Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62295
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,3,4, 1, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

Summary

עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.

Abstract

אבחון מגיפת SARS-CoV-2 המתמשכת נמצא בראש סדר העדיפויות של כל המדינות ברחבי העולם. נכון לעכשיו, PCR כמותי של שעתוק לאחור (RT-qPCR) הוא תקן הזהב לאבחון SARS-CoV-2 מכיוון שאין פתרון קבוע זמין. יעילה ככל שתהיה טכניקה זו, התגלו מחקרים המראים את מגבלותיה בזיהוי ואבחון, במיוחד כשמדובר במטרות נמוכות בשפע. לעומת זאת, PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), טכנולוגיה מתפתחת לאחרונה עם יתרונות עדיפים על qPCR, הוכחה להתגבר על האתגרים של RT-qPCR באבחון של SARS-CoV-2 מדגימות מטרה בשפע נמוך. באופן פרוספקטיבי, במאמר זה, היכולות של RT-ddPCR מורחבות עוד יותר על ידי הצגת שלבים כיצד לפתח סימפלקס, דופלקס, תערובת בדיקה טריפלקס ומבחני quadruplex באמצעות מערכת זיהוי שני צבעים. באמצעות פריימרים וגשושיות הממוקדים באתרים ספציפיים של גנום SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 ו-RBD2), הפיתוח של בדיקות אלה הוכח כאפשרי. בנוסף, מפורטים צעד אחר צעד פרוטוקולים, הערות והצעות כיצד לשפר את זרימת העבודה של הבדיקות ולנתח נתונים. התאמת זרימת עבודה זו בעבודות עתידיות תבטיח שניתן יהיה לזהות ברגישות את המספר המרבי של יעדים במדגם קטן, שיפור משמעותי בעלות ובתפוקת הדגימה.

Introduction

תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טכניקה מוכרת היטב, עברה מספר טרנספורמציות מאז הופעתה והפכה לטכניקה רבת עוצמה המסוגלת לספק תשובות למחקר חומצות גרעין. טרנספורמציות אלה היו שיפור מתמיד של הטכניקה הישנה. ניתן לסכם תמורות אלה לשלושה דורות1. הדור הראשון הוא PCR קונבנציונלי המסתמך על אלקטרופורזה בג'ל כדי לכמת ולזהות מטרות מוגברות. הדור השני הוא PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) שיכול לזהות דגימות בזמן אמת ולהסתמך על עקומה סטנדרטית כדי לכמת ישירות מטרות בדגימה. הדור השלישי, PCR דיגיטלי (dPCR), יכול לבצע הן זיהוי, והן כימות מוחלט של מטרות חומצות גרעין ללא צורך בעקומה סטנדרטית. dPCR שופר גם עוד יותר מתאי תגובה המופרדים על ידי בארות של קיר לאמולסיות של נפט, מים וכימיקלים מייצבים בתוך אותה באר כפי שניתן לראות ב- PCR דיגיטלימבוסס טיפות 2. ב-Droplet Digital PCR (ddPCR), הדגימה מחולקת לאלפי טיפות בגודל ננוליטר המכילות מטרות בודדות שמאוחר יותר יכומתו באמצעות סטטיסטיקת פואסון 2,3,4. טכניקה זו מעניקה ל- ddPCR יתרון בכימות מטרות נמוכות בשפע בהשוואה לדורות האחרים של PCR.

לאחרונה, יישומים מרובים הדגישו את העליונות של ddPCR על פני qPCR הנפוץ בעת זיהוי וכימות מטרות נמוכות בשפע 1,5,6. SARS-CoV-2 אינו יוצא מן הכלל ליישומים אלה 7,8,9,10,11,12. מאז התפרצות SARS-CoV-2, מדענים עובדים בכל החזיתות כדי למצוא פתרונות כיצד לאבחן את הנגיף ולזהות אותו ביעילות. תקן הזהב הנוכחי עדיין נשאר להיות qPCR13. עם זאת, RT-ddPCR הוכח כמדויק יותר בזיהוי מטרות SARS-CoV-2 בשפע נמוך מדגימות סביבתיות וקליניות בהשוואה ל- RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. רוב העבודות שפורסמו על ידי SARS-CoV-2 ddPCR תלויות במבדקים חד-צדדיים עם המולטיפלקסים בהתאם למבדקים מסחריים. לפיכך, יש לעשות יותר כדי להסביר כיצד לפתח בדיקות RT-dPCR מרובות לזיהוי SARS-CoV-2.

בתכנון בדיקה נכון, ניתן להשתמש בריבוב כדי לחסוך בעלויות, להגדיל את תפוקת הדגימה ולמקסם את מספר המטרות שניתן לזהות ברגישות בתוך מדגם קטן. כאשר ריבוב עם ddPCR, יש לקחת בחשבון כמה fluorophores ניתן לזהות במערכת מסוימת. פלטפורמות ddPCR מסוימות יכולות לתמוך בעד שלושה ערוצים בעוד שאחרות תומכות בשני ערוצים בלבד. לפיכך, בעת ריבוב עם שני ערוצים, יש להשתמש בגישות שונות, כולל ריבוב מסדר גבוה יותר כדי לזהות יותר משתי מטרות14,15,16. בעבודה זו, מערכת זיהוי ddPCR בשני צבעים משמשת כדי להראות שלבים כיצד לפתח מבחני SARS-CoV-2 RT-ddPCR שונים שניתן להתאים ליישומי מחקר שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרה אתית
מכון ווהאן לווירולוגיה (WHIOV) הוא בין המעבדות והמכונים שאושרו על ידי ה- CDC הסיני של העיר ווהאן לערוך מחקר על SARS-CoV-2 ולזהות COVID-19 מדגימות קליניות. מחקר על פיתוח טכניקות אבחון חדשות עבור COVID-19 באמצעות דגימות קליניות אושר גם על ידי הוועדה האתית של מכון ווהאן לווירולוגיה (2020FCA001).

1. זרימת עבודה של עיבוד לדוגמה (איור 1A)

הערה: לאורך כל הפרוטוקול, חשוב להשתמש בחדרים נפרדים עם פיפטות ייעודיות לטיפול בדגימות (מיצוי ואחסון), הכנה ואחסון של ריאגנטים/מאסטרמיקס, הכנת תערובת תגובה (דגימה פלוס מאסטרמיקס) ואיתור, כדי למנוע זיהום צולב. הבדיקות שיפותחו יכולות לשמש לאיתור דגימות קליניות או דגימות מחקר. יש להתייחס לכל הדגימות כאילו הן יכולות להעביר גורמים זיהומיים גם בעת שימוש בנוהלי מעבדה בטוחים. שלבי עיבוד הדגימה צריכים להיעשות במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בהתאם לכללי BSL-2 מחמירים, כולל לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE).

  1. השבתה לדוגמה
    1. קח 1 מ"ל של דגימת SARS-CoV-2 למעבדה BSL-2. דגימות מנוטרלות בחום ב-65°C למשך 30 דקות.
      הערה: דגימות עשויות להגיע ממקורות שונים, ולכן, יש לוודא שהנפח להיות מושבת מספיק כדי להבטיח מיצוי RNA לאחר מכן. רוב ערכות החילוץ דורשות נפח דגימה קטן של עד 200 μL, ומכאן, נפח דגימה של כ -1 מ"ל יספיק להפעלה. חומרים פעילי שטח, ערכות ומאגרי ליזיס עשויים לשמש גם לנטרול ישיר ולמיצוי RNA על פי SOP של המעבדות עצמן.
    2. קח דגימות לארון בטיחות ביולוגית (BSC) ותן להן לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר לאירוסולים פוטנציאליים לשקוע. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות, אם לא עובדו מיד.
      הערה: אין צורך בגורם מכיל ספציפי לאחסון דגימות. ניתן לאחסן דגימות בצינורות או במיכלים המשמשים במהלך ההשבתה. עבור עבודה זו, רוב הדגימות אוחסנו בצינורות מדיה הובלה ויראלית (VTM) או צינורות 1.5 מ"ל.
  2. מיצוי RNA
    הערה: מכשירים רבים למיצוי RNA וערכות עם פרוטוקולים ספציפיים זמינים לשימוש מוכן. כאן מוצג הליך אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
    1. מוציאים את צלחת פתח הבאר המלאה מראש בעומק 96; הפוך אותו בעדינות כדי לערבב את החרוזים המגנטיים. לאחר הערבוב, נערו בעדינות את הצלחת על משטח ישר כדי לרכז מגיב וחרוזים מגנטיים שעשויים להיות על הקיר לתחתית הצלחת.
    2. קרעו בזהירות את סרט האיטום של רדיד אלומיניום כדי למנוע רעידות של הצלחת ושפיכת נוזלים. הוסף 20 μL של proteinase K ו 200 μL של המדגם לכל באר בשורות 2 ו 8 של צלחת 96 באר. לאחר מכן, הניחו את צלחת 96 הבארות על בסיס מכשיר מיצוי חומצות הגרעין האוטומטי בן 32 הערוצים.
      הערה: הפעל את התוכנית במחשב תוך שעה אחת לאחר הוספת הדגימה.
    3. הכנס את שרוול המוט המגנטי לחריץ הכרטיס של מכשיר מיצוי חומצות הגרעין האוטומטי בן 32 הערוצים. בחר את התוכנית GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (גרסה מהירה) והפעל אותה.
    4. לאחר השלמת המיצוי, מוציאים את דגימות חומצות הגרעין בשורות 6 ו-12 (כ-100 מיקרוליטר/דגימה) ומפזרים בצלחת נקייה נטולת נוקלאז בת 96 בארות. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות עד לשימוש או בטמפרטורה של -20°C למשך זמן רב יותר.
      הערה: מומלץ להשתמש בפיפטה רב-ערוצית של 100 μL כדי להעביר דגימות לצלחת חדשה של 100-200 μL מכיוון שהיא יכולה להתאים ישירות לעמודות של צלחת הדגימה.
  3. יצירת cDNA
    הערה: עבור דגימות המאוחסנות במשך זמן רב, הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה מרובים. בצע יצירת cDNA באמצעות ערכת cDNA בהתאם להוראות היצרן.
    1. בצינור PCR של 100 או 200 μL הממוקם על בלוק קרח/קירור, הוסף 2 μL של תערובת מאסטר RT 5x (למשל, Perfect Real Time), 5 μL של RNA דגימה, ו- 3 μL של ddH2O ללא RNase לכל תגובה (נפח כולל 10 μL).
    2. מקם את צינור ה- PCR במחזור תרמי המוגדר לפעול ב- 37 ° C למשך 15 דקות (שעתוק הפוך), 85 ° C למשך 5 שניות (השבתת חום של שעתוק הפוך), ו- 4 ° C לזמן אינסופי.
      הערה: יש לעבד את הדגימות באופן מיידי, או לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות עד לשימוש או בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.

2. אופטימיזציה של בדיקת ddPCR וזרימת עבודה

הערה: מטב את הבדיקות לפני/אחרי קריאת הטיפות. בהתאם לתוצאות, הם יכולים להיות אופטימיזציה בכל שלב של העבודה כדי להשיג תוצאות טובות יותר. להלן מספר גורמים נפוצים שיש לקחת בחשבון בעת אופטימיזציה של ניסויי ddPCR.

  1. אמת את הפריימרים והבדיקות של ddPCR (טבלה 1).
    הערה: הפריימרים ORF1ab ו-N הותאמו מ-China CDC17, גן הבקרה האנדוגני האנושי (RPP30) מ-Lu et al.18, ו-RBD2 מ-Nyaruaba et al.13. כל הפריימרים והבדיקות למעט RBD2 כבר נבדקו ddPCR ועברו אופטימיזציהשל 7,8,18.
  2. הפעל את פקדי הדגימה של בדיקת ddPCR הכוללים בקרה חיובית (מדגם עם כל ארבעת היעדים), ללא בקרת תבנית (NTC; מים ללא נוקלאז או דגימה ללא מטרות), ומיצוי / בקרה שלילית (סך חומצת הגרעין המופקת מתא אנושי לא זיהומי בתרבית או דגימות מאוגמות ממתנדבי בריאות).
    הערה: עדיפות לדגימות בקרה סטנדרטיות עם עותקים ידועים של גני המטרה. עם זאת, בהיעדר תקנים, השתמש בדוגמאות הזמינות כדי להגדיר את הפקדים או את מטריצת הדגימה שלהם. הפעל את הפקדים יחד עם דוגמאות בדיקה.
  3. מטבו את טמפרטורת החישול (איור 2D) על-ידי הכנסת שיפוע טמפרטורה של 55°C עד 65°C בשלב החישול של PCR (שלב 3.2).
    הערה: אופטימיזציה של טמפרטורת החישול מסייעת למצוא את הטמפרטורה הטובה ביותר שבה הפרדת הטיפות היא מקסימלית (זיהוי מטרה קל) עם גשם מינימלי. לאחר קבלת התוצאות, צמצמו את טווח הטמפרטורות לאופטימיזציה טובה יותר, למשל, 55°C עד 60°C.
  4. מטבו את ריכוזי הפריימר והבדיקה. אם לא הושגה הפרדה אופטימלית בין טיפות חיוביות ושליליות במבחנים, שנו את ריכוזי הפריימר (300-900 ננומטר) ו/או הבדיקה (100-400 ננומטר).
    הערה: הורדת ריכוזי פריימר/בדיקה גורמת למשרעת טיפת מטרה נמוכה יותר והגדלתה גם מגדילה את משרעת המטרה. זה יכול להועיל בריבוב מבוסס משרעת.
  5. בדוק את הרגישות האנליטית בהתחשב בפרמטרים שונים, כולל, גבול הריק (LoB), גבול הזיהוי (LoD), ספציפיות ורגישות באמצעות דגימות סטנדרטיות ודגימות בדיקה, לפי העדפה.

3. זרימת עבודה של ddPCR (איור 1B) ופיתוח בדיקות (טבלה 2)

הערה: בדומה למערכות זיהוי ddPCR אחרות, זרימת עבודה זו מורכבת גם היא מארבעה שלבים (איור 1B), כולל הכנת תערובת תגובה, יצירת טיפות, הגברת PCR וקריאת טיפות.

  1. הכנת תמהיל תגובות
    הערה: הכן את כל הבדיקות בחדר נפרד ונקי ובתוך BSC. הקפידו על אמצעי זהירות סטנדרטיים, כולל שימוש בכפפות נקיות, פיפטות נקיות, מים ללא נוקלאז וחומרי חיטוי. ריאגנטים Aliquot בצינורות נפרדים לאחסן ב -20 oC כדי למנוע מחזורי הפשרה הקפאה חוזרים. הכנת בדיקות כפי שמוצג בטבלה 2. יש לאחסן את תמיסות מלאי הפריימר והגשושית בריכוזים גבוהים של 100 מיקרומטר. פתרונות העבודה ניתן לאחסן aliquots של 20-40 מיקרומטר (מדולל במים ללא נוקלאז).
    1. שלבים נפוצים בכל הבדיקות
      הערה: לפני הכנת המבחנים, חשב את הנפח הכולל של Mastermix הדרוש בהתבסס על מספר הדגימות. כאן, כל נפח רכיב Mastermix הוכפל ב -1.05 כדי לקחת בחשבון שגיאות pipetting.
      1. הפשירו ושיוונו את חומרי התגובה לטמפרטורת החדר. מערבלים את רכיבי התגובות לזמן קצר (30 שניות) כדי להבטיח הומוגניות, ולצנטריפוגה קצרה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור.
      2. הכן תערובת פריימר-בדיקה (PP) לכל בדיקה על-ידי ערבוב נפחי תגובה ספציפיים כמפורט בטבלה 2 מתוך פתרונות העבודה.
      3. הכן את תערובת המאסטר על ידי ערבוב 11 μL (1x) של 2x ddPCR supermix עבור בדיקות (ללא dUTP), תערובת PP (תלוי בבדיקה כפי שמוצג בטבלה 2 מתמיסת העבודה) ומים ללא נוקלאז לנפח סופי של 19.8 μL לכל באר. להפיץ את תערובת המאסטר לתוך הבארות של צלחת ddPCR 96-well ללא nuclease מבוסס על מספר הדגימות.
        הערה: עבור צלחת הדגימה, ודא שלכל 8 הבארות בטור אחד יש את הפתרון. אם משתמשים רק בכמה בארות, למשל 5 דגימות, מלאו את 3 הבארות האחרות ב-22 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז או חיץ בקרה כל אחת.
      4. כדי לקבל את נפח תערובת התגובה הסופית (22 μL), הוסף 2.2 μL של דגימת cDNA לכל באר המכילה mastermix. אטמו את הצלחת עם אוטם צלחת PCR חד פעמי.
        הערה: בצע את התוספות לדוגמה בחדר המיועד. כלול את הפקדים כלומר, חיובי, NTC וחילוץ. בנוסף, אם דגימות הרנ"א הן בריכוז נמוך, הפחיתו את נפח המים במיקס המאסטרמיקס והגדילו את נפח הדגימה בהתאם עד 5.5 uL.
      5. לאחר חלוקת תערובת התגובה לכל באר, מערבלים לזמן קצר (15-30 שניות), וצנטריפוגה (10-15 שניות) כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצלחת. המשך ליצירת טיפות.
  2. יצירת טיפות אוטומטית (איור משלים 1)
    הערה: ניתן להשתמש בגנרטורים שונים של טיפות; עם זאת, מחקר זה בוצע באמצעות מחולל טיפות אוטומטי (AutoDG). כדי למנוע זיהום אמפליקון, ודא שלמחולל הטיפות ולקוראים יש מקום ייעודי באזורים נפרדים. בעת טעינת חומרים מתכלים, מומלץ להתחיל לטעון מהחלק האחורי של המכשיר עובד לכיוון הקדמי כדי למנוע העברת ידיים על החומרים המתכלים כדי למנוע זיהום צולב.
    1. השג את כל החומרים המתכלים הדרושים להגדרת AutoDG, כולל שמן AutoDG לבדיקות, מחסניות DG32, קצוות פיפטה, בלוק קירור, צלחת דגימה, צלחת טיפה (צלחת ddPCR נקייה חדשה) ופח אשפה.
    2. במסך המגע AutoDG, גע באפשרות קביעת תצורה של צלחת דגימה ובחר עמודות שבהן הדגימות ממוקמות בלוח הדגימה ולחץ על אישור.
      הערה: המסך יהפוך לצהוב המציין LOAD שבו יש לטעון חומרים מתכלים.
    3. פתח את דלת AutoDG וטען חומרים מתכלים במקומם.
      הערה: במקומות המתאימים שבהם יש לטעון חומרים מתכלים יופיע מחוון צהוב שיהפוך מאוחר יותר לירוק אם החומרים המתכלים נטענים. זה דומה למסך המגע.
    4. טען את צלחת הדגימה ואת צלחת יצירת הטיפות.
      הערה: יש להניח את צלחת יצירת הטיפות על בלוק הקירור. ודאו שגוש הקירור סגול (מוכן לשימוש) ולא ורוד (יש לשמור במקפיא עד שהצבע יחזור לסגול).
    5. סגור את דלת AutoDG, ודא שהמסך ירוק (חומרים מתכלים נטענים), ובחר/ודא שסוג השמן הוא שמן לבדיקות לפני לחיצה על התחל ייצור טיפות.
    6. המתן עד שהטיפות ייווצרו. פתח את הדלת ברגע שהמסך מציג טיפות מוכנות והסר את הצלחת המכילה את הטיפות.
    7. אטמו את הצלחת עם אטם רדיד אלומיניום הניתן לניקוב באמצעות אטם פלטות שנקבע לפעול בטמפרטורה של 185 מעלותצלזיוס למשך 5 שניות. המשך להגברת PCR.
      הערה: יש להתחיל בהגברה של PCR תוך 30 דקות לאחר יצירת טיפות.
  3. הגברה PCR
    1. הכנס את צלחת הטיפות האטומה למחזור תרמי של באר בעומק 96, הגדר את נפח הדגימה ל- 40 μL ואת טמפרטורת המכסה ל- 105 ° C.
    2. PCR להגביר את הטיפות באמצעות התוכנית: 95 ° C במשך 10 דקות (הפעלת אנזים), 40 מחזורים של denaturation ב 94 ° C במשך 30 s ו 1 דקה חישול / הרחבה ב 57 ° C, השבתת אנזים ב 98 ° C במשך 10 דקות, והחזקת צעד ב 4 ° C ללא הגבלת זמן. לאחר ה-PCR, יש לקרוא את הטיפות או לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות.
      הערה: השתמש בקצב רמפה של 2 ° C / s בכל השלבים, מכיוון שקצבי הרמפה עשויים להיות שונים עבור מחזורים תרמיים שונים. החזיקו את הצלחת למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר ייצוב טיפות לפני קריאת הטיפות.
  4. קריאה טיפתית
    1. העבירו את הצלחת התרמית בעלת 96 הקידוחים לקורא טיפות, ובמחשב המחובר לקורא הטיפות, פתחו/הפעילו את התוכנה הנלווית.
    2. במצב ההתקנה, בחר חדש ולאחר מכן לחץ פעמיים על באר כלשהי כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח עורך היטב . בחר את הבארות לקריאה ובחר ניסוי: ABS, Supermix: ddPCR Supermix עבור בדיקות (ללא dUTP), יעד 1 סוג: Ch1 לא ידוע, יעד 2 סוג: Ch2 לא ידוע.
      הערה: ניתן לבחור שלילי, ריק, NTC או חיובי מהתפריט הנפתח מסוג יעד 1/2 עבור דגימות הבקרה.
    3. הקצו את שמות היעד או הדוגמאות בהתבסס על פריסת הלוחות ובחרו 'החל'. בסיום, בחר אישור ושמור את התבנית שנוצרה. לחץ על הפעל וכאשר תתבקש לבחור את הצבע הנכון (FAM/HEX).
      הערה: מומלץ להפעיל את המערכת לפני הריצה לפני הריצה הראשונה של היום. כמו כן, בדוק אם כל הנורות בקורא ירוקות ואם לא, עקוב אחר היישום המומלץ במצב תיאור הכלי.
    4. לאחר סיום איסוף הנתונים, הסר את הלוח מהקורא. נתח נתונים כנדרש.
      הערה: מכיוון שניתן לראות תוצאות ראשוניות על המסך, ניתן להשתמש בהפעלת הדגימות החיוביות בבארות הראשונות לבדיקת איכות בזמן אמת.

4. ניתוח נתונים (איורים משלימים 2 ו-3)

  1. בדוק את הנתונים מכל הבארות עבור המספר הכולל של טיפות. אם ספירת הטיפות היא <10,000, מחק את התוצאות וחזור על הבדיקה. הגדר חתך כדי לקבל תוצאות חיוביות ושליליות. לדוגמה, ספירת טיפות של עד 3 טיפות חיוביות או יותר יכולה להיחשב כחיתוך לקבלת תוצאות חיוביות.
    הערה: הנתונים עבור כל הבדיקות, כולל בדיקות חד-צדדיות, דופלקס, טריפלקס ובדיקות Quadruplex מופקים באמצעות התוכנה הנלווית. עם זאת, תוכנה זו מתאימה רק לבדיקות חד-צדדיות ודומיכות. עבור מבחני מולטיפלקס מסדר גבוה (>3 יעדים), יש צורך בתוכנה חיצונית.
  2. בדיקות חד-צדדיות ודו-צדדיות
    הערה: התוכנה החיצונית יכולה גם לנתח נתונים חד-צדדיים ודו-צדדיים. עם זאת, השימוש בתוכנה הנלווית קל יותר עבור בדיקות אלה, ולכן משמש במאמר זה.
    1. לחץ פעמיים על קובץ ה- .qlp לניתוח כדי לפתוח אותו ובחר נתח.
    2. השתמש בכלי הסף באמפליטודה 1D ובמשרעת דו-ממדית כדי להבחין בין טיפות חיוביות ושליליות עבור כל באר בערוץ הנכון. ניתן להשתמש בדגימות NTC ובקרה חיובית כהנחיה להגדרת סף.
      הערה: תוצאות FAM נראות בערוץ 1 ואילו HEX/VIC בערוץ 2.
    3. לאחר הגדרת הסף, ניתן לייצא את התוצאות כקובץ .csv ולנתח אותן עוד יותר ב- Excel או להקליט אותן על ידי קריאה ישירות בחלון התוצאות.
  3. תערובת גשושיות טריפלקס (איור משלים 2) ומבחני קוואדרופלקס (איור משלים 2)
    הערה: לפני ניתוח תערובת הבדיקה של טריפלקס ובדיקת quadruplex, הורד את התוכנה החיצונית. עיין בדרישות המערכת המינימליות לפני ההתקנה.
    1. פתח את קובץ ה- .qlp על ידי לחיצה ימנית עליו ובחירה באפשרות פתח עם התוכנה החיצונית, או על ידי פתיחת התוכנה החיצונית ולחיצה על אפשרות עיון כדי לאתר את קובץ ה- .qlp בתיקיה שלך, או פשוט על ידי גרירת קובץ ה- .qlp ושחרורו בתוכנה החיצונית שכבר פתוחה.
    2. בכרטיסייה עורך לוחות, בחר את הבארות לניתוח בצד ימין של הכרטיסייה.
      1. עבור תערובת גשושיות טריפלקס, בחר כימות ישיר (DQ) כסוג ניסוי, בחר Probe Mix Triplex כמידע בדיקה והזן שמות יעד בהתאם, ולאחר מכן לחץ על החל.
      2. עבור quadruplex, בחר כימות ישיר (DQ) כסוג ניסוי, בחר Amplitude Multiplex כמידע בדיקה והזן שמות יעד בהתאם, ולאחר מכן לחץ על החל.
    3. בצד שמאל של הכרטיסייה 'משרעת דו-ממדית', השתמשו בכלי תרשימים כדי להקצות צבעים מסוימים לאשכולות יעד שונים בהתאם להצעות המוקפצות בחלון 'בחר להקצאת אשכול '.
      הערה: ניתן להחיל מצב אשכול מועדף בהתאם להעדפת המשתמשים.
    4. לאחר הקצאת צבעי היעד, ניתן לקרוא את נתוני הכימות בחלון נתוני באר בפינה השמאלית התחתונה. יצא נתונים ל- Excel/csv לניתוח נוסף באמצעות סמל הסרגל המשולש בפינה השמאלית העליונה של טבלת נתוני הבאר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר הוכחת היתכנות, הביצועים האנליטיים של מבחני המולטיפלקס נבדקו על דגימות קליניות ומחקריות19. הביצועים של מבחני המרבב היו עדיפים על אלה של RT-PCR19. מכיוון שמספר נמוך של טיפות עשוי להצביע על בעיה במהלך יצירת טיפות, במאמר זה נקבע סף של 10,000 טיפות לבאר בהתבסס על נתונים אמפיריים.

הפרדה טובה בין טיפות חיוביות ושליליות עם הפרעה מינימלית לגשם יכולה לסייע בניתוח נתונים. לפיכך, בניסוי טוב, אופטימיזציה של בדיקות היא המפתח19. כפי שניתן לראות בתוצאות ניתוח שיפוע הטמפרטורה באיור 2D, טמפרטורות חישול גבוהות (למשל, 65 מעלות צלזיוס) לא יכלו להבחין בבירור בין טיפות חיוביות לטיפות שליליות כאשר בוצעה בדיקת דופלקס (N (FAM) ו-RPP30 (HEX)). עם זאת, עם ירידה בטמפרטורת החישול, הושגה הפרדה אופטימלית בין טיפות חיוביות ושליליות. טמפרטורה של 57 מעלות צלזיוס נמצאה אופטימלית. ניתן לראות זאת גם בבדיקות אחרות19.

באמצעות מערכת זיהוי RT-ddPCR בשני צבעים (FAM/HEX), אפשר לזהות מטרה אחת (איור 2A, B), שתיים (איור 2C), שלוש (איור 3A) וארבע (איור 3B) של SARS-CoV-2 בתוך דגימה אחת. במהלך ניתוח הנתונים, התוכנה הנלווית המשמשת לקריאת טיפות יכולה לנתח רק בדיקות חד-צדדיות ודו-צדדיות כפי שמוצג באיור 2. משמעות הדבר היא שעבור מבחני מולטיפלקס מסדר גבוה יותר (>3 מטרות), יש להשתמש בתוכנה חיצונית לניתוח נתונים כפי שמוצג באיורים 3, S2 ו-S3. חשוב גם לציין כי התוכנה החיצונית יכולה לשמש גם לניתוח נתונים חד-צדדיים ודו-צדדיים. עבור נתונים חד-צדדיים ודו-צדדיים, הניתוח הוא די פשוט מאחר שהמטרות מופרדות כטיפות חיוביות או שליליות בערוצים שלהן, כפי שמוצג באיור 2. דגימת NTC יכולה לסייע במיקום של טיפות שליליות, שבתורן יכולות לעזור לקבוע סף אחד לניתוח נתונים, כפי שמוצג באיור 2A. עבור בדיקת דופלקס, ניתוח יכול להיעשות בערוצים בודדים (איור 2B i,ii) או באמפליטודה דו-ממדית (איור 2B iii).

עבור מבחני מולטיפלקס מסדר גבוה יותר, ניתוח הנתונים אינו פשוט, ויש למקד את תשומת הלב בהקצאת יעד טיפתי. לאחר התקנת התוכנה החיצונית, בחר בארות לניתוח, בחר את סוג הניסוי המתאים והקצה אשכולות מטרה בהתבסס על סוג הניסוי כפי שמוצג באיור S2 ו-S3. החלון בחר כדי להקצות אשכול ינחה אותך כיצד להקצות אשכולות במבחני המרבב הגבוהים יותר. השתמשו בכלי הגרפים כדי להקצות עד 8 אשכולות טיפות לבדיקת תערובת הגשושית הטריפלקסית (איור 3A), ועד 16 אשכולות טיפות לבדיקה מבוססת משרעת מרובעת (איור 3B).

לאחר הקצאת אשכולות וספים, ניתן לקרוא נתוני כימות עבור כל יעד בצורה של עותקים/μL בחלון נתוני הבאר בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה החיצונית. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להעריך את מספר העותקים של המטרות במדגם הפותח. לדוגמה, אם נעשה שימוש ב-2.2 μL של הדגימה בנפח סופי של 22 μL, והתוכנה רשמה 30.5 עותקים/μL עבור ORF1ab, היו 30.5 x 22 = 671 עותקים של ORF1ab במיקס ה-PCR. המיקס הכיל 2.2 μL של הדגימה המקורית, ומכאן שהיו 671 עותקים של ORF1ab במדגם ההתחלתי, ו-671/2.2 = 305 עותקים/μL של ORF1ab במדגם המקורי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את הריכוז של כל מטרה בכל הבדיקות.

יעד רצף 5' עד 3' צבע בדיקה (ים) אורך המוצר (bp) Ref
ORF1ab קדימה CCCTGTGGGTT
TTACACTTAA		 5'- FAM ו- BHQ1-3'
5'- HEX ו- BHQ1-3'		 119 [16]
הפוך ACGATTGTGCAT
CAGCTGA
בדיקה CCGTCTGCGGT
ATGTGGAAAGG
TTATGG
N קדימה GGGGAACTTCTC
CTGCTAGAAT		 5'- FAM ו- BHQ1-3'
5'- HEX ו- BHQ1-3'		 99 [16]
הפוך CAGACATTTTTGC
TCTCAAGCTG
בדיקה TTGCTGCTGCT
TGACAGATT
RPP30 קדימה AGTGCATGCTTA
TCTCTGACAG		 5'- HEX ו- BHQ1-3' 87 [8]
הפוך GCAGGGCTATAG
ACAAGTTCA
בדיקה TTTCCTGTGAAG
GCG ATTGACCGA
RBD2 קדימה CTCAAGTGTCT
GTGGATCACG		 5'- FAM ו- BHQ1-3' 121 [17]
הפוך CCTGTGCCTGT
TAAACCATTG
בדיקה ACAGCATCAGT
AGTGTCAGCAA
TGTCTC

טבלה 1: רצפי פריימר וגשושית המשמשים לפיתוח מבחני SARS-CoV-2 השונים.

ריכוז סופי של פריימר-בדיקה לבדיקה בננומטרa
יעד פריימר/בדיקה סימפלקסב דופלקסג' תערובת בדיקה טריפלקסd משרעת Fourplexe
ORF1ab ORF1ab F 800
ORF1ab R 800
ORF1ab FAM
ORF1ab הקסדצימלי 250
N נ פ 800 800 800
נ ר 800 800 800
N FAM 250 125 250
N הקסדצימלי 125
RPP30 RPP30 פ 800 800 800 800
RPP30 R 800 800 800 800
RPP30 FAM
RPP30 הקסדצימאלי 250 250 250 125
RBD2 RBD2 ו 800 800 800
RBD2 R 800 800 800
RBD2 FAM 250 250 125
RBD2 הקסדצימלי
א בכל הבדיקות, ניתן להחליף את המטרות בהתאם להעדפת המשתמשים. המטרות המשמשות הן למטרות הדגמה של ניסוי זה.
b ניתן לזהות רק מטרה אחת בכל פעם בבדיקה החד-צדדית בערוץ FAM או HEX. RBD2 משמש להדגמת תוצאות ערוץ FAM ואילו RPP30 משמש לערוץ HEX.
c ניתן לזהות שתי מטרות בכל פעם בבדיקת דופלקס בערוץ FAM ו- HEX.
d ניתן לאתר שלוש מטרות באמצעות שני הערוצים, כלומר יעד 1 יזוהה ב- FAM (ריכוז בדיקה 1×), יעד שני ב- HEX (ריכוז בדיקה 1×), ויעד 3 בשני הערוצים (תערובת של 0.5× HEX ו- 0.5× רכזי בדיקה FAM המהווים את 1× הסופי).
e בכל ערוץ מתגלות שתי מטרות (FAM ו-HEX) עם ריכוז בדיקה של 1× ו-O.5× בכל ערוץ.

טבלה 2: ריכוז סופי של זוגות פריימר ובדיקה שונים בכל בדיקה.

Figure 1
איור 1: עיבוד דגימות וזרימת עבודה של PCR דיגיטלי טיפתי. (A) זרימת העבודה של עיבוד הדגימות כוללת איסוף דגימות והעברתן למתקן BSL-2, אי-הפעלה, חילוץ ויצירת cDNA. (B) תהליך העבודה של ה-PCR הדיגיטלי של הטיפות מתחיל בהכנת תערובת המאסטר, טעינת תערובת המאסטר לתוך צלחת ddPCR והוספת דגימות, יצירת טיפות, הגברת מטרות בתוך טיפות באמצעות PCR, ולבסוף קריאת הטיפות המוגברות באמצעות קורא טיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות בדיקה חד-צדדית ודו-צדדית, כולל מיטוב טמפרטורת חישול. (A) תוצאות בדיקה חד-צדדית כאשר מטרה יחידה (RBD2) סומנה בתווית FAM. (B) תוצאות בדיקה חד-צדדית כאשר מטרה יחידה (RPP30) סומנה בתווית HEX. (C) תוצאת בדיקה דו-צדדית של שתי מטרות בערוצים 1D ו-2D (iii) לאחר ש-N (i) סומן ב-FAM ו-RPP30 (ii) סומן ב-HEX. (D) תוצאות שיפוע טמפרטורת חישול (65° צלזיוס עד 55° צלזיוס) של בדיקת דופלקס המסומנת ב- ORF1ab (FAM) ו- RPP30 (HEX). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות בדיקת Triplex probe mix ו-quadruplex translitude-based multiplex assay. (A) תוצאות בדיקת תערובת בדיקה משולשת כאשר שלוש מטרות סומנו ביחסים הבאים של FAM:HEX; RBD2 (1:0), N (0.5:0.5) ו-RPP30 (0:1). (B) תוצאות בדיקה מבוססות משרעת Quadruplex לאחר שארבעה יעדים סומנו ביחסים הבאים של FAM:HEX; RBD2 (0.5:0), N (1:0), RPP30 (0:0.5) ו- ORF1ab (0:1). 1 ו-0.5 הם ריכוזי בדיקה של 250 ננומטר ו-125 ננומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: יצירת טיפות באמצעות מחולל טיפות אוטומטי. (A) חומרים מתכלים הדרושים להגדרת AutoDG. (B) במסך המגע AutoDG, גע באפשרות Configure Sample Plate ובחר עמודות שבהן הדגימות ממוקמות בלוח הדגימה ולחץ על OK. (C) לאחר שנבחר, המסך הופך לצהוב ומציין היכן יש לטעון חומרים מתכלים. (ד) פתח את דלת AutoDG וטען חומרים מתכלים במקומות המתאימים. טען חומרים מתכלים מאחור ועובד לכיוון הקדמי. ודא שבכל פעם שמתווסף חומר מתכלה, האור הופך מצהוב לירוק במיקום זה. (ה) יש לוודא שסוג השמן המשמש הוא שמן לבדיקה. (F) סגור את דלת AutoDG וודא שכל הריאגנטים מוגדרים במקומם על ידי בדיקה אם מסך המגע של AutoDG ירוק. (G) לחץ על START Droplet Generation כדי ליצור טיפות. (H) לאחר השלמת יצירת הטיפות, פתח את AutoDG והסר את לוח הטיפה. (I) אטמו את לוחית הטיפות באמצעות אטם חום הניתן לניקוב בנייר כסף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 2: שלבים לניתוח תוצאות בדיקת ddPCR מולטיפלקס מבוססת משרעת באמצעות תוכנה חיצונית. (א) התקן את התוכנה החיצונית במחשב. (B) פתח את קובץ ה- .qlp על ידי לחיצה ימנית עליו ובחירה באפשרות פתח עם התוכנה החיצונית המותקנת או פתיחת התוכנה החיצונית ולחיצה על אפשרות עיון כדי לאתר את הקובץ בתיקיה שלך. לחלופין, ניתן לגרור את קובץ ה- .qlp ולשחרר אותו את התוכנה החיצונית הפתוחה כדי לפתוח אותו. (C) לאחר הפתיחה, בצד ימין של הכרטיסייה Plate Editor , בחר probe mix triplex מהתפריט הנפתח והקצה פרטי יעד בהתאם, ולחץ על החל. (D) בצד שמאל של כרטיסיית המשרעת הדו-ממדית, השתמשו בכלי הגרפים כדי להקצות צבעים ספציפיים למטרות שונות לצורך זיהוי וכימות. לאחר זיהוי יעדי אשכול טיפות, ניתן לראות את תוצאות הכימות בחלון נתוני באר באותה כרטיסיית משרעת דו-ממדית. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תרשים משלים 3: שלבים לניתוח תוצאות בדיקת ddPCR מבוססת משרעת באמצעות תוכנה חיצונית. (א) התקן את התוכנה החיצונית במחשב. (B) פתח את קובץ ה- .qlp על ידי לחיצה ימנית עליו ובחירה באפשרות פתח עם התוכנה החיצונית המותקנת, או פתיחת התוכנה החיצונית ולחיצה על אפשרות עיון כדי לאתר את הקובץ בתיקיה שלך. לחלופין, ניתן לגרור את קובץ ה- .qlp ולשחרר אותו בתוכנה החיצונית שכבר פתוחה כדי לפתוח אותו. (C) לאחר הפתיחה, בצד ימין של הכרטיסייה Plate Editor , בחר מרבב משרעת מהתפריט הנפתח והקצה פרטי יעד בהתאם, ולחץ על החל. (D) בצד שמאל של כרטיסיית המשרעת הדו-ממדית, השתמשו בכלי הגרפים כדי להקצות צבעים ספציפיים למטרות שונות לצורך זיהוי וכימות. לאחר זיהוי יעדי אשכול טיפות, ניתן לראות את תוצאות הכימות בחלון נתוני באר באותה כרטיסיית משרעת דו-ממדית. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מעט משאבים זמינים כיצד לפתח מבחני RT-ddPCR לזיהוי SARS-CoV-2. למרות שלא נעשה שימוש במאמר זה, ניתן להשתמש בדוגמאות סטנדרטיות עם עותקים ידועים כדי לפתח ולמטב מבחנים. עם זאת, בעבודה זו, דגימות SARS-CoV-2 שגדלו בתאי Vero-E6 הוקפצו על רקע של RNA גנומי אנושי ושימשו כדגימות סטנדרטיות לפיתוח הבדיקות. רצפי פריימר ובדיקה נכונים חיוניים בעת פיתוח מבחנים. מכיוון שרוב העבודה הראשונית על SARS-CoV-2 RT-ddPCR השתמשה בפריימר ובבדיקות של ה-CDC בסין המכוונות לגן ORF1ab ו-N, הם מצאו אותם מתאימים להיכלל בעבודה זו 7,8,9,10,11. הספציפיות האנליטית והרגישות של פריימרים אלה הושוו גם באמצעות ddPCR בעבודה הקודמת7. פריימרים RBD2 ובדיקה13 פותחו בתוך החברה ונמצאו מתאימים RT-ddPCR. מכיוון שהבדיקות עשויות לשמש ליישומים שונים, כולל אבחון, הגן האנושי הספציפי ריבונוקלאז P תת-יחידה p30 (RPP30) נכלל בכל בדיקות המולטיפלקס. גנים אלה יכולים לשמש כבקרה אנדוגנית אנושית לניסויים באבחון. עם זאת, במקרה של דגימה סביבתית או מחקר אחר שאינו זקוק לגן הייחוס האנושי, ניתן להחליף מטרה זו עם מטרה אחרת של SARS-CoV-2.

בכל הבדיקות, חשוב לכלול בקרות לאימות בדיקות ונתוני ניסוי. בקרות אלה עשויות לכלול: NTC (מים נטולי נוקלאז כמדגם) כדי לסייע בקביעת ערכי סף ואיתור אשכול טיפות שלילי; בקרה חיובית (דגימה עם כל מטרות SARS-CoV-2, כולל גן ייחוס אנושי) להערכת כשל מגיב, שלמות פריימר ובדיקה, וזיהוי / מיקום משמעותי של שעתוק לאחור של מטרות טיפות חיוביות; ובקרות מיצוי (דגימות אנושיות מאוגמות ממתנדבים בריאים או סך כל חומצת הגרעין המופקת מתא אנושי בתרבית לא זיהומית) כדי לזהות כישלון או הצלחה בשלב המיצוי.

לרוב מערכות ה-ddPCR, כולל מערכת QX200, יש טווח דינמי צר בין 1 ל-120,000 עותקים/20 מיקרוליטר תגובה. בעת איתור דגימות לא ידועות, ריכוז המטרה במדגם ההתחלתי אינו ידוע לעתים קרובות וזה עשוי להציב אתגרים בעת כימות דגימות מרוכזות מאוד. כדי להתגבר על כך, מומלץ שכאשר מכמתים דגימות החשודות כמכילות כמויות גבוהות של מולקולות מטרה (כגון תרבית תאים), יש לתכנן להקטין את הדגימה ההתחלתית בהתאם. במקרה בו מספר העתק המטרה/גנום אינו ידוע, יש לקבוע את כמות ההתחלה האופטימלית באמצעות סדרה של דילול סדרתי פי ארבעה של כל דגימה בטווח הדיגיטלי הצפוי. על ידי ציון ארבע נקודות אלה, מובטח כי אחת מנקודות הנתונים נמצאת בטווח הדיגיטלי האופטימלי.

שימוש בפריימר גבוה ובריכוז בדיקה נמוך הוא תנאי הכרחי לרוב ניסויי ה-ddPCR החד-צדדיים והדו-צדדיים. הבדל זה בריכוז מגדיל את מרחק הפרדת המשרעת בין צבירי הטיפות החיוביות והשליליות, ובכך מקל על ניתוח הנתונים. עם זאת, בעת פיתוח מבחני מולטיפלקס מסדר גבוה יותר, שינויים בריכוזים אלה עשויים להוביל לשינויים במיקום של מטרות טיפות חיוביות כפי שניתן לראות באיור 3 ו-4. כתוצאה מכך, אפשרות אחת לאופטימיזציה של הבדיקה מלבד טמפרטורת החישול תהיה לשנות את פריימר המטרה או את ריכוז הגשושית כדי להבחין בין טיפות. תופעה זו שימשה והוסברה לפני14,15,16.

למרות ביצועי המבחן, עבודה זו היא זרימת עבודה דו-שלבית RT-ddPCR. שלב התמלול ההפוך הנוסף לפני ddPCR, נותן מקום לזיהום של דגימות. עם זאת, אם נעשה שימוש בטכניקות זהירות ונכונות לטיפול במדגמים, זה לא יהיה בעיה. באופן חיובי, DNA ידוע להיות יציב יותר מאשר RNA. המרת RNA ל-cDNA עשויה להאריך את חיי המדף של הדגימה במהלך האחסון בהשוואה ל-RNA. ניסוי RT-ddPCR דו-שלבי הוא גם זול יותר מניסוי RT-ddPCR חד-שלבי.

בהשוואה ל- RT-qPCR, RT-ddPCR יקר. לפיכך, יש לקחת בחשבון בעת ביצוע RT-ddPCR. לדוגמה, במהלך האבחון, ניתן להשתמש RT-ddPCR במקרה שבו הדגימות שלהם יש מטרות בשפע נמוך. עם זאת, קיימת אפשרות כי העלויות של מכשירי dPCR ריאגנטים ירדו בקרוב, ואת הטכניקה יהיה מותאם במעבדות רבות, כפי שקרה בעבר עם PCR רגיל qPCR. לפיכך, חשוב להגדיר פרוטוקולים כגון זה עבור משתמשים נוכחיים ועתידיים של dPCR. לסיכום, הבדיקות שפותחו נותנות מקום למשתמשים פוטנציאליים לשנות מטרות בהתאם ליישומים שלהם. ריבוב יבטיח שניתן יהיה לזהות ביעילות מטרות רבות בתוך דגימה אחת בתגובה אחת. עד כה, זה עשוי להיות הפרוטוקול הראשון שנותן פירוט מלא על אופן השימוש במערכת AutoDG, כולל התוכנה החיצונית בזיהוי SARS-CoV-2. עבודה נוספת על אופטימיזציה של הבדיקה עדיין צריכה להיעשות כדי להשיג הפרדה טובה יותר במבחן quadruplex. השימוש בתקנים יסייע גם לשפר את הבדיקות המפותחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי Megaproject of Infectious Disease Control ממשרד הבריאות של סין, מענק מספר 2017ZX10302301-005 ומרכז המחקר המשותף סין-אפריקה, מענק מספר SAJC201605.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 Genfine Biotech FHT101-32 Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes BioRad 12003017 QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates BioRad 12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) BioRad 1863024 Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges BioRad 1864108 QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot Beijing Changfeng Instrument and Meter Company XMTD-8000 Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit Genfine Biotech FMY502T5 Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals BioRad 1814040
Pipet Tips for the AutoDG BioRad 1864120 QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG BioRad 1864125 QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) TaKaRa RR036A cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer BioRad 1814000 Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software BioRad 10026368 Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0 BioRad N/A Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) BioRad 1864101 QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader BioRad 1864003 Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096 Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
  2. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
  3. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271 (2018).
  4. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
  5. Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
  6. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  7. Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
  8. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  9. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
  10. Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
  11. Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
  12. Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
  13. Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
  14. Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
  15. Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
  16. Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
  17. VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
  18. Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
  19. Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 169 סימפלקס דופלקס תערובת בדיקה טריפלקס quadruplex מבחנים SARS-CoV-2 RT-ddPCR זיהוי מולטיפלקס
פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nyaruaba, R., Li, X., Mwaliko, C.,… More

Nyaruaba, R., Li, X., Mwaliko, C., Li, C., Mwau, M., Odiwour, N., Muturi, E., Muema, C., Li, J., Yu, J., Wei, H. Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification. J. Vis. Exp. (169), e62295, doi:10.3791/62295 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter