Summary
Dette arbejde opsummerer trin til udvikling af forskellige assays til SARS-CoV-2-detektion ved hjælp af et tofarvet ddPCR-system. Trinene er detaljerede, og der er inkluderet noter om, hvordan man forbedrer assays og eksperimentets ydeevne. Disse assays kan bruges til flere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikationer.
Abstract
Diagnose af den igangværende SARS-CoV-2-pandemi er en prioritet for alle lande over hele kloden. I øjeblikket er omvendt transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) guldstandarden for SARS-CoV-2-diagnose, da der ikke findes nogen permanent løsning. Uanset hvor effektiv denne teknik kan være, er der opstået forskning, der viser dens begrænsninger i detektion og diagnose, især når det kommer til lave rigelige mål. I modsætning hertil har dråbedigital PCR (ddPCR), en nylig ny teknologi med overlegne fordele i forhold til qPCR, vist sig at overvinde udfordringerne ved RT-qPCR ved diagnosticering af SARS-CoV-2 fra lave rigelige målprøver. Fremadrettet udvides mulighederne i RT-ddPCR i denne artikel yderligere ved at vise trin til, hvordan man udvikler simplex-, duplex-, triplex-sondemix og quadruplex-assays ved hjælp af et tofarvet detektionssystem. Ved hjælp af primere og sonder rettet mod specifikke steder i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 og RBD2) er udviklingen af disse assays vist at være mulig. Derudover leveres trin for trin detaljerede protokoller, noter og forslag til, hvordan du forbedrer analysearbejdsgangen og analyserer data. Tilpasning af denne arbejdsgang i fremtidige arbejder vil sikre, at det maksimale antal mål kan detekteres følsomt i en lille stikprøve, hvilket forbedrer omkostningerne og prøvegennemløbet betydeligt.
Introduction
Polymerasekædereaktion (PCR), en velkendt teknik, har gennemgået flere transformationer siden dens fremkomst for at blive en kraftfuld teknik, der er i stand til at give svar på nukleinsyreforskning. Disse transformationer har været en konstant forbedring af den gamle teknik. Disse transformationer kan opsummeres i tre generationer1. Den første generation er konventionel PCR, der er afhængig af gelelektroforese til at kvantificere og detektere forstærkede mål. Anden generation er kvantitativ realtids PCR (qPCR), der kan detektere prøver i realtid og stole på en standardkurve til direkte kvantificering af mål i en prøve. Den tredje generation, digital PCR (dPCR), kan udføre både detektion og absolut kvantificering af nukleinsyremål uden behov for en standardkurve. dPCR er også blevet forbedret yderligere fra reaktionskamre, der adskilles af brøndene i en væg til emulsioner af olie, vand og stabiliserende kemikalier inden for samme brønd som set i dråbebaseret digital PCR2. I dråbe digital PCR (ddPCR) opdeles en prøve i tusindvis af nanoliter-store dråber, der indeholder individuelle mål, som senere vil blive kvantificeret ved hjælp af Poisson-statistik 2,3,4. Denne teknik giver ddPCR en fordel ved kvantificering af mål med lav overflod sammenlignet med de andre generationer af PCR.
For nylig har flere applikationer fremhævet overlegenheden af ddPCR i forhold til den almindeligt anvendte qPCR ved påvisning og kvantificering af målmed lavt rigelige mål 1,5,6. SARS-CoV-2 er ingen undtagelse fra disse applikationer 7,8,9,10,11,12. Siden udbruddet af SARS-CoV-2 har forskere arbejdet på alle fronter for at komme med løsninger på, hvordan man diagnosticerer virussen og opdager den effektivt. Den nuværende guldstandard mangler stadig at være qPCR13. RT-ddPCR har imidlertid vist sig at være mere nøjagtig til at detektere lave rigelige SARS-CoV-2-mål fra både miljømæssige og kliniske prøver sammenlignet med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De fleste af de SARS-CoV-2 ddPCR-offentliggjorte værker afhænger af simpleksassays med multiplexerne afhængigt af kommercielle assays. Derfor bør der gøres mere for at forklare, hvordan man udvikler multiplex RT-dPCR-assays til SARS-CoV-2-detektion.
I et korrekt analysedesign kan multiplexing bruges til at spare på omkostningerne, øge prøvegennemstrømningen og maksimere antallet af mål, der følsomt kan detekteres inden for en lille prøve. Ved multiplexing med ddPCR skal man tage højde for, hvor mange fluoroforer der kan detekteres i et bestemt system. Nogle ddPCR-platforme kan understøtte op til tre kanaler, mens andre kun understøtter to kanaler. Derfor, når multiplexing med to kanaler, skal man bruge forskellige tilgange, herunder multiplexing af højere orden for at detektere mere end to mål14,15,16. I dette arbejde bruges et tofarvet ddPCR-detektionssystem til at vise trin til, hvordan man udvikler forskellige SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays, der kan tilpasses til forskellige forskningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk erklæring
Wuhan Institute of Virology (WHIOV) er blandt de laboratorier og institutter, der er godkendt af China CDC i Wuhan by til at forske i SARS-CoV-2 og opdage COVID-19 fra kliniske prøver. Forskning i udvikling af nye diagnostiske teknikker til COVID-19 ved hjælp af kliniske prøver er også blevet godkendt af det etiske udvalg for Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Arbejdsproces for prøvebehandling (figur 1A)
BEMÆRK: I hele protokollen er det vigtigt at bruge separate rum med dedikerede pipetter til prøvehåndtering (ekstraktion og opbevaring), forberedelse og opbevaring af reagens/mastermix, forberedelse af reaktionsblanding (prøve plus mastermix) og detektion for at undgå krydskontaminering. De assays, der skal udvikles, kan anvendes til påvisning af kliniske prøver eller forskningsprøver. Alle prøver skal behandles, som om de kan overføre infektiøse agenser, selv når der anvendes sikre laboratorieprocedurer. Prøvebehandlingstrin skal udføres i et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) efter strenge BSL-2-regler, herunder brug af passende personlige værnemidler (PPE).
- Inaktivering af eksempel
- Tag 1 ml SARS-CoV-2-prøve til et BSL-2-laboratorium. Prøverne varmeinaktiveres ved 65 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: Prøver kan komme fra forskellige kilder, derfor skal man sørge for, at volumenet, der skal inaktiveres, er tilstrækkeligt til at sikre efterfølgende RNA-ekstraktion. De fleste ekstraktionssæt kræver et lille prøvevolumen på op til 200 μL, derfor ville et prøvevolumen på ca. 1 ml være tilstrækkeligt til inaktivering. Overfladeaktive stoffer, kits og lysisbuffere kan også anvendes til direkte inaktivering og RNA-ekstraktion i henhold til laboratoriets egen SOP. - Tag prøver til et biosikkerhedsskab (BSC) og lad dem stå ved stuetemperatur i 10 minutter for at tillade potentielle aerosoler at bundfælde sig. Opbevar prøverne ved 4 °C i op til 24 timer, hvis de ikke behandles straks.
BEMÆRK: Der kræves ingen specifik beholder til prøveopbevaring. Prøverne kan opbevares i de rør eller beholdere, der anvendes under inaktiveringen. Til dette arbejde blev de fleste prøver opbevaret i virale transportmedier (VTM) rør eller 1,5 ml rør.
- Tag 1 ml SARS-CoV-2-prøve til et BSL-2-laboratorium. Prøverne varmeinaktiveres ved 65 °C i 30 minutter.
- RNA-ekstraktion
BEMÆRK: Mange RNA-ekstraktionsinstrumenter og sæt med specifikke protokoller er tilgængelige til klar brug. Her præsenteres en automatiseret procedure efter producentens anvisninger.- Tag den fyldte 96-dybe brøndåbningsplade ud; Vend det forsigtigt på hovedet for at blande de magnetiske perler. Efter blanding rystes pladen forsigtigt på en plan overflade for at koncentrere reagens og magnetiske perler, der kan være på væggen til pladens bund.
- Riv forsigtigt aluminiumsfolieforseglingsfilmen af for at undgå vibrationer i pladen og væskespild. Der tilsættes 20 μL proteinase K og 200 μL af prøven pr. hul i række 2 og 8 i 96-brøndpladen. Placer derefter 96-brøndpladen på bunden af det 32-kanals automatiske nukleinsyreekstraktionsinstrument.
BEMÆRK: Kør programmet på computeren inden for 1 time efter tilføjelse af prøven. - Indsæt magnetstanghylsteret i kortstikket på det 32-kanals automatiske nukleinsyreekstraktionsinstrument. Vælg programmet GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (hurtig version) og kør det.
- Efter endt ekstraktion udtages nukleinsyreprøverne i række 6 og 12 (ca. 100 μL/prøve) og fordeles i en ren nukleasefri plade med 96 huller. Prøverne opbevares ved 4 °C i op til 24 timer indtil brug eller ved -20 °C i længere tid.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge en 100 μL multikanalpipette til at overføre prøver til en ny 100-200 μL plade, da den direkte kan matche kolonnerne på prøvepladen.
- cDNA-generering
BEMÆRK: For prøver, der opbevares i lang tid, skal du undgå flere fryse-/optøningscyklusser. Udfør cDNA-generering ved hjælp af et cDNA-sæt ved at følge producentens anvisninger.- I et 100 eller 200 μL PCR-rør anbragt på is/køleblok tilsættes 2 μL 5x RT-masterblanding (f.eks. Perfect Real Time), 5 μL prøve-RNA og 3 μL RNase-fri ddH2O pr. reaktion (totalvolumen 10 μL).
- PCR-røret anbringes i en termisk cykler, der er indstillet til at køre ved 37 °C i 15 minutter (reverse-transkription), 85 °C i 5 s (varmeinaktivering af revers transkriptase) og 4 °C i uendelig tid.
BEMÆRK: Behandl prøverne straks, eller opbevar dem ved 4 °C i op til 24 timer indtil brug eller ved -20 °C i op til 6 måneder.
2. Optimering af ddPCR-analyse og workflow
BEMÆRK: Optimer analyserne før/efter aflæsning af dråberne. Afhængigt af resultaterne kan de optimeres på ethvert tidspunkt i arbejdet for at opnå bedre resultater. Nedenfor er nogle almindelige faktorer, der skal overvejes, når du optimerer ddPCR-eksperimenter.
- Valider ddPCR-primere og sonder (tabel 1).
BEMÆRK: Primerne ORF1ab og N blev tilpasset fra Kina CDC17, det humane endogene kontrolgen (RPP30) fra Lu et al.18 og RBD2 fra Nyaruaba et al.13. Alle primere og sonder undtagen RBD2 var allerede blevet ddPCR-testet og optimeret 7,8,18. - Kør ddPCR-testprøvekontrollerne, der omfatter en positiv kontrol (en prøve med alle fire mål), Ingen skabelonkontrol (NTC; Nukleasefrit vand eller prøve uden mål) og ekstraktion/negativ kontrol (total nukleinsyre ekstraheret fra en ikke-infektiøs dyrket human celle eller poolede prøver fra sundhedsfrivillige).
BEMÆRK: Standard kontrolprøver med kendte kopier af målgener foretrækkes. Hvis der ikke findes standarder, skal du dog bruge de tilgængelige prøver til at definere deres kontroller eller prøvematrix. Kør kontrolelementerne sammen med testprøver. - Optimer udglødningstemperaturen (figur 2D) ved at indsætte en temperaturgradient på 55 °C til 65 °C i udglødningstrinnet i PCR (trin 3.2).
BEMÆRK: Udglødningstemperaturoptimering hjælper med at finde den bedste temperatur, hvor dråbeadskillelse er maksimal (let målidentifikation) med minimal regn. Når du har opnået resultaterne, skal du indsnævre temperaturområdet for bedre optimering, f.eks. 55 °C til 60 °C. - Optimer primer- og sondekoncentrationerne. Hvis der ikke opnås optimal adskillelse mellem positive og negative dråber i analyserne, varierer primerkoncentrationerne (300-900 nM) og/eller sondekoncentrationerne (100-400 nM).
BEMÆRK: Sænkning af primer / sondekoncentrationer resulterer i en lavere måldråbeamplitude, og forøgelse af den øger også målets amplitude. Dette kan være nyttigt i amplitudebaseret multiplexing. - Test den analytiske følsomhed under hensyntagen til forskellige parametre, herunder blindprøve (LoB), detektionsgrænse (LoD), specificitet og følsomhed ved hjælp af både standardprøver og testprøver, som foretrukket.
3. ddPCR-arbejdsgang (figur 1B) og analyseudvikling (tabel 2)
BEMÆRK: Ligesom andre ddPCR-detektionssystemer består denne arbejdsgang også af fire trin (figur 1B), herunder forberedelse af reaktionsmix, dråbegenerering, PCR-amplifikation og dråbelæsning.
- Forberedelse af reaktionsblanding
BEMÆRK: Forbered alle analyser i et rent separat rum og inde i en BSC. Overhold standardforholdsregler, herunder brug af rene handsker, rene pipetter, nukleasefrit vand og desinfektionsmidler. Alikvote reagenser i separate glas og opbevares ved -20o C forat undgå gentagne fryseoptøningscyklusser. Der udarbejdes analyser som vist i tabel 2. Primer- og sondestamopløsninger skal opbevares i høje koncentrationer på 100 μM. Arbejdsløsningerne kan opbevares i alikvoter på 20-40 μM (fortyndet i nukleasefrit vand).- Almindelige trin i alle assays
BEMÆRK: Før du forbereder analyserne, skal du beregne den samlede mængde mastermix, der er nødvendig, baseret på antallet af prøver. Her blev hver mastermix-komponentvolumen ganget med 1,05 for at tage højde for eventuelle pipetteringsfejl.- Optø og ekvilibrer reaktionsmaterialer til stuetemperatur. Vortex reaktionskomponenterne kort (30 s) for at sikre homogenitet, og centrifuger kortvarigt for at opsamle indholdet i bunden af røret.
- Der fremstilles en primer-sondeblanding (PP) pr. assay ved at blande specifikke reaktionsvolumener som beskrevet i tabel 2 fra arbejdsopløsningerne.
- Masterblandingen fremstilles ved at blande 11 μL (1x) 2x ddPCR-superblanding til sonder (No dUTP), PP-blanding (afhængig af analyse som vist i tabel 2 fra arbejdsløsningen) og nukleasefrit vand til et slutvolumen på 19,8 μL pr. hul. Masterblandingen fordeles i brøndene på en nukleasefri 96-brønds ddPCR-plade baseret på antallet af prøver.
BEMÆRK: For prøvepladen skal du sørge for, at alle 8 huller i en kolonne har opløsningen. Hvis der kun anvendes nogle få huller, f.eks. 5 prøver, fyldes de øvrige 3 brønde med 22 μL nukleasefrit vand eller kontrolbuffer hver. - For at få det endelige reaktionsblandingsvolumen (22 μL) tilsættes 2,2 μL cDNA-prøve pr. brønd indeholdende mastermix. Forsegl pladen med en engangs PCR-pladeforsegler.
BEMÆRK: Udfør prøvetilføjelserne i det udpegede rum. Inkluder kontrollerne, dvs. positiv, NTC og ekstraktion. Derudover, hvis RNA-prøverne har lav koncentration, skal du reducere vandmængden i masterblandingen og øge prøvevolumenet tilsvarende op til 5,5 uL. - Når reaktionsblandingen er fordelt pr. brønd, hvirvel kort (15-30 s) og centrifuger (10-15 s) for at opsamle indholdet i bunden af pladen. Fortsæt til dråbegenerering.
- Almindelige trin i alle assays
- Automatisk dråbegenerering (supplerende figur 1)
BEMÆRK: Forskellige dråbegeneratorer kan bruges; Denne undersøgelse blev imidlertid udført med en automatiseret dråbegenerator (AutoDG). For at undgå amplicon kontaminering skal du sikre dig, at dråbegeneratoren og læserne har dedikeret plads i separate områder. Ved ilægning af forbrugsstoffer anbefales det at starte ilægningen fra bagsiden af instrumentet, der arbejder mod fronten for at undgå at bevæge hænderne over forbrugsstofferne for at undgå krydskontaminering.- Få fat i alle forbrugsstoffer, der er nødvendige for at konfigurere AutoDG, herunder AutoDG-olie til sonder, DG32-patroner, pipettespidser, køleblok, prøveplade, dråbeplade (ny ren ddPCR-plade) og en affaldsspand.
- På AutoDG-berøringsskærmen skal du trykke på Konfigurer prøveplade og vælge kolonner, hvor prøverne er placeret på prøvepladen, og trykke på OK.
BEMÆRK: Skærmen bliver gul, hvilket indikerer LOAD, hvor forbrugsstoffer skal indlæses. - Åbn AutoDG-døren, og læg forbrugsstoffer på deres respektive steder.
BEMÆRK: De respektive steder, hvor forbrugsstoffer skal læsses, vil have en gul indikator, der senere bliver grøn, hvis forbrugsstofferne er indlæst. Dette svarer til berøringsskærmen. - Ilæg prøvepladen og dråbegenereringspladen.
BEMÆRK: Dråbegenereringspladen skal placeres på køleblokken. Sørg for, at køleblokken er lilla (klar til brug) og ikke lyserød (skal opbevares i en fryser, indtil farven vender tilbage til lilla). - Luk AutoDG-døren, sørg for, at skærmen er grøn (forbrugsstoffer indlæst), og vælg/sørg for, at olietypen er olie til sonder , før du trykker på Start dråbegenerering.
- Vent på, at dråberne genereres. Åbn lågen, når skærmen viser Dråber klar , og fjern pladen med dråberne.
- Pladen forsegles med en gennemborbar folieforsegling ved hjælp af en pladeforsegler, der er indstillet til at køre ved 185 oC i 5 s. Fortsæt til PCR-forstærkning.
BEMÆRK: PCR-forstærkning skal startes inden for 30 minutter efter dråbegenerering.
- PCR-forstærkning
- Indsæt den forseglede dråbeplade i en 96-dyb brøndtermisk cyklist, indstil prøvevolumenet til 40 μL og lågtemperaturen til 105 °C.
- PCR forstærker dråberne ved hjælp af programmet: 95 °C i 10 min (enzymaktivering), 40 cyklusser med denaturering ved 94 °C i 30 s og 1 min udglødning/forlængelse ved 57 °C, enzymdeaktivering ved 98 °C i 10 minutter og fastholdelsestrin ved 4 °C på ubestemt tid. Efter PCR aflæses dråberne, eller de opbevares ved 4 °C i op til 24 timer.
BEMÆRK: Brug en rampehastighed på 2 °C /s i alle trin, da rampehastighederne kan variere for forskellige termiske cyklister. Hold pladen i mindst 30 minutter ved 4 °C for at stabilisere dråben, før dråberne aflæses.
- Dråbe læsning
- Overfør den termiske cyklede 96-brøndsplade til en dråbelæser, og på en computer, der er tilsluttet dråbelæseren, skal du åbne/starte den medfølgende software.
- Vælg Ny i opsætningstilstand, og dobbeltklik derefter på en brønd for at åbne dialogboksen Well Editor . Vælg de brønde, der skal læses, og vælg Eksperiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix til sonder (ingen dUTP), Mål 1 Type: Ch1 Ukendt, Mål 2 Type: Ch2 Ukendt.
BEMÆRK: Negativ, tom, NTC eller positiv kan vælges fra rullemenuen med måltype 1/2 for kontroleksemplerne. - Tildel mål- eller eksempelnavne baseret på pladelayout, og vælg Anvend. Når du er færdig, skal du vælge OK og gemme den oprettede skabelon. Klik på Kør , og vælg den rigtige farve (FAM/HEX), når du bliver bedt om det.
BEMÆRK: Det anbefales at klargøre systemet før kørsel før dagens første kørsel. Kontroller også, om alle lys i læseren er grønne, og hvis ikke, skal du følge det anbefalede program på værktøjstippets status. - Når dataindsamlingen er afsluttet, skal du fjerne pladen fra læseren. Analysér data efter behov.
BEMÆRK: Da foreløbige resultater kan ses på skærmen, kan kørsel af de positive prøver i de første brønde bruges til kvalitetskontrol i realtid.
4. Dataanalyse (supplerende figur 2 og 3)
- Kontroller dataene fra alle brøndene for det samlede antal dråber. Hvis dråbetallet er <10.000, skal du kassere resultaterne og gentage analysen. Indstil et snit for at acceptere positive og negative resultater. F.eks. kan et dråbetal på op til 3 eller flere positive dråber betragtes som afskæringen for positive resultater.
BEMÆRK: Data for alle assays, herunder simplex, duplex, triplex probe mix og quadruplex assays genereres ved hjælp af den medfølgende software. Denne software er dog kun egnet til simpleks- og duplex-assays. Til multiplexanalyser med høj ordre (>3 mål) er der brug for en ekstern software. - Simplex og duplex assays
BEMÆRK: Den eksterne software kan også analysere simpleks- og duplexdata. Brug af den ledsagende software er dog lettere for disse analyser, og bruges derfor i denne artikel.- Dobbeltklik på .qlp-filen, der skal analyseres for at åbne den, og vælg Analyser.
- Brug tærskelværktøjerne i 1D-amplitude og 2D-amplitude til at skelne mellem positive og negative dråber for hver brønd i den korrekte kanal. NTC og positive kontrolprøver kan bruges som vejledning til fastsættelse af tærskelværdier.
BEMÆRK: FAM-resultater ses i kanal 1, mens HEX/VIC i kanal 2. - Efter tærskelindstilling kan resultaterne eksporteres som en .csv fil og analyseres yderligere i Excel eller registreres ved at læse direkte i resultatvinduet.
- Triplex-sondeblanding (supplerende figur 2) og quadruplex-assays (supplerende figur 2)
BEMÆRK: Før du analyserer triplex-sondeblandingen og quadruplex-assayet, skal du downloade den eksterne software. Se de minimale systemkrav før installation.- Åbn .qlp-filen ved at højreklikke på den og vælge Åbn med den eksterne software eller ved at åbne den eksterne software og klikke på indstillingen Gennemse for at finde .qlp-filen i din mappe eller ved blot at trække .qlp-filen og slippe den på den allerede åbne eksterne software.
- På fanen pladeeditor skal du vælge de brønde, der skal analyseres i højre side af fanen.
- For triplex probe mix skal du vælge Direct Quantification (DQ) som eksperimenttype, vælge Probe Mix Triplex som analyseoplysninger og indtaste målnavne i overensstemmelse hermed og derefter klikke på Anvend.
- For quadruplex skal du vælge Direkte kvantificering (DQ) som eksperimenttype, vælge Amplitude Multiplex som analyseoplysninger og indtaste målnavne i overensstemmelse hermed og derefter klikke på Anvend.
- I venstre side af fanen 2D-amplitude skal du bruge grafværktøjerne til at tildele bestemte farver til forskellige målklynger efter pop op-forslagene i vinduet Vælg for at tildele klynge .
BEMÆRK: Foretrukken klyngetilstand kan anvendes baseret på brugernes præferencer. - Når målfarverne er tildelt, kan kvantificeringsdata læses i vinduet Brønddata nederst til højre. Eksporter data til Excel / csv til yderligere analyse ved hjælp af ikonet med tre bjælker øverst til højre i brønddatatabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en proof-of-concept-undersøgelse blev multiplexassays analytiske ydeevne testet på kliniske prøver og forskningsprøver19. Udførelsen af multiplexanalyserne var bedre end en RT-PCR19. Da et lavt antal dråber kan indikere et problem under dråbegenerering, blev der i denne artikel fastsat en afskæring på 10.000 dråber pr. Brønd baseret på empiriske data.
En god adskillelse mellem positive og negative dråber med minimal regninterferens kan hjælpe med dataanalyse. Derfor er analyseoptimering i et godt eksperiment nøglen19. Som det fremgår af resultaterne af temperaturgradientanalysen i figur 2D, kunne høje udglødningstemperaturer (f.eks. 65 °C) ikke klart skelne positive dråber fra negative dråber, når der blev kørt et duplex-assay (N (FAM) og RPP30 (HEX)). Med et fald i udglødningstemperaturen blev der imidlertid opnået optimal adskillelse mellem positive og negative dråber. En temperatur på 57 °C blev fundet optimal. Dette kan også observeres i andre assays19.
Ved hjælp af et tofarvet (FAM/HEX) RT-ddPCR-detektionssystem er det muligt at detektere et (figur 2A, B), to (figur 2C), tre (figur 3A) og fire (figur 3B) SARS-CoV-2-mål inden for en enkelt prøve. Under dataanalyse kan den medfølgende software, der bruges til at læse dråber, kun analysere simpleks- og duplex-assays som vist i figur 2. Dette betyder, at der til multiplexanalyser af højere orden (>3 mål) skal bruges en ekstern software til dataanalyse som vist i figur 3, S2 og S3. Det er vigtigt også at bemærke, at den eksterne software også kan bruges til at analysere simpleks- og duplexdata. For simpleks- og duplexdata er analysen ganske enkel, da målene adskilles som enten positive eller negative dråber i deres respektive kanaler som vist i figur 2. En NTC-prøve kan hjælpe med placeringen af negative dråber, der igen kan hjælpe en med at indstille tærskler for dataanalyse som vist i figur 2A. For duplex-analysen kan analysen udføres i individuelle kanaler (figur 2B i, ii) eller i 2D-amplituden (figur 2B iii).
For multiplexanalyser med højere orden er dataanalyse ikke ligetil, og opmærksomheden bør fokuseres på dråbemåltildeling. Når du har installeret den eksterne software, skal du vælge brønde, der skal analyseres, vælge den relevante eksperimenttype og tildele målklynger baseret på eksperimenttype som vist i figur S2 og S3. Vinduet Vælg for at tildele klynge vil guide en til, hvordan du tildeler klynger i de højere multiplexassays. Brug grafværktøjerne til at tildele op til 8 dråbeklynger til triplex probe mix assay (figur 3A) og op til 16 dråbeklynger til quadruplex amplitudebaseret assay (figur 3B).
Efter tildeling af klynger og tærskler kan kvantificeringsdata for hvert mål i form af kopier/μL læses i brønddatavinduet nederst til højre i den eksterne software. Disse data kan bruges til at estimere antallet af kopier af mål i startstikprøven. F.eks. hvis 2,2 μL af prøven blev brugt i et slutvolumen på 22 μL, og softwaren registrerede 30,5 kopier/μL for ORF1ab, var der 30,5 x 22 = 671 kopier af ORF1ab i PCR-blandingen. Blandingen indeholdt 2,2 μL af den oprindelige prøve, og der var således 671 kopier af ORF1ab i startprøven og 671/2,2 = 305 kopier/μL af ORF1ab i den oprindelige prøve. Denne metode kan bruges til at estimere koncentrationen af hvert mål i alle analyser.
| Mål | Sekvens 5' til 3' | Sondefarve(r) | Produktlængde (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Fremad | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM og BHQ1-3' 5'- HEX og BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Omvendt | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sonde | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Fremad | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM og BHQ1-3' 5'- HEX og BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Omvendt | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sonde | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Fremad | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX og BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Omvendt | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sonde | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Fremad | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM og BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Omvendt | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sonde | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabel 1: Primer- og sondesekvenser, der bruges til at udvikle de forskellige SARS-CoV-2-assays.
| Endelig koncentration af primersonde pr. assay i nMa | |||||
| Mål | Primer/sonde | Simplexb | Dupleksc | Triplex sonde mixd | Fourplex amplitudee |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a I alle analyser kan målene udskiftes baseret på brugerens præference. De anvendte mål er til demonstrationsformål for dette eksperiment. | |||||
| b Kun ét mål kan detekteres ad gangen i simpleksanalysen i enten FAM- eller HEX-kanalen. RBD2 bruges til at demonstrere FAM-kanalresultater, mens RPP30 bruges til HEX-kanalen. | |||||
| c To mål kan detekteres ad gangen i duplex-analysen i FAM- og HEX-kanalen. | |||||
| d Tre mål kan detekteres ved hjælp af begge kanaler, dvs. mål 1 detekteres i FAM (1× sondekoncentration), mål to i HEX (1× sondekoncentration) og mål 3 i begge kanaler (en blanding af 0,5× HEX og 0,5× FAM-sondekoncentriner udgør den endelige 1×). | |||||
| e To mål detekteres i hver kanal (FAM og HEX) med 1× og O,5× sondekoncentration i hver kanal. | |||||
Tabel 2: Endelig koncentration af forskellige primer- og sondepar pr. assay.
Figur 1: Prøvebehandling og dråbe digital PCR-arbejdsgang. (A) Arbejdsprocessen for prøvebehandling omfatter indsamling og transport af prøver til et BSL-2-anlæg, inaktivering, ekstraktion og cDNA-generering. (B) Den dråbe digitale PCR-arbejdsgang begynder med forberedelse af mastermixet, indlæsning af mastermixet i en ddPCR-plade og tilsætning af prøve (er), generering af dråber, forstærkning af mål inde i dråber ved PCR og endelig læsning af de forstærkede dråber ved hjælp af en dråbelæser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Simpleks- og duplex-analyseresultater, herunder udglødningstemperaturoptimering. (A) Simpleks-analyseresultater, når et enkelt mål (RBD2) blev FAM-mærket. (B) Simplex assay resultater, når et enkelt mål (RPP30) blev HEX mærket. (C) Duplex-analyseresultat af to mål i 1D og 2D (iii) Kanaler efter N (i) blev FAM-mærket og RPP30 (ii) blev HEX-mærket. D) Udglødningstemperaturgradient (65 °C til 55 °C) resultater af et duplex-assay mærket med ORF1ab (FAM) og RPP30 (HEX). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Triplex-sondeblanding og quadruplex-amplitudebaserede multiplexanalyseresultater. (A) Triplex probe mix assay resultater, når tre mål blev mærket med følgende forhold af FAM:HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) og RPP30 (0:1). (B) Quadruplex amplitudebaserede analyseresultater efter fire mål blev mærket med følgende forhold mellem FAM:HEX; RBD2(0,5:0), N (1:0), RPP30 (0:0,5) og ORF1ab (0:1). 1 og 0,5 er sondekoncentrationer på henholdsvis 250 nM og 125 nM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Dråbegenerering ved hjælp af en automatiseret dråbegenerator. (A) Forbrugsvarer, der er nødvendige for at oprette AutoDG. (B) På AutoDG-berøringsskærmen skal du trykke på Konfigurer prøveplade og vælge kolonner, hvor prøverne er placeret på prøvepladen, og trykke på OK. (C) Når den er valgt, bliver skærmen gul, der angiver, hvor forbrugsstoffer skal indlæses. (D) Åbn AutoDG-døren, og læs forbrugsstoffer på de respektive steder. Læg forbrugsstoffer bagfra, der arbejder mod fronten. Sørg for, at hver gang der tilsættes et forbrugsstof, skifter lyset fra gult til grønt på det pågældende sted. E) Sørg for, at den anvendte olietype er olie til sonder. (F) Luk AutoDG-døren, og sørg for, at alle reagenser er indstillet ved at kontrollere, om AutoDG-berøringsskærmen er grøn. (G) Tryk på START Dråbegenerering for at generere dråber. (H) Når dråbedannelsen er fuldført, skal du åbne AutoDG og fjerne dråbepladen. (I) Forsegl dråbepladen ved hjælp af en gennemborbar folievarmeforsegling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Trin til analyse af amplitudebaserede multiplex ddPCR-analyseresultater ved hjælp af en ekstern software. (A) Installer den eksterne software på en computer. (B) Åbn .qlp-filen ved enten at højreklikke på den og vælge Åbn med den installerede eksterne software eller åbne den eksterne software og klikke på indstillingen Gennemse for at finde filen i din mappe. Alternativt kan man trække .qlp-filen og slippe den åbne eksterne software for at åbne den. (C) Når den er åben, skal du i højre side af fanen Pladeeditor vælge sondemix triplex fra rullemenuen og tildele måloplysninger i overensstemmelse hermed og klikke på Anvend. (D) På venstre side af fanen 2D-amplitude skal du bruge grafværktøjerne til at tildele specifikke farver til forskellige mål til detektion og kvantificering. Når dråbeklyngemål er identificeret, kan kvantificeringsresultaterne ses i vinduet Brønddata på den samme fane 2D-amplitude. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Trin til analyse af amplitudebaserede multiplex ddPCR-analyseresultater ved hjælp af ekstern software. (A) Installer den eksterne software på en computer. (B) Åbn .qlp-filen ved enten at højreklikke på den og vælge Åbn med den installerede eksterne software eller åbne den eksterne software og klikke på indstillingen Gennemse for at finde filen i din mappe. Alternativt kan man trække .qlp-filen og slippe den i den allerede åbne eksterne software for at åbne den. (C) Når den er åben, skal du på højre side af fanen Pladeeditor vælge amplitudemultiplex fra rullemenuen og tildele måloplysninger i overensstemmelse hermed og klikke på Anvend. (D) På venstre side af fanen 2D-amplitude skal du bruge grafværktøjerne til at tildele specifikke farver til forskellige mål til detektion og kvantificering. Når dråbeklyngemål er identificeret, kan kvantificeringsresultaterne ses i vinduet Brønddata på den samme fane 2D-amplitude. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er få ressourcer til rådighed om, hvordan man udvikler RT-ddPCR-assays til SARS-CoV-2-detektion. Selvom de ikke bruges i denne artikel, kan standardprøver med kendte kopier bruges til at udvikle og optimere assays. I dette arbejde blev SARS-CoV-2-prøver dyrket i Vero-E6-celler imidlertid spiket i en baggrund af humant genomisk RNA og brugt som standardprøver til at udvikle analyserne. Korrekte primer- og sondesekvenser er afgørende, når der udvikles assays. Da det meste indledende arbejde med SARS-CoV-2 RT-ddPCR brugte China CDC-primeren og sonder rettet mod ORF1ab- og N-genet, havde de fundet dem egnede til at blive inkluderet i dette arbejde 7,8,9,10,11. Den analytiske specificitet og følsomhed af disse primere er også blevet sammenlignet ved hjælp af ddPCR i det tidligere arbejde7. RBD2-primerne og sonden13 blev udviklet internt og fundet egnede til RT-ddPCR. Da analyserne kan anvendes til forskellige anvendelser, herunder diagnose, blev ribonuklease P-proteinunderenheden p30 (RPP30) specifikt humant gen inkluderet i alle multiplexassays. Disse gen kan bruges som en human endogen kontrol til diagnostiske forsøg. I tilfælde af miljøprøvetagning eller anden forskning, der ikke har brug for det humane referencegen, kan man imidlertid skifte dette mål med et andet SARS-CoV-2-mål.
I alle analyser er det vigtigt at inkludere kontroller til validering af assays og eksperimentelle data. Disse kontroller kan omfatte: NTC (nukleasefrit vand som prøve) for at hjælpe med at fastsætte tærskler og lokalisere negativ dråbeklynge; positiv kontrol (prøve med alle SARS-CoV-2-mål, herunder humant referencegen) for at vurdere reagenssvigt, primer- og sondeintegritet og væsentlig revers transkriptionsdetektion/placering af positive dråbemål og ekstraktionskontrol (samlede humane prøver fra raske frivillige eller total nukleinsyre ekstraheret fra en ikke-infektiøs dyrket menneskelig celle) for at detektere ekstraktionstrinfejl eller succes.
De fleste ddPCR-systemer, herunder QX200-systemet, har et smalt dynamisk område fra 1 til 120.000 kopier/20 μL reaktion. Ved påvisning af ukendte prøver er målkoncentrationen i udgangsprøven ofte ukendt, og det kan give udfordringer ved kvantificering af stærkt koncentrerede prøver. For at overvinde dette anbefales det, at man ved kvantificering af prøver, der mistænkes for at indeholde store mængder målmolekyler (såsom cellekultur), planlægger at reducere startprøven tilsvarende. I tilfælde, hvor målkopinummeret/genomet er ukendt, bør man bestemme den optimale udgangsmængde gennem en serie på fire gange tidobbelt seriel fortynding af hver prøve ved det forventede digitale område. Ved at analysere disse fire punkter sikres det, at et af datapunkterne er inden for det optimale digitale område.
Brug af høj primer og lav sondekoncentration er en forudsætning for de fleste simpleks- og duplex ddPCR-eksperimenter. Denne forskel i koncentration øger amplitudeseparationsafstanden mellem de positive og negative dråbeklynger, hvilket gør det nemt at analysere data. Ved udvikling af multiplexanalyser af højere orden kan ændringer i disse koncentrationer imidlertid føre til ændringer i placeringen af positive dråbemål som vist i figur 3 og 4. Som et resultat ville en analyseoptimeringsmulighed bortset fra udglødningstemperatur være at ændre målprimer eller sondekoncentration for at skelne dråber. Dette fænomen er blevet brugt og forklaret før14,15,16.
På trods af analyseydelsen er dette arbejde en to-trins RT-ddPCR-arbejdsgang. Det ekstra omvendte transkriptionstrin før ddPCR giver plads til kontaminering af prøver. Men hvis der anvendes omhyggelige og korrekte prøvehåndteringsteknikker, vil dette være et ikke-problem. Positivt er DNA kendt for at være mere stabilt end RNA. Omdannelsen af RNA til cDNA kan forlænge prøvens holdbarhed under opbevaring sammenlignet med RNA. Et to-trins RT-ddPCR-eksperiment er også billigere end et et-trins RT-ddPCR-eksperiment.
Sammenlignet med RT-qPCR er RT-ddPCR dyrt. Derfor bør der tages hensyn til udførelsen af RT-ddPCR. For eksempel kan man under diagnosen bruge RT-ddPCR i tilfælde, hvor deres prøver har lave rigelige mål. Der er dog en mulighed for, at omkostningerne til dPCR-instrumenter og reagenser snart falder, og teknikken vil blive tilpasset i mange laboratorier, som det tidligere skete med almindelig PCR og qPCR. Derfor er det vigtigt at indstille protokoller som denne for nuværende og fremtidige brugere af dPCR. Afslutningsvis giver de udviklede assays plads til, at potentielle brugere kan variere mål baseret på deres applikationer. Multiplexing vil sikre, at man effektivt kan detektere mange mål inden for en enkelt prøve i en enkelt reaktion. Indtil videre kan dette være den første protokol, der giver en fuldstændig detalje om, hvordan man bruger AutoDG-systemet, inklusive den eksterne software til SARS-CoV-2-detektion. Der skal stadig arbejdes mere med analyseoptimering for at opnå bedre adskillelse i quadruplex-assayet. Anvendelsen af standarder vil også bidrage til at forbedre de udviklede analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Megaproject of Infectious Disease Control fra Kinas sundhedsministerium, bevillingsnummer 2017ZX10302301-005 og Sino-Africa Joint Research Center, bevillingsnummer SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
