Summary
这项工作总结了使用双色ddPCR系统开发SARS-CoV-2检测的不同检测方法的步骤。这些步骤很详细，并且已经包括有关如何改进测定和实验性能的说明。这些检测可用于多种SARS-CoV-2 RT-ddPCR应用。
Abstract
诊断正在进行的SARS-CoV-2大流行是全球所有国家的优先事项。目前，逆转录定量PCR（RT-qPCR）是SARS-CoV-2诊断的金标准，因为没有永久的解决方案可用。无论这种技术多么有效，研究表明其在检测和诊断方面的局限性，特别是在涉及低丰度靶标时。相比之下，微滴数字PCR（ddPCR）是一种与qPCR相比具有优越优势的最新新兴技术，已被证明可以克服RT-qPCR在诊断低丰度目标样本SARS-CoV-2方面的挑战。展望未来，在本文中，RT-ddPCR的功能通过展示如何使用双色检测系统开发单工、双链、三链探针混合物和四链体测定的步骤来进一步扩展。使用靶向SARS-CoV-2基因组特定位点（N、ORF1ab、RPP30和RBD2）的引物和探针，这些测定的开发被证明是可能的。此外，还提供了有关如何改进检测工作流程和分析数据的分步详细方案、注释和建议。在未来的工作中调整该工作流程将确保在小样品中灵敏地检测到最大数量的靶标，从而显著降低成本和样品通量。
Introduction
聚合酶链反应（PCR）是一种公认的技术，自问世以来经历了几次转变，成为一种能够为核酸研究提供答案的强大技术。这些转变是对旧技术的不断改进。这些转变可以概括为三代1。第一代是传统的PCR，依靠凝胶电泳来定量和检测扩增的靶标。第二代是实时定量PCR（qPCR），可以实时检测样品，并依靠标准曲线直接量化样品中的靶标。第三代数字PCR（dPCR）可以同时进行核酸靶标的检测和绝对定量，而无需标准曲线。dPCR也得到了进一步改进，从反应室被壁孔分离成油，水和稳定化学品的乳液，在同一孔内看到的，如基于液滴的数字PCR2所示。在液滴数字PCR（ddPCR）中，样品被分成数千个纳升大小的液滴，其中包含单个靶标，稍后将使用泊松统计量2，3，4进行定量。与其他几代PCR相比，该技术使ddPCR在定量低丰度靶标方面具有优势。
最近，多项应用强调了ddPCR在检测和定量低丰度靶标1，5，6时优于常用的qPCR。SARS-CoV-2也不例外7，8，9，10，11，12。自SARS-CoV-2爆发以来，科学家们一直在各个方面开展工作，以提出如何诊断病毒并有效检测病毒的解决方案。目前的黄金标准仍然是qPCR13。然而，与RT-qPCR 7、8、9、10、11、12 相比，RT-ddPCR 在检测环境和临床样本中的低丰度 SARS-CoV-2 靶标方面被证明更准确。大多数SARS-CoV-2 ddPCR发表的工作都依赖于单纯形检测，多重检测则取决于商业检测。因此，应该做更多的工作来解释如何开发用于SARS-CoV-2检测的多重RT-dPCR检测。
在适当的检测设计中，多重检测可用于节省成本，提高样品通量，并最大限度地增加小样品中可灵敏检测的靶标数量。使用ddPCR进行多重检测时，必须考虑在特定系统中可以检测到多少荧光团。一些 ddPCR 平台最多可以支持三个通道，而其他平台仅支持两个通道。因此，当使用两个通道进行多路复用时，必须使用不同的方法，包括高阶多路复用来检测两个以上的目标14，15，16。在这项工作中，使用双色ddPCR检测系统来展示如何开发不同的SARS-CoV-2 RT-ddPCR检测的步骤，这些检测方法可以适应不同的研究应用。
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Protocol
道德声明
武汉病毒研究所（WHIOV）是武汉市中国疾病预防控制中心批准的实验室和研究所之一，可以进行SARS-CoV-2研究并从临床样本中检测COVID-19。利用临床样本开发COVID-19新诊断技术的研究也已获得武汉病毒研究所伦理委员会（2020FCA001）的批准。
1. 样品处理工作流程（图1A）
注意：在整个方案中，重要的是使用带有专用移液器的单独房间进行样品处理（提取和储存）、试剂/预混液制备和储存、反应混合物制备（样品加预混液）和检测，以避免交叉污染。待开发的检测方法可用于检测临床样品或研究样品。即使使用安全的实验室程序，所有样本也应被视为可以传播传染性病原体。样品处理步骤应在生物安全2级（BSL-2）实验室按照严格的BSL-2规则进行，包括穿戴适当的个人防护设备（PPE）。
- 样品灭活
- 取 1 mL SARS-CoV-2 样本至 BSL-2 实验室。在65°C下热灭活样品30分钟。
注意：样品可能来自各种来源，因此，应确保要灭活的体积足以确保随后的RNA提取。大多数提取试剂盒需要高达 200 μL 的小样品体积，因此，约 1 mL 的样品体积足以灭活。表面活性剂、试剂盒和裂解缓冲液也可用于根据实验室自己的SOP直接灭活和RNA提取。 - 将样品带到生物安全柜（BSC）中，让它们在室温下静置10分钟，以使潜在的气溶胶沉淀。如果不立即处理，则将样品在4°C中储存长达24小时。
注意：样品储存不需要特定的容器。样品可以储存在灭活期间使用的管或容器中。对于这项工作，大多数样品储存在病毒运输培养基（VTM）管或1.5 mL管中。
- 取 1 mL SARS-CoV-2 样本至 BSL-2 实验室。在65°C下热灭活样品30分钟。
- 核糖核酸提取
注意：许多具有特定方案的RNA提取仪器和试剂盒可供随时使用。在这里，介绍了遵循制造商说明的自动化程序。- 取出预填充的96深孔板;轻轻倒置以混合磁珠。混合后，在平坦的表面上轻轻摇动板，以将可能位于壁上的试剂和磁珠浓缩到板底部。
- 小心地撕下铝箔密封膜，以避免板振动和液体溢出。在 96 孔板的第 2 行和第 8 行中，每孔加入 20 μL 蛋白酶 K 和 200 μL 样品。然后，将96孔板放在32通道自动核酸提取仪的底座上。
注意：添加示例后 1 小时内在计算机上运行该程序。 - 将磁条套插入32通道自动核酸提取仪的卡槽中。选择程序GF-FM502T5-TR“1”GF-FM502T5YH（快速版）并运行。
- 提取完成后，取出第 6 行和第 12 行（约 100 μL/样品）中的核酸样品，并分布在干净的无核酸酶 96 孔板中。将样品在4°C下储存长达24小时直至使用或在-20°C下储存更长的时间。
注意：建议使用 100 μL 多通道移液器将样品转移到新的 100-200 μL 板中，因为它可以直接匹配样品板的色谱柱。
- cDNA生成
注意：对于长时间储存的样品，请避免多次冻融循环。按照制造商的说明使用 cDNA 试剂盒进行 cDNA 生成。- 在放置在冰块/冷却块上的 100 或 200 μL PCR 管中，每次反应加入 2 μL 5x RT 预混液（例如，完美实时）、5 μL 样品 RNA 和 3 μL 无 RNase ddH 2 O（总体积 10 μL）。
- 将PCR管置于热循环仪中，设置为在37°C下运行15分钟（逆转录），85°C运行5秒（逆转录酶的热失活），4°C无限时间。
注意：立即处理样品，或在4°C下储存长达24小时直至使用或在-20°C下储存长达6个月。
2. 优化 ddPCR 检测和工作流程
注意：在读取液滴之前/之后优化测定。根据结果，可以在工作的任何阶段对其进行优化，以获得更好的结果。以下是优化ddPCR实验时需要考虑的一些常见因素。
- 验证ddPCR引物和探针（表1）。
注：引物ORF1ab和N改编自中国CDC17、Lu等人18的人类内源性对照基因（RPP30）和Nyaruaba等人13的RBD2。除RBD2外，所有引物和探针都已经过ddPCR测试和优化7，8，18。 - 运行ddPCR测试样品对照，包括阳性对照（具有所有四个靶标的样品），无模板对照（NTC;无核酸酶水或无靶标样本）和提取/阴性对照（从非感染性培养的人类细胞中提取的总核酸或来自卫生志愿者的混合样本）。
注意：优选具有已知靶基因拷贝的标准对照样品。但是，在没有标准的情况下，请使用可用样本来定义其对照或样本矩阵。将控件与测试示例一起运行。 - 通过在PCR的退火步骤（步骤3.2）中插入55°C至65°C的温度梯度来优化退火温度（图2D）。
注意：退火温度优化有助于找到液滴分离最大（易于识别目标）且雨量最少的最佳温度。获得结果后，缩小温度范围以获得更好的优化，例如，55 °C 至 60 °C。 - 优化引物和探针浓度。如果在测定中未实现正液滴和阴液滴之间的最佳分离，请改变引物（300-900nM）和/或探针（100-400nM）浓度。
注意：降低引物/探针浓度会导致目标液滴振幅降低，增加它也会增加靶标的振幅。这在基于幅度的多路复用中很有帮助。 - 根据需要使用标准样品和测试样品，考虑不同的参数，包括空白限 （LoB）、检测限 （LoD）、特异性和灵敏度，测试分析灵敏度。
3. ddPCR工作流程（图1B）和检测开发（表2）
注意：与其他ddPCR检测系统一样，该工作流程还包括四个步骤（图1B），包括反应混合物制备、液滴生成、PCR扩增和液滴读数。
- 反应混合物制备
注意：在干净的独立房间和平衡计分卡内准备所有检测。遵守标准预防措施，包括使用干净的手套、干净的移液器、不含核酸酶的水和消毒剂。将试剂分装在单独的试管中并储存在-20 °C，以避免重复冻融循环。制备测定，如 表2所示。引物和探针储备溶液应以100μM的高浓度储存。工作溶液可以以20-40μM的等分试样储存（在无核酸酶水中稀释）。- 所有检测中的常见步骤
注意：在准备测定之前，根据样品数量计算所需的预混液总量。在这里，将每个预混液组分体积乘以1.05，以解决任何移液错误。- 将反应材料解冻并平衡至室温。短暂涡旋反应组分（30秒）以确保均匀性，并短暂离心以收集管底部的内容物。
- 通过从工作溶液中混合表 2 中详述的特定反应体积，每次测定制备引物 - 探针（PP）混合物。
- 通过将 11 μL （1x） 2x ddPCR 超级混合物用于探针（无 dUTP）、PP 混合物（取决于工作溶液中表 2 所示的测定）和无核酸酶水混合至每孔 19.8 μL 的最终体积来制备预混液。根据样品数量将预混液分配到无核酸酶 96 孔 ddPCR 板的孔中。
注意：对于样品板，请确保一列中的所有8个孔都有溶液。如果仅使用几个孔，例如 5 个样品，则向其他 3 个孔中填充 22 μL 无核酸酶的水或对照缓冲液。 - 要获得最终反应混合物体积 （22 μL），每孔中加入 2.2 μL cDNA 样品，含预混液。用一次性PCR板封口机密封板。
注意：在指定的房间进行样品添加。包括对照，即阳性、NTC 和提取。此外，如果RNA样品浓度低，请减少预混液中的水量，并相应地将样品体积增加到5.5 uL。 - 一旦反应混合物分布在每孔中，短暂涡旋（15-30秒），然后离心（10-15秒）以收集板底部的内容物。继续生成液滴。
- 所有检测中的常见步骤
- 自动产生液滴（补充图1）
注意：可以使用不同的液滴发生器;然而，这项研究是用自动液滴发生器（AutoDG）进行的。为避免扩增子污染，请确保液滴发生器和读数仪在单独的区域有专用空间。装载耗材时，建议从仪器背面开始向前装载，以避免将手移到耗材上，以免交叉污染。- 获取设置 AutoDG 所需的所有耗材，包括用于探头的 AutoDG 油、DG32 墨盒、移液器吸头、冷却块、样品板、液滴板（新的清洁 ddPCR 板）和垃圾箱。
- 在AutoDG触摸屏上，触摸配置样品板并选择样品 板上样品 所在的色谱柱，然后按 OK键。
注意：屏幕将变为黄色，指示应装载耗材的LOAD。 - 打开 AutoDG 门并将耗材装载到各自的位置。
注意：应装载耗材的相应位置将有一个黄色指示器，如果装载耗材，该指示器稍后将变为绿色。这类似于触摸屏。 - 加载样品板和液滴发生板。
注意： 液滴发生板应放置在冷却块上。确保冷却块是紫色的（准备使用）而不是粉红色的（应保存在冰箱中，直到颜色变回紫色）。 - 关闭AutoDG门，确保屏幕为绿色（已装入耗材），并选择/确保油类型为探头油 ，然后再按 开始液滴生成。
- 等待液滴生成。屏幕显示液滴就绪后打开门，然后取出装有 液滴 的板。
- 使用设置为在185 oC下运行5秒的板密封剂，用可刺穿的箔密封密封板。进行PCR扩增。
注意：PCR扩增应在液滴产生后30分钟内开始。
- 聚合酶链反应扩增
- 将密封的液滴板插入 96 深孔热循环仪中，将样品体积设置为 40 μL，盖子温度设置为 105 °C。
- PCR使用该程序扩增液滴：95°C变性10分钟（酶活化），40个循环在94°C变性30秒和1分钟在57°C下退火/延伸，酶在98°C下失活10分钟，并在4°C下无限期保持步骤。PCR后，读取液滴或在4°C下储存长达24小时。
注意：在所有步骤中使用2°C / s的升温速率，因为不同的热循环仪的升降温速率可能不同。在读取液滴之前，将板在4°C下保持至少30分钟以使液滴稳定。
- 液滴读取
- 将热循环的96孔板转移到液滴读数器中，并在连接到液滴读数器的计算机上，打开/启动随附的软件。
- 在设置模式下，选择“ 新建 ”，然后双击任何孔以打开“ 井编辑器 ”对话框。选择要读取的孔，然后选择实验：ABS，超级混合物： 用于探针的ddPCR超级混合物（无dUTP），靶标1类型：通道1未知，靶标2类型：通道2未知。
注意：可以从对照样品的目标 1/2 类型下拉菜单中选择负、空白、NTC 或正。 - 根据孔板布局分配目标或样品名称，然后选择 应用。完成后，选择“ 确定”，然后保存创建的模板。单击 “运行 ”，并在出现提示时选择正确的颜色（FAM/HEX）。
注意：建议在当天第一次运行之前在运行之前启动系统。此外，检查阅读器中的所有指示灯是否均为绿色，如果不是，请按照工具提示状态上的推荐应用程序进行操作。 - 数据采集完成后，从读数器上取下板。根据需要分析数据。
注意：由于初步结果可以在屏幕上看到，因此在第一个孔中运行阳性样品可用于实时质量检查。
4. 数据分析（补充图2和图3）
- 检查所有孔的数据以了解液滴总数。如果液滴计数为<10，000，则丢弃结果并重复测定。设置一个截止点以接受正面和负面结果。例如，最多 3 个或更多阳性液滴的液滴计数可被视为阳性结果的截止值。
注意：所有检测的数据，包括单工、双链、三链探针混合物和四链体检测，均使用随附的软件生成。但是，该软件仅适用于单工和双链分析。对于高阶多重检测（>3 个靶标），需要外部软件。 - 单纯和双链检测
注：外部软件还可以分析单工和双工数据。然而，对于这些测定，使用随附的软件更容易，因此在本文中使用。- 双击要分析的 .qlp 文件以将其打开，然后选择 “分析”。
- 使用 1D振幅 和 2D振幅 中的阈值工具区分正确通道中每个孔的正液滴和负液滴。NTC和阳性对照样品可用作阈值设置的指导。
注意：FAM 结果显示在通道 1 中，而十六进制/VIC 显示在通道 2 中。 - 设置阈值后，结果可以导出为.csv文件，并在Excel中进一步分析或通过直接在结果窗口中读取来记录。
- 三链体探针混合物（补充图2）和四链体测定（补充图2）
注意：在分析三链体探针混合物和四链体测定之前，请下载外部软件。在安装之前，请参阅最低系统要求。- 打开 .qlp 文件，方法是右键单击该文件并选择“使用外部软件 打开 ”，或者打开外部软件并单击“ 浏览 ”选项以在文件夹中找到 .qlp 文件，或者只需将 .qlp 文件拖放到已打开的外部软件上。
- 在板编辑器选项卡中，在选项卡右侧选择要分析的孔。
- 对于三重探针混合物，选择 直接定量（DQ） 作为实验类型，选择 探针混合物三重 作为测定信息并相应地输入靶标名称，然后单击 应用。
- 对于四链体，选择 直接定量（DQ） 作为实验类型，选择 幅度多重 作为检测信息并相应地输入靶标名称，然后单击 应用。
- 在 2D 振幅选项卡的左侧，使用 图形工具 根据选择以分配聚类窗口弹出的建议为不同的目标 聚类分配 特定颜色。
注意：可以根据用户的偏好应用首选群集模式。 - 分配目标颜色后，可以在右下角的 “井数据”窗口中 读取定量数据。将数据导出到 Excel/csv，以便使用孔数据表右上角的三条形图标进行进一步分析。
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Representative Results
在一项概念验证研究中，对临床和研究样品进行了多重分析分析性能测试19。多重检测的性能优于RT-PCR19。由于液滴数量少可能表明液滴生成过程中存在问题，因此在本文中，根据经验数据设定了每孔10，000个液滴的截止值。
正负液滴之间的良好分离以及最小的雨水干扰有助于数据分析。因此，在一个好的实验中，分析优化是关键19。如图 2D中的温度梯度分析结果所示，当运行双链测定（N（FAM）和RPP30（HEX））时，高退火温度（例如，65°C）无法清楚地区分正液滴和负液滴。然而，随着退火温度的降低，正负液滴之间的最佳分离实现了。57°C的温度是最佳的。这也可以在其他测定中观察到19。
使用双色（FAM/HEX）RT-ddPCR检测系统，可以在单个样品中检测一个（图2A，B），两个（图2C），三个（图3A）和四个（图3B）SARS-CoV-2靶标。在数据分析过程中，用于读取液滴的随附软件只能分析单纯和双链分析，如图2所示。这意味着对于高阶多重检测（>3靶标），应使用外部软件进行数据分析，如图3、S2和S3所示。还需要注意的是，外部软件也可用于分析单工和双工数据。对于单纯工和双工数据，分析非常简单，因为靶标在其各自的通道中以正液滴或负液滴的形式分离，如图2所示。NTC样品可以帮助定位负液滴，从而可以帮助设置数据分析阈值，如图2A所示。对于双链测定，可以在单个通道（图2B i，ii）或2D幅度（图2B iii）中进行分析。
对于高阶多重检测，数据分析并不简单，应将注意力集中在液滴靶标分配上。安装外部软件后，选择要分析的孔，选择合适的实验类型，并根据实验类型分配目标集群，如图 S2 和 S3所示。选择分配聚类窗口弹出窗口将指导人们如何在更高的多重检测中分配聚类。使用图形工具为三链体探针混合测定分配多达 8 个液滴簇（图 3A），为基于四链体振幅的测定分配多达 16 个液滴簇（图 3B）。
分配聚类和阈值后，可以在外部软件右下角的孔数据窗口中读取每个靶标的定量数据，以拷贝/μL的形式出现。此数据可用于估计起始样本中靶标的拷贝数。例如，如果在 22 μL 的最终体积中使用 2.2 μL 样品，并且软件记录 ORF1ab 的拷贝数/μL 为 30.5 个拷贝/μL，则 PCR 混合物中有 30.5 x 22 = 671 个 ORF1ab 拷贝。该混合物含有 2.2 μL 原始样品，因此，起始样品中有 671 个 ORF1ab 拷贝，原始样品中有 671/2.2 = 305 个拷贝/μL ORF1ab。该方法可用于估计所有测定中每个靶标的浓度。
| 目标 | 序列 5' 至 3' | 探针染料 | 产品长度（bp） | 裁判 | |
| ORF1ab | 向前 | CCCTGTGGGTT 塔克塔 |
5'- FAM 和 BHQ1-3' 5'- 十六进制和 BHQ1-3' |
119 | [16] |
| 反向 | ACGATTGTGCAT 卡格特加 |
||||
| 探针 | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG 塔特格 |
||||
| N | 向前 | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM 和 BHQ1-3' 5'- 十六进制和 BHQ1-3' |
99 | [16] |
| 反向 | CAGACATTTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| 探针 | TTGCTGCTGCT 加卡加特 |
||||
| RPP30 | 向前 | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- 十六进制和 BHQ1-3' | 87 | [8] |
| 反向 | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| 探针 | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | 向前 | CTCAAGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM 和 BHQ1-3' | 121 | [17] |
| 反向 | CCTGTGCCTGT 塔阿卡特格 |
||||
| 探针 | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA 泰特克 |
||||
表 1：用于开发不同 SARS-CoV-2 检测方法的引物和探针序列。
| 每次测定的引物探针的最终浓度（nMa | |||||
| 目标 | 底漆/探头 | 单工b | 双工c | 三联探头混合d | 四重振幅e |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab 六角形 | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N 十六进制 | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 六角 | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 六角 | |||||
| a 在所有测定中，目标可根据用户的偏好互换。使用的目标用于本实验的演示目的。 | |||||
| b 在FAM或HEX通道的单纯形测定中，一次只能检测到一个靶标。RBD2 用于演示 FAM 通道结果，而 RPP30 用于十六进制通道。 | |||||
| c 在FAM和HEX通道的双链测定中，一次可以检测两个靶标。 | |||||
| d 使用两个通道可以检测三个靶标，即靶标1将以FAM（1×探针浓度）检测，靶标2以十六进制（1×探针浓度）检测，靶标3在两个通道中检测（0.5×十六进制和0.5×FAM探针浓度的混合物构成最终的1×）。 | |||||
| e 在每个通道（FAM和HEX）中检测两个目标，每个通道中的探针浓度为1×和O.5×。 | |||||
表2：每次测定不同引物和探针对的最终浓度。
图 1：样品处理和液滴数字 PCR 工作流程。 （A）样品处理工作流程包括样品收集和运输到BSL-2设施，灭活，提取和cDNA生成。（B） 液滴数字 PCR 工作流程从制备预混液开始，将预混液加载到 ddPCR 板中并添加样品，产生液滴，通过 PCR 扩增液滴内的靶标，最后使用液滴读数器读取扩增的液滴。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：单纯形和双链测定结果，包括退火温度优化。 （A）单个靶标（RBD2）标记FAM时的单纯形测定结果。（B）单个靶标（RPP30）被HEX标记时的单纯形测定结果。（C） 在 N （i） 标记 FAM 和 RPP30 （ii） 标记 HEX 后，1D 和 2D （iii） 通道中两个靶标的双链测定结果。（D）用ORF1ab（FAM）和RPP30（HEX）标记的双链测定的退火温度梯度（65°C至55°C）结果。请点击此处查看此图的大图。
图 3：三链体探针混合物和基于四链体振幅的多重测定结果。 （A）用以下FAM：HEX比率标记三个靶标时的三重探针混合测定结果;RBD2 （1：0）、N （0.5：0.5） 和 RPP30 （0：1）。（B）用以下FAM：HEX比率标记四个靶标后的基于四链体振幅的测定结果;RBD2（0.5：0）、N （1：0）、RPP30 （0：0.5） 和 ORF1ab （0：1）。1和0.5分别是探针浓度250nM和125nM。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：使用自动液滴发生器产生液滴。 （A） 设置自动危险品所需的消耗品。（B） 在 AutoDG 触摸屏上，触摸配置样品 板 并选择样品位于样品板上的色谱柱，然后按 OK。（C） 选择后，屏幕将变为黄色，指示应将耗材装载到何处。（D） 打开自动危险品门，将耗材装载到相应位置。从后面向前装载耗材。确保每次添加耗材时，该位置的指示灯都会从黄色变为绿色。（E）确保使用的油类型是探头用油。（F） 关闭自动危险品门，检查自动危险品触摸屏是否为绿色，确保所有试剂均已就位。（G） 按 “开始液滴 生成”以生成液滴。（H） 液滴生成完成后，打开自动危险品并取出液滴板。（I）使用可刺穿的箔热封密封液滴板。请点击此处下载此文件。
补充图2：使用外部软件分析基于振幅的多重ddPCR测定结果的步骤。（A） 在计算机上安装外部软件。（B） 通过右键单击 .qlp 文件并选择“使用已安装的外部软件 打开 ”或打开外部软件并单击“ 浏览 ”选项以在文件夹中找到该文件来打开该文件。或者，可以将 .qlp 文件拖放到打开的外部软件中以将其打开。（C） 打开后，在“ 板编辑器 ”选项卡的右侧，从下拉菜单中选择探针混合三层并相应地分配目标信息，然后单击 “应用”。（D） 在 2D 振幅选项卡的左侧，使用 图形工具 为不同的目标分配特定颜色以进行检测和量化。确定液滴簇目标后，可以在“ 井数据” 窗口的同一二维振幅选项卡中查看定量结果。 请点击此处下载此文件。
补充图3：使用外部软件分析基于振幅的多重ddPCR测定结果的步骤。 （A） 在计算机上安装外部软件。（B） 打开 .qlp 文件，方法是右键单击该文件并选择“使用已安装的外部软件 打开 ”，或者打开外部软件并单击“ 浏览 ”选项以在文件夹中找到该文件。或者，可以将.qlp文件拖放到已经打开的外部软件中以将其打开。（C） 打开后，在“ 板编辑器 ”选项卡的右侧，从下拉菜单中选择振幅多重并相应地分配目标信息，然后单击 “应用”。（D） 在 2D 振幅选项卡的左侧，使用 图形工具 为不同的目标分配特定颜色以进行检测和量化。确定液滴簇目标后，可以在“ 井数据” 窗口的同一二维振幅选项卡中查看定量结果。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
关于如何开发用于SARS-CoV-2检测的RT-ddPCR检测方法的资源很少。虽然本文未使用，但具有已知拷贝的标准样品可用于开发和优化测定。然而，在这项工作中，在Vero-E6细胞中生长的SARS-CoV-2样品在人类基因组RNA的背景中加标，并用作开发测定的标准样品。在开发检测方法时，正确的引物和探针序列至关重要。由于SARS-CoV-2 RT-ddPCR的大多数初步工作都使用了中国CDC的引物和靶向ORF1ab和N基因的探针，因此他们发现它们适合纳入这项工作7，8，9，10，11。在以前的工作中，还使用ddPCR比较了这些引物的分析特异性和灵敏度7。RBD2引物和探针13是内部开发的，适用于RT-ddPCR。由于该测定可用于不同的应用，包括诊断，因此核糖核酸酶P蛋白亚基p30（RPP30）特异性人类基因包含在所有多重测定中。这些基因可用作诊断实验的人类内源性对照。但是，在环境采样或其他不需要人类参考基因的研究的情况下，可以将该靶标与另一个SARS-CoV-2靶标交替使用。
在所有测定中，重要的是包括用于验证测定和实验数据的对照。这些对照可能包括：NTC（无核酸酶水作为样品），以帮助设置阈值和定位负液滴簇;阳性对照（含有所有SARS-CoV-2靶标的样本，包括人类参考基因），以评估试剂失效、引物和探针完整性以及阳性液滴靶标的大量逆转录检测/定位;和提取对照（来自健康志愿者的混合人类样本或从非感染性培养的人细胞中提取的总核酸）以检测提取步骤的失败或成功。
大多数ddPCR系统（包括QX200系统）的动态范围很窄，从1到120，000拷贝/20 μL反应。在检测未知样品时，起始样品中的目标浓度通常是未知的，这可能会在定量高浓度样品时带来挑战。为了克服这个问题，建议在定量怀疑含有大量靶分子的样品（如细胞培养）时，应计划相应地减少起始样品。在靶拷贝数/基因组未知的情况下，应通过在预期的数字范围内对每个样品进行四次十倍连续稀释来确定最佳起始量。通过分析这四个点，可以确保其中一个数据点在最佳数字范围内。
使用高引物和低探针浓度是大多数单工和双链ddPCR实验的必要条件。这种浓度差异增加了正液滴簇和负液滴簇之间的振幅分离距离，从而使数据分析变得容易。然而，当开发高阶多重测定时，这些浓度的变化可能导致正液滴靶标位置的变化，如图 3 和图4所示。因此，除了退火温度之外，一种分析优化选项是改变目标引物或探针浓度以区分液滴。这种现象在14，15，16之前已经使用和解释过。
尽管检测性能良好，但这项工作是一个两步RT-ddPCR工作流程。ddPCR之前的额外逆转录步骤为样品污染提供了空间。但是，如果使用仔细和适当的样品处理技术，这将不是问题。积极的是，已知DNA比RNA更稳定。与RNA相比，RNA转化为cDNA可以延长样品在储存期间的保质期。两步RT-ddPCR实验也比一步RT-ddPCR实验便宜。
与RT-qPCR相比，RT-ddPCR价格昂贵。因此，在进行RT-ddPCR时应考虑。例如，在诊断过程中，在其样品具有低丰度靶标的情况下，可以使用RT-ddPCR。然而，dPCR仪器和试剂的成本可能会很快下降，该技术将在许多实验室中采用，就像过去常规PCR和qPCR一样。因此，为dPCR的当前和未来用户设置这样的协议非常重要。总之，所开发的检测方法为潜在用户提供了根据其应用改变靶标的空间。多重检测将确保在一次反应中有效地检测单个样品中的多个靶标。到目前为止，这可能是第一个详细说明如何使用AutoDG系统的协议，包括SARS-CoV-2检测中的外部软件。在检测优化方面仍需要做更多的工作，以便在四链体检测中实现更好的分离。标准品的使用也将有助于改进已开发的检测方法。
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Disclosures
作者没有需要披露的冲突。
Acknowledgments
本研究由中国卫生部传染病控制特大项目资助，批准号为2017ZX10302301-005，中非联合研究中心，批准号SAJC201605。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
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