su carpeta. Alternativamente, se puede arrastrar el archivo .qlp y soltarlo en el software externo ya abierto para abrirlo. (C) Una vez abierto, en el lado derecho de la pestaña Editor de placas , elija multiplex de amplitud en el menú desplegable y asigne información de destino en consecuencia, y haga clic en Aplicar. (D) En el lado izquierdo de la pestaña de amplitud 2D, use las Herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes objetivos para su detección y cuantificación. Una vez que se identifican los objetivos del clúster de gotas, los resultados de la cuantificación se pueden ver en la ventana Datos del pozo en la misma pestaña de amplitud 2D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Hay pocos recursos disponibles sobre cómo desarrollar ensayos RT-ddPCR para la detección del SARS-CoV-2. Aunque no se utiliza en este artículo, las muestras estándar con copias conocidas se pueden utilizar para desarrollar y optimizar ensayos. Sin embargo, en este trabajo, las muestras de SARS-CoV-2 cultivadas en células Vero-E6 se enriquecieron en un fondo de ARN genómico humano y se utilizaron como muestras estándar para desarrollar los ensayos. Las secuencias adecuadas de cebadores y sondas son esenciales al desarrollar ensayos. Dado que la mayoría de los trabajos preliminares sobre RT-ddPCR del SARS-CoV-2 utilizaron el cebador de los CDC de China y sondas dirigidas a los genes ORF1ab y N, los habían encontrado aptos para ser incluidos en este trabajo 7,8,9,10,11. La especificidad analítica y la sensibilidad de estos cebadores también han sido comparadas mediante ddPCR en el trabajo anterior7. Los cebadores RBD2 y la sonda13 se desarrollaron internamente y se consideraron adecuados para RT-ddPCR. Dado que los ensayos se pueden utilizar para diferentes aplicaciones, incluido el diagnóstico, el gen humano específico de la subunidad p30 de la proteína ribonucleasa P (RPP30) se incluyó en todos los ensayos múltiples. Estos genes se pueden utilizar como un control endógeno humano para experimentos de diagnóstico. Sin embargo, en el caso de muestreo ambiental u otra investigación que no necesita el gen de referencia humano, se puede alternar este objetivo con otro objetivo del SARS-CoV-2.
En todos los ensayos, es importante incluir controles para validar ensayos y datos experimentales. Estos controles pueden incluir: NTC (agua libre de nucleasa como muestra) para ayudar a establecer umbrales y localizar grupos de gotas negativas; control positivo (muestra con todos los objetivos del SARS-CoV-2, incluido el gen de referencia humano) para evaluar el fallo del reactivo, la integridad del cebador y la sonda, y la detección/localización sustanciales de la transcripción inversa de los objetivos de gotitas positivas; y controles de extracción (muestras humanas agrupadas de voluntarios sanos o ácido nucleico total extraído de una célula humana cultivada no infecciosa) para detectar el fracaso o el éxito del paso de extracción.
La mayoría de los sistemas ddPCR, incluido el sistema QX200, tienen un rango dinámico estrecho de 1 a 120.000 copias/20 μL de reacción. Al detectar muestras desconocidas, la concentración objetivo en la muestra inicial a menudo se desconoce y esto puede plantear desafíos al cuantificar muestras altamente concentradas. Para superar esto, se recomienda que al cuantificar muestras sospechosas de contener altas cantidades de moléculas diana (como el cultivo celular), se debe planificar la reducción de la muestra inicial en consecuencia. En el caso de que se desconozca el número de copias/genomas objetivo, se debe determinar la cantidad inicial óptima a través de una serie de cuatro veces la dilución en serie de cada muestra en el rango digital esperado. Al ensayar estos cuatro puntos, se asegura que uno de los puntos de datos está dentro del rango digital óptimo.
El uso de cebador alto y baja concentración de sonda es un requisito de la mayoría de los experimentos de ddPCR símplex y dúplex. Esta diferencia en la concentración aumenta la distancia de separación de amplitud entre los grupos de gotas positivas y negativas, lo que facilita el análisis de los datos. Sin embargo, cuando se desarrollan ensayos multiplex de orden superior, los cambios en estas concentraciones pueden conducir a cambios en la posición de los objetivos de gotas positivas, como se muestra en las Figuras 3 y 4. Como resultado, una opción de optimización del ensayo, aparte de la temperatura de recocido, sería cambiar el cebador objetivo o la concentración de la sonda para distinguir las gotas. Este fenómeno ha sido utilizado y explicado antes14,15,16.
A pesar del rendimiento del ensayo, este trabajo es un flujo de trabajo RT-ddPCR de dos pasos. El paso adicional de transcripción inversa antes de ddPCR deja espacio para la contaminación de las muestras. Sin embargo, si se utilizan técnicas de manejo de muestras cuidadosas y adecuadas, esto no será un problema. Positivamente, se sabe que el ADN es más estable que el ARN. La conversión de ARN a ADNc puede extender la vida útil de la muestra durante el almacenamiento en comparación con el ARN. Un experimento RT-ddPCR de dos pasos también es más barato que un experimento RT-ddPCR de un solo paso.
En comparación con la RT-qPCR, la RT-ddPCR es costosa. Por lo tanto, se deben tener en cuenta al realizar RT-ddPCR. Por ejemplo, durante el diagnóstico, se puede usar RT-ddPCR en el caso de que sus muestras tengan objetivos abundantes bajos. Sin embargo, existe la posibilidad de que los costos de los instrumentos y reactivos de dPCR disminuyan pronto, y la técnica se adapte en muchos laboratorios, como sucedió en el pasado con PCR y qPCR regulares. Por lo tanto, es importante establecer protocolos como este para los usuarios actuales y futuros de dPCR. En conclusión, los ensayos desarrollados dan espacio para que los posibles usuarios varíen los objetivos en función de sus aplicaciones. La multiplexación asegurará que uno pueda detectar eficientemente muchos objetivos dentro de una sola muestra en una sola reacción. Hasta ahora, este puede ser el primer protocolo que da un detalle completo sobre cómo usar el sistema AutoDG, incluido el software externo en la detección del SARS-CoV-2. Todavía se necesita más trabajo en la optimización del ensayo para lograr una mejor separación en el ensayo cuádruplex. El uso de estándares también ayudará a mejorar los ensayos desarrollados.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Megaproyecto de Control de Enfermedades Infecciosas del Ministerio de Salud de China, número de subvención 2017ZX10302301-005 y el Centro de Investigación Conjunta Sino-África, número de subvención SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
