Summary
Ce travail résume les étapes du développement de différents tests pour la détection du SARS-CoV-2 à l’aide d’un système ddPCR bicolore. Les étapes sont élaborées et des notes ont été incluses sur la façon d’améliorer les tests et les performances expérimentales. Ces tests peuvent être utilisés pour plusieurs applications SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
Le diagnostic de la pandémie actuelle de SRAS-CoV-2 est une priorité pour tous les pays du monde. Actuellement, la PCR quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) est l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2 car aucune solution permanente n’est disponible. Quelle que soit l’efficacité de cette technique, des recherches ont émergé montrant ses limites dans la détection et le diagnostic, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles peu abondantes. En revanche, il a été démontré que la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), une technologie émergente récente présentant des avantages supérieurs à la qPCR, permet de surmonter les défis de la RT-qPCR dans le diagnostic du SRAS-CoV-2 à partir d’échantillons cibles peu abondants. Prospectivement, dans cet article, les capacités de la RT-ddPCR sont encore étendues en montrant les étapes à suivre pour développer des tests simplex, duplex, triplex et quadruplex à l’aide d’un système de détection bicolore. En utilisant des amorces et des sondes ciblant des sites spécifiques du génome du SRAS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 et RBD2), le développement de ces tests s’avère possible. De plus, des protocoles détaillés, des notes et des suggestions étape par étape sur la façon d’améliorer le flux de travail des tests et d’analyser les données sont fournis. L’adaptation de ce flux de travail dans les travaux futurs garantira que le nombre maximal de cibles peut être détecté de manière sensible dans un petit échantillon, ce qui améliorera considérablement le coût et le débit de l’échantillon.
Introduction
La réaction en chaîne de la polymérase (PCR), une technique bien reconnue, a subi plusieurs transformations depuis son avènement pour devenir une technique puissante capable d’apporter des réponses à la recherche sur les acides nucléiques. Ces transformations ont été une amélioration constante de l’ancienne technique. Ces transformations peuvent se résumer en trois générations1. La première génération est la PCR conventionnelle qui repose sur l’électrophorèse sur gel pour quantifier et détecter les cibles amplifiées. La deuxième génération est la PCR quantitative en temps réel (qPCR) qui peut détecter des échantillons en temps réel et s’appuyer sur une courbe standard pour quantifier directement les cibles d’un échantillon. La troisième génération, la PCR numérique (dPCR), peut effectuer à la fois la détection et la quantification absolue de cibles d’acides nucléiques sans avoir besoin d’une courbe standard. La dPCR a également été améliorée par le fait que les chambres de réaction sont séparées par les puits d’un mur en émulsions d’huile, d’eau et de produits chimiques stabilisateurs dans le même puits, comme on le voit dans la PCR numérique2 à base de gouttelettes. Dans la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), un échantillon est divisé en milliers de gouttelettes de la taille d’un nanolitre contenant des cibles individuelles qui seront ensuite quantifiées à l’aide des statistiques de Poisson 2,3,4. Cette technique donne à la ddPCR un avantage dans la quantification des cibles peu abondantes par rapport aux autres générations de PCR.
Récemment, de multiples applications ont mis en évidence la supériorité de la ddPCR par rapport à la qPCR couramment utilisée lors de la détection et de la quantification de cibles faiblement abondantes 1,5,6. Le SARS-CoV-2 ne fait pas exception à ces applications 7,8,9,10,11,12. Depuis l’épidémie de SRAS-CoV-2, les scientifiques ont travaillé sur tous les fronts pour trouver des solutions sur la façon de diagnostiquer le virus et de le détecter efficacement. L’étalon-or actuel reste à être qPCR13. Cependant, la RT-ddPCR s’est avérée plus précise dans la détection de cibles SARS-CoV-2 peu abondantes à partir d’échantillons environnementaux et cliniques par rapport àla RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La plupart des travaux publiés sur la ddPCR du SARS-CoV-2 dépendent de tests simplex, les tests multiplex dépendant de tests commerciaux. Par conséquent, il faudrait faire davantage pour expliquer comment développer des tests RT-dPCR multiplex pour la détection du SRAS-CoV-2.
Dans une conception de test appropriée, le multiplexage peut être utilisé pour économiser sur les coûts, augmenter le débit de l’échantillon et maximiser le nombre de cibles pouvant être détectées de manière sensible dans un petit échantillon. Lors du multiplexage avec ddPCR, il faut tenir compte du nombre de fluorophores pouvant être détectés dans un système particulier. Certaines plates-formes ddPCR peuvent prendre en charge jusqu’à trois canaux tandis que d’autres ne prennent en charge que deux canaux. Par conséquent, lors du multiplexage avec deux canaux, il faut utiliser différentes approches, y compris le multiplexage d’ordre supérieur pour détecter plus de deux cibles14,15,16. Dans ce travail, un système de détection ddPCR bicolore est utilisé pour montrer les étapes à suivre pour développer différents tests SARS-CoV-2 RT-ddPCR qui peuvent être adaptés à différentes applications de recherche.
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Protocol
Déclaration éthique
L’Institut de virologie de Wuhan (WHIOV) fait partie des laboratoires et instituts approuvés par le CDC chinois de la ville de Wuhan pour mener des recherches sur le SRAS-CoV-2 et détecter la COVID-19 à partir d’échantillons cliniques. La recherche sur le développement de nouvelles techniques de diagnostic de la COVID-19 à l’aide d’échantillons cliniques a également été approuvée par le comité d’éthique de l’Institut de virologie de Wuhan (2020FCA001).
1. Flux de travail de traitement des échantillons (Figure 1A)
REMARQUE : Tout au long du protocole, il est important d’utiliser des salles séparées avec des pipettes dédiées pour la manipulation des échantillons (extraction et stockage), la préparation et l’entreposage des réactifs/mélanges maîtres, la préparation du mélange réactionnel (échantillon plus mélange maître) et la détection, afin d’éviter la contamination croisée. Les tests à développer peuvent être utilisés dans la détection d’échantillons cliniques ou d’échantillons de recherche. Tous les échantillons doivent être traités comme s’ils pouvaient transmettre des agents infectieux, même en utilisant des procédures de laboratoire sécuritaires. Les étapes de traitement des échantillons doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) en suivant les règles strictes de la BSL-2, y compris le port d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
- Inactivation de l’échantillon
- Prélever 1 mL d’échantillon de SRAS-CoV-2 dans un laboratoire BSL-2. Inactiver thermiquement les échantillons à 65 °C pendant 30 min.
REMARQUE: Les échantillons peuvent provenir de diverses sources, par conséquent, il faut s’assurer que le volume à inactiver est suffisant pour assurer l’extraction ultérieure de l’ARN. La plupart des trousses d’extraction nécessitent un petit volume d’échantillon allant jusqu’à 200 μL, par conséquent, un volume d’échantillon d’environ 1 mL serait suffisant pour l’inactivation. Les tensioactifs, les kits et les tampons de lyse peuvent également être utilisés pour l’inactivation directe et l’extraction d’ARN selon les propres SOP du laboratoire. - Prélever les échantillons dans une enceinte de biosécurité (ESB) et les laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre aux aérosols potentiels de se déposer. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à 24 heures s’ils ne sont pas traités immédiatement.
REMARQUE : Aucun contenant spécifique n’est requis pour le stockage des échantillons. Les échantillons peuvent être conservés dans les tubes ou contenants utilisés pendant l’inactivation. Pour ce travail, la plupart des échantillons ont été stockés dans des tubes de milieu de transport viral (VTM) ou des tubes de 1,5 mL.
- Prélever 1 mL d’échantillon de SRAS-CoV-2 dans un laboratoire BSL-2. Inactiver thermiquement les échantillons à 65 °C pendant 30 min.
- Extraction d’ARN
REMARQUE: De nombreux instruments et kits d’extraction d’ARN avec des protocoles spécifiques sont disponibles pour une utilisation immédiate. Ici, une procédure automatisée suivant les instructions du fabricant est présentée.- Retirez la plaque d’orifice de puits de 96 profondeurs préremplie; Inversez-le doucement à l’envers pour mélanger les billes magnétiques. Après avoir mélangé, agiter doucement la plaque sur une surface plane pour concentrer le réactif et les billes magnétiques qui peuvent se trouver sur la paroi jusqu’au fond de la plaque.
- Déchirez soigneusement le film d’étanchéité en feuille d’aluminium pour éviter les vibrations de la plaque et le déversement de liquide. Ajouter 20 μL de protéinase K et 200 μL de l’échantillon par puits dans les rangées 2 et 8 de la plaque de 96 puits. Ensuite, placez la plaque de 96 puits sur la base de l’instrument d’extraction automatique d’acide nucléique à 32 canaux.
Remarque : Exécutez le programme sur l’ordinateur dans les 1 h suivant l’ajout de l’exemple. - Insérez le manchon de barre magnétique dans la fente pour carte de l’instrument d’extraction automatique d’acide nucléique à 32 canaux. Sélectionnez le programme GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (version rapide) et exécutez-le.
- Une fois l’extraction terminée, prélever les échantillons d’acides nucléiques dans les rangées 6 et 12 (environ 100 μL/échantillon) et les répartir dans une plaque propre sans nucléase de 96 puits. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à 24 heures jusqu’à utilisation ou à -20 °C pendant une période plus longue.
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une pipette multicanal de 100 μL pour transférer les échantillons dans une nouvelle plaque de 100 à 200 μL, car elle peut correspondre directement aux colonnes de la plaque d’échantillonnage.
- Génération d’ADNc
REMARQUE : Pour les échantillons conservés pendant une longue période, évitez les cycles de congélation ou de décongélation multiples. Effectuer la génération d’ADNc à l’aide d’un kit d’ADNc en suivant les instructions du fabricant.- Dans un tube de PCR de 100 ou 200 μL placé sur un bloc de glace ou de refroidissement, ajouter 2 μL de 5x mélange maître RT (p. ex., Perfect Real Time), 5 μL d’ARN échantillon et 3 μL de ddH2O libre de RNase par réaction (volume total de 10 μL).
- Placez le tube de PCR dans un thermocycleur réglé pour fonctionner à 37 °C pendant 15 min (transcription inverse), 85 °C pendant 5 s (inactivation thermique de la transcriptase inverse) et 4 °C pendant une durée infinie.
REMARQUE : Traiter les échantillons immédiatement ou conserver à 4 °C jusqu’à 24 heures jusqu’à utilisation ou à -20 °C jusqu’à 6 mois.
2. Optimisation du test et du flux de travail ddPCR
REMARQUE: Optimisez les tests avant/après la lecture des gouttelettes. En fonction des résultats, ils peuvent être optimisés à tout moment du travail pour obtenir de meilleurs résultats. Vous trouverez ci-dessous quelques facteurs courants à prendre en compte lors de l’optimisation des expériences de ddPCR.
- Validez les amorces et les sondes ddPCR (Tableau 1).
NOTE: Les amorces ORF1ab et N ont été adaptées de China CDC17, le gène de contrôle endogène humain (RPP30) de Lu et al.18, et RBD2 de Nyaruaba et al.13. Toutes les amorces et sondes à l’exception de RBD2 avaient déjà été testées et optimiséespar ddPCR 7,8,18. - Exécutez les contrôles d’échantillon de test ddPCR comprenant un contrôle positif (un échantillon avec les quatre cibles), un contrôle sans modèle (NTC; Eau exempte de nucléases ou échantillon sans cibles) et extraction/contrôle négatif (acide nucléique total extrait d’une cellule humaine cultivée non infectieuse ou d’échantillons groupés de volontaires en santé).
REMARQUE : Les échantillons témoins standard avec des copies connues des gènes cibles sont préférés. Cependant, en l’absence de normes, utiliser les échantillons disponibles pour définir leurs contrôles ou leur matrice d’échantillonnage. Exécutez les contrôles avec les échantillons de test. - Optimiser la température de recuit (Figure 2D) en insérant un gradient de température de 55 °C à 65 °C dans l’étape de recuit de la PCR (étape 3.2).
REMARQUE: L’optimisation de la température de recuit aide à trouver la meilleure température où la séparation des gouttelettes est maximale (identification facile de la cible) avec un minimum de pluie. Après avoir obtenu les résultats, réduisez la plage de température pour une meilleure optimisation, par exemple 55 °C à 60 °C. - Optimiser les concentrations de l’amorce et de la sonde. Si la séparation optimale entre les gouttelettes positives et négatives n’est pas obtenue dans les essais, faire varier les concentrations de l’amorce (300-900 nM) et/ou de la sonde (100-400 nM).
REMARQUE: L’abaissement des concentrations d’amorce / sonde entraîne une amplitude de gouttelettes cible plus faible et son augmentation augmente également l’amplitude de la cible. Cela peut être utile dans le multiplexage basé sur l’amplitude. - Testez la sensibilité analytique en tenant compte de différents paramètres, y compris la limite de blanc (LoB), la limite de détection (LoD), la spécificité et la sensibilité en utilisant des échantillons standard et d’essai, selon vos préférences.
3. Flux de travail ddPCR (Figure 1B) et développement de tests (Tableau 2)
REMARQUE : Comme d’autres systèmes de détection ddPCR, ce flux de travail comprend également quatre étapes (Figure 1B), notamment la préparation du mélange réactionnel, la génération de gouttelettes, l’amplification par PCR et la lecture des gouttelettes.
- Préparation du mélange réactionnel
REMARQUE : Préparez tous les tests dans une pièce propre et séparée et à l’intérieur d’une ESB. Observez les précautions standard, y compris l’utilisation de gants propres, de pipettes propres, d’eau sans nucléase et de désinfectants. Les réactifs aliquotes sont stockés dans des tubes séparés et stockés à -20 °C pour éviter les cycles répétés de décongélation par le gel. Préparer les dosages comme indiqué dans le tableau 2. Les solutions mères d’apprêt et de sonde doivent être conservées à des concentrations élevées de 100 μM. Les solutions de travail peuvent être stockées dans des aliquotes de 20 à 40 μM (diluées dans de l’eau sans nucléase).- Étapes communes à tous les tests
REMARQUE : Avant de préparer les essais, calculez le volume total de mastermix nécessaire en fonction du nombre d’échantillons. Ici, chaque volume de composant mastermix a été multiplié par 1,05 pour tenir compte des erreurs de pipetage.- Décongeler et équilibrer les matériaux de réaction à température ambiante. Vortex brièvement (30 s) des composants de réaction pour assurer l’homogénéité, et centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube.
- Préparer un mélange amorce-sonde (PP) par essai en mélangeant des volumes de réaction spécifiques comme indiqué dans le tableau 2 à partir des solutions de travail.
- Préparer le mélange maître en mélangeant 11 μL (1x) de 2x supermix ddPCR pour sondes (sans dUTP), mélange PP (selon le dosage comme indiqué dans le tableau 2 de la solution de travail) et eau exempte de nucléases jusqu’à un volume final de 19,8 μL par puits. Répartir le mélange maître dans les puits d’une plaque de ddPCR de 96 puits exempte de nucléases en fonction du nombre d’échantillons.
REMARQUE: Pour la plaque d’échantillonnage, assurez-vous que les 8 puits d’une colonne ont la solution. Si seulement quelques puits sont utilisés, par exemple 5 échantillons, remplissez les 3 autres puits avec 22 μL d’eau exempte de nucléases ou de tampon de contrôle chacun. - Pour obtenir le volume final du mélange réactionnel (22 μL), ajouter 2,2 μL d’échantillon d’ADNc par puits contenant le mélange maître. Scellez la plaque avec un scellant de plaque PCR jetable.
Remarque : Effectuez les ajouts d’échantillons dans la salle désignée. Inclure les contrôles, c.-à-d. positif, NTC et extraction. De plus, si les échantillons d’ARN sont de faible concentration, réduire le volume d’eau dans le mélange principal et augmenter le volume de l’échantillon en conséquence jusqu’à 5,5 uL. - Une fois le mélange réactionnel réparti par puits, vortex brièvement (15-30 s) et centrifuger (10-15 s) pour recueillir le contenu au fond de la plaque. Procéder à la génération de gouttelettes.
- Étapes communes à tous les tests
- Production automatisée de gouttelettes (figure supplémentaire 1)
REMARQUE: Différents générateurs de gouttelettes peuvent être utilisés; cependant, cette étude a été réalisée avec un générateur de gouttelettes automatisé (AutoDG). Pour éviter la contamination par amplicon, assurez-vous que le générateur de gouttelettes et les lecteurs disposent d’un espace dédié dans des zones séparées. Lors du chargement des consommables, il est recommandé de commencer le chargement à partir de l’arrière de l’instrument en travaillant vers l’avant pour éviter de déplacer les mains sur les consommables afin d’éviter la contamination croisée.- Procurez-vous tous les consommables nécessaires à la configuration de l’AutoDG, y compris l’huile AutoDG pour les sondes, les cartouches DG32, les pointes de pipettes, le bloc de refroidissement, la plaque d’échantillonnage, la plaque de gouttelettes (nouvelle plaque ddPCR propre) et une poubelle.
- Sur l’écran tactile AutoDG, appuyez sur Configurer la plaque d’échantillonnage, sélectionnez les colonnes où se trouvent les échantillons sur la plaque d’échantillonnage, puis appuyez sur OK.
REMARQUE: L’écran devient jaune indiquant LOAD où les consommables doivent être chargés. - Ouvrez la porte AutoDG et chargez les consommables à leur place respective.
REMARQUE: Les endroits respectifs où les consommables doivent être chargés auront un indicateur jaune qui deviendra vert plus tard si les consommables sont chargés. Ceci est similaire à l’écran tactile. - Chargez la plaque d’échantillonnage et la plaque de génération de gouttelettes.
REMARQUE: La plaque de génération de gouttelettes doit être placée sur le bloc de refroidissement. Assurez-vous que le bloc de refroidissement est violet (prêt à l’emploi) et non rose (doit être conservé dans un congélateur jusqu’à ce que la couleur redevienne violette). - Fermez le capot AutoDG, assurez-vous que l’écran est vert (consommables chargés) et sélectionnez/assurez-vous que le type d’huile est Huile pour sondes avant d’appuyer sur Start Droplet Generation (Démarrer la génération de gouttelettes).
- Attendez que les gouttelettes soient générées. Ouvrez la porte une fois que l’écran affiche Droplets Ready et retirez la plaque contenant les gouttelettes.
- Sceller la plaque à l’aide d’une feuille perforable à l’aide d’un scellant à plaques réglé à 185 °C pendant 5 s. Passez à l’amplification par PCR.
REMARQUE: L’amplification PCR doit être démarrée dans les 30 minutes suivant la génération de gouttelettes.
- Amplification par PCR
- Insérez la plaque de gouttelettes scellée dans un cycleur thermique à puits de 96 profondeurs, réglez le volume de l’échantillon à 40 μL et la température du couvercle à 105 °C.
- La PCR amplifie les gouttelettes à l’aide du programme : 95 °C pendant 10 min (activation enzymatique), 40 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s et 1 min de recuit/extension à 57 °C, désactivation enzymatique à 98 °C pendant 10 min, et pas de maintien à 4 °C indéfiniment. Après la PCR, lire les gouttelettes ou conserver à 4 °C jusqu’à 24 h.
NOTE: Utilisez une vitesse de rampe de 2 °C / s à toutes les étapes, car les vitesses de rampe peuvent différer pour différents thermocycleurs. Maintenir la plaque pendant au moins 30 minutes à 4 °C pour permettre la stabilisation des gouttelettes avant de lire les gouttelettes.
- Lecture de gouttelettes
- Transférez la plaque à 96 puits à cycle thermique dans un lecteur de gouttelettes et, sur un ordinateur connecté au lecteur de gouttelettes, ouvrez / démarrez le logiciel d’accompagnement.
- En mode de configuration, sélectionnez Nouveau , puis double-cliquez sur n’importe quel puits pour ouvrir la boîte de dialogue Éditeur de puits . Sélectionnez les puits à lire et choisissez Experiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix for Probes (no dUTP), Target 1 Type: Ch1 Unknown, Target 2 Type: Ch2 Unknown.
REMARQUE : Les options négatives, blanches, NTC ou positives peuvent être sélectionnées dans le menu déroulant du type cible 1/2 pour les échantillons de contrôle. - Attribuez les noms de la cible ou de l’échantillon en fonction de la disposition de la plaque et sélectionnez Appliquer. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez OK et enregistrez le modèle créé. Cliquez sur Exécuter et, lorsque vous y êtes invité, choisissez la bonne couleur (FAM/HEX).
REMARQUE: Il est recommandé d’amorcer le système avant l’exécution avant la première exécution de la journée. Vérifiez également si tous les voyants du lecteur sont verts et, si ce n’est pas le cas, suivez l’application recommandée sur l’état de l’info-bulle. - Une fois l’acquisition des données terminée, retirez la plaque du lecteur. Analyser les données au besoin.
REMARQUE: Étant donné que les résultats préliminaires peuvent être vus à l’écran, l’exécution des échantillons positifs dans les premiers puits peut être utilisée pour le contrôle de la qualité en temps réel.
4. Analyse des données (figures supplémentaires 2 et 3)
- Vérifiez les données de tous les puits pour le nombre total de gouttelettes. Si le nombre de gouttelettes est de 10 000 <, ignorez les résultats et répétez le test. Définissez une limite pour accepter les résultats positifs et négatifs. Par exemple, un nombre de gouttelettes allant jusqu’à 3 gouttelettes positives ou plus peut être considéré comme le seuil pour des résultats positifs.
REMARQUE: Les données de tous les tests, y compris les tests simplex, duplex, triplex et quadruplex, sont générées à l’aide du logiciel associé. Cependant, ce logiciel ne convient que pour les tests simplex et duplex. Pour les tests multiplex d’ordre élevé (cibles >3), un logiciel externe est nécessaire. - Tests Simplex et duplex
REMARQUE: Le logiciel externe peut également analyser les données recto et duplex. Cependant, l’utilisation du logiciel d’accompagnement est plus facile pour ces tests, donc utilisé dans cet article.- Double-cliquez sur le fichier .qlp à analyser pour l’ouvrir et sélectionnez Analyser.
- Utilisez les outils de seuil de l’amplitude 1D et de l’amplitude 2D pour distinguer les gouttelettes positives et négatives pour chaque puits dans le bon canal. Les échantillons NTC et les échantillons témoins positifs peuvent être utilisés comme guide pour l’établissement du seuil.
REMARQUE: Les résultats FAM sont visibles dans le canal 1 tandis que HEX/VIC dans le canal 2. - Après la définition du seuil, les résultats peuvent être exportés sous forme de fichier .csv et analysés dans Excel ou enregistrés en lisant directement dans la fenêtre de résultats.
- Mélange de sondes Triplex (Figure supplémentaire 2) et Essais quadruplex (Figure supplémentaire 2)
REMARQUE: Avant d’analyser le mélange de sonde triplex et le test quadruplex, téléchargez le logiciel externe. Reportez-vous à la configuration minimale requise avant l’installation.- Ouvrez le fichier .qlp en cliquant dessus avec le bouton droit de la souris et en choisissant Ouvrir avec le logiciel externe, ou en ouvrant le logiciel externe et en cliquant sur l’option Parcourir pour localiser le fichier .qlp dans votre dossier, ou en faisant simplement glisser le fichier .qlp et en le déposant sur le logiciel externe déjà ouvert.
- Dans l’onglet éditeur de plaques, sélectionnez les puits à analyser sur le côté droit de l’onglet.
- Pour le mélange de sondes triplex, sélectionnez Quantification directe (DQ) comme type d’expérience, sélectionnez Probe Mix Triplex comme informations de test et entrez les noms des cibles en conséquence, puis cliquez sur Appliquer.
- Pour quadruplex, sélectionnez Quantification directe (DQ) comme type d’expérience, sélectionnez Amplitude Multiplex comme informations de test et entrez les noms des cibles en conséquence, puis cliquez sur Appliquer.
- Sur le côté gauche de l’onglet Amplitude 2D, utilisez les Outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différents clusters cibles en suivant les suggestions contextuelles de la fenêtre Sélectionner pour attribuer un cluster .
REMARQUE: Le mode de cluster préféré peut être appliqué en fonction des préférences des utilisateurs. - Une fois les couleurs cibles attribuées, les données de quantification peuvent être lues dans la fenêtre Données de puits en bas à droite. Exportez les données vers Excel/csv pour une analyse plus approfondie à l’aide de l’icône à triple barre située dans le coin supérieur droit du tableau de données du puits.
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Representative Results
Dans une étude de validation de principe, la performance analytique des tests multiplex a été testée sur des échantillons cliniques et de recherche19. La performance des tests multiplex était supérieure à celle d’une RT-PCR19. Étant donné qu’un faible nombre de gouttelettes peut indiquer un problème lors de la génération de gouttelettes, dans cet article, un seuil de 10 000 gouttelettes par puits a été fixé sur la base de données empiriques.
Une bonne séparation entre les gouttelettes positives et négatives avec un minimum d’interférences de pluie peut aider à l’analyse des données. Par conséquent, dans une bonne expérience, l’optimisation des essais est la clé19. Comme le montrent les résultats de l’analyse du gradient de température de la figure 2D, des températures de recuit élevées (p. ex. 65 °C) n’ont pas permis de distinguer clairement les gouttelettes positives des gouttelettes négatives lorsqu’un essai duplex (N (FAM) et RPP30 (HEX)) a été effectué. Cependant, avec une diminution de la température de recuit, une séparation optimale entre les gouttelettes positives et négatives a été obtenue. Une température de 57 °C a été jugée optimale. Cela peut également être observé dans d’autres dosages19.
À l’aide d’un système de détection RT-DDPCR bicolore (FAM/HEX), il est possible de détecter une cible SARS-CoV-2 (Figure 2A, B), deux (Figure 2C), trois (Figure 3A) et quatre (Figure 3B) dans un seul échantillon. Au cours de l’analyse des données, le logiciel d’accompagnement utilisé pour lire les gouttelettes ne peut analyser que les tests simplex et duplex comme illustré à la figure 2. Cela signifie que pour les essais multiplex d’ordre supérieur (cibles >3), un logiciel externe doit être utilisé pour l’analyse des données, comme le montrent les figures 3, S2 et S3. Il est également important de noter que le logiciel externe peut également être utilisé pour analyser les données recto et duplex. Pour les données simplex et recto verso, l’analyse est assez simple car les cibles sont séparées sous forme de gouttelettes positives ou négatives dans leurs canaux respectifs, comme le montre la figure 2. Un échantillon NTC peut aider à localiser les gouttelettes négatives qui peuvent à leur tour aider à définir des seuils pour l’analyse des données, comme le montre la figure 2A. Pour le test duplex, l’analyse peut être effectuée dans des canaux individuels (Figure 2B i,ii) ou dans l’amplitude 2D (Figure 2B iii).
Pour les essais multiplex d’ordre supérieur, l’analyse des données n’est pas simple et l’attention doit être concentrée sur l’affectation de cibles de gouttelettes. Après avoir installé le logiciel externe, sélectionnez les puits à analyser, sélectionnez le type d’expérience approprié et affectez des groupes cibles en fonction du type d’expérience, comme illustré aux figures S2 et S3. La fenêtre contextuelle Sélectionner pour attribuer un cluster vous guidera sur la façon d’attribuer des clusters dans les tests multiplex supérieurs. Utilisez les outils graphiques pour attribuer jusqu’à 8 grappes de gouttelettes pour le test de mélange de sonde triplex (Figure 3A) et jusqu’à 16 grappes de gouttelettes pour l’essai basé sur l’amplitude quadruplex (Figure 3B).
Après attribution des clusters et des seuils, les données de quantification pour chaque cible sous forme de copies/μL peuvent être lues dans la fenêtre de données du puits en bas à droite du logiciel externe. Ces données peuvent être utilisées pour estimer le nombre de copies des cibles dans l’échantillon de départ. Par exemple, si 2,2 μL de l’échantillon ont été utilisés dans un volume final de 22 μL et que le logiciel a enregistré 30,5 copies/μL pour ORF1ab, il y avait 30,5 x 22 = 671 copies d’ORF1ab dans le mélange PCR. Le mélange contenait 2,2 μL d’échantillon original, par conséquent, il y avait 671 copies d’ORF1ab dans l’échantillon de départ, et 671/2,2 = 305 copies/μL d’ORF1ab dans l’échantillon original. Cette méthode peut être utilisée pour estimer la concentration de chaque cible dans tous les essais.
| Cible | Séquence 5' à 3' | Colorant(s) de sonde | Longueur du produit (pb) | Ref | |
| ORF1ab | En avant | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM et BHQ1-3' 5'- HEX et BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Inverse | ACGATTGTGCAT L’ACGCTGA |
||||
| Sonde | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | En avant | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM et BHQ1-3' 5'- HEX et BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Inverse | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sonde | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | En avant | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX et BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Inverse | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sonde | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | En avant | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM et BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Inverse | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sonde | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA Le |
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Tableau 1 : Amorces et séquences de sondes utilisées pour développer les différents tests SARS-CoV-2.
| Concentration finale de l’amorce-sonde par essai en nMa | |||||
| Cible | Apprêt/sonde | Simplexb | Duplexc | Sonde triplex mixéed | Amplitude quadruplexe |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N MAF | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEX | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a Dans tous les essais, les cibles peuvent être échangées en fonction des préférences des utilisateurs. Les cibles utilisées sont à des fins de démonstration de cette expérience. | |||||
| b Une seule cible peut être détectée à la fois dans le test simplex dans le canal FAM ou HEX. RBD2 est utilisé pour démontrer les résultats du canal FAM tandis que RPP30 est utilisé pour le canal HEX. | |||||
| c Deux cibles peuvent être détectées à la fois dans le test duplex dans les canaux FAM et HEX. | |||||
| d Trois cibles peuvent être détectées à l’aide des deux canaux, c’est-à-dire que la cible 1 sera détectée dans la FAM (1× concentration de la sonde), la cible deux dans la concentration de la sonde HEX (1× concentration de la sonde) et la cible 3 dans les deux canaux (un mélange de 0,5× HEX et 0,5× concentratines de sonde FAM pour constituer la concentration finale de la sonde 1×). | |||||
| e Deux cibles sont détectées dans chaque canal (FAM et HEX) avec une concentration de sonde de 1× et O.5× dans chaque canal. | |||||
Tableau 2 : Concentration finale des différentes paires d’amorces et de sondes par essai.
Figure 1 : Traitement des échantillons et flux de travail de PCR numérique par gouttelettes. (A) Le flux de travail de traitement des échantillons comprend la collecte et le transport des échantillons vers une installation BSL-2, l’inactivation, l’extraction et la génération d’ADNc. (B) Le flux de travail de PCR numérique par gouttelettes commence par la préparation du mélange maître, le chargement du mélange principal dans une plaque ddPCR et l’ajout d’échantillons, la génération de gouttelettes, l’amplification des cibles à l’intérieur des gouttelettes par PCR et enfin la lecture des gouttelettes amplifiées à l’aide d’un lecteur de gouttelettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats des essais simplex et duplex, y compris l’optimisation de la température de recuit. (A) Résultats du test simplex lorsqu’une seule cible (RBD2) a été marquée FAM. (B) Résultats du test simplex lorsqu’une seule cible (RPP30) était marquée HEX. (C) Résultat du test duplex de deux cibles en 1D et 2D (iii) Canaux après que N (i) ait été marqué FAM et RPP30 (ii) a été marqué HEX. (D) Résultats du gradient de température de recuit (65 °C à 55 °C) d’un essai duplex marqué avec ORF1ab (FAM) et RPP30 (HEX). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats des essais de mélange de sondes Triplex et de multiplex à amplitude quadruplex. (A) Résultats de l’essai de mélange de sondes Triplex lorsque trois cibles ont été étiquetées avec les rapports FAM:HEX suivants; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) et RPP30 (0:1). (B) Résultats de l’essai basé sur l’amplitude quadruplex après que quatre cibles ont été étiquetées avec les ratios FAM:HEX suivants; RBD2 (0,5:0), N (1:0), RPP30 (0:0,5) et ORF1ab (0:1). 1 et 0,5 sont des concentrations de sonde de 250 nM et 125 nM, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Production de gouttelettes à l’aide d’un générateur de gouttelettes automatisé. (A) Consommables nécessaires à la configuration de l’AutoDG. (B) Sur l’écran tactile AutoDG, appuyez sur Configurer la plaque d’échantillonnage et sélectionnez les colonnes où se trouvent les échantillons sur la plaque d’échantillonnage , puis appuyez sur OK. (C) Une fois sélectionné, l’écran devient jaune indiquant où les consommables doivent être chargés. (D) Ouvrez la porte AutoDG et chargez les consommables aux endroits respectifs. Chargez les consommables de l’arrière en travaillant vers l’avant. Assurez-vous que chaque fois qu’un consommable est ajouté, la lumière passe du jaune au vert à cet endroit. (E) S’assurer que le type d’huile utilisé est de l’huile pour sondes. (F) Fermez le capot AutoDG et assurez-vous que tous les réactifs sont en place en vérifiant si l’écran tactile AutoDG est vert. (G) Appuyez sur START Droplet Generation pour générer des gouttelettes. (H) Une fois la génération de gouttelettes terminée, ouvrez l’AutoDG et retirez la plaque de gouttelettes. (I) Sceller la plaque de gouttelettes à l’aide d’un thermoscellage en feuille perforable. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Étapes de l’analyse des résultats du test ddPCR multiplex basé sur l’amplitude à l’aide d’un logiciel externe. (A) Installez le logiciel externe sur un ordinateur. (B) Ouvrez le fichier .qlp en cliquant dessus avec le bouton droit de la souris et en choisissant Ouvrir avec le logiciel externe installé ou en ouvrant le logiciel externe et en cliquant sur l’option Parcourir pour localiser le fichier dans votre dossier. Alternativement, on peut faire glisser le fichier .qlp et le déposer le logiciel externe ouvert pour l’ouvrir. (C) Une fois ouvert, sur le côté droit de l’onglet Éditeur de plaques , choisissez sonde mix triplex dans le menu déroulant et attribuez des informations sur la cible en conséquence, puis cliquez sur Appliquer. (D) Sur le côté gauche de l’onglet Amplitude 2D, utilisez les outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différentes cibles à des fins de détection et de quantification. Une fois les cibles des grappes de gouttelettes identifiées, les résultats de quantification peuvent être consultés dans la fenêtre Données de puits dans le même onglet d’amplitude 2D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Étapes de l’analyse des résultats du test ddPCR multiplex basé sur l’amplitude à l’aide d’un logiciel externe. (A) Installez le logiciel externe sur un ordinateur. (B) Ouvrez le fichier .qlp en cliquant dessus avec le bouton droit de la souris et en choisissant Ouvrir avec le logiciel externe installé, ou en ouvrant le logiciel externe et en cliquant sur l’option Parcourir pour localiser le fichier dans votre dossier. Alternativement, on peut faire glisser le fichier .qlp et le déposer dans le logiciel externe déjà ouvert pour l’ouvrir. (C) Une fois ouvert, sur le côté droit de l’onglet Plate Editor , choisissez le multiplex d’amplitude dans le menu déroulant et attribuez des informations sur la cible en conséquence, puis cliquez sur Appliquer. (D) Sur le côté gauche de l’onglet Amplitude 2D, utilisez les outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différentes cibles à des fins de détection et de quantification. Une fois les cibles des grappes de gouttelettes identifiées, les résultats de quantification peuvent être consultés dans la fenêtre Données de puits dans le même onglet d’amplitude 2D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Peu de ressources sont disponibles sur la façon de développer des tests RT-ddPCR pour la détection du SRAS-CoV-2. Bien qu’ils ne soient pas utilisés dans cet article, des échantillons standard avec des copies connues peuvent être utilisés pour développer et optimiser les essais. Dans ce travail cependant, des échantillons de SARS-CoV-2 cultivés dans des cellules Vero-E6 ont été dopés dans un arrière-plan d’ARN génomique humain et utilisés comme échantillons standard pour développer les tests. Des séquences d’amorce et de sonde appropriées sont essentielles lors de l’élaboration des essais. Étant donné que la plupart des travaux préliminaires sur la RT-ddPCR du SRAS-CoV-2 utilisaient l’amorce et les sondes du CDC chinois ciblant les gènes ORF1ab et N, ils les avaient jugés aptes à être inclus dans ce travail 7,8,9,10,11. La spécificité analytique et la sensibilité de ces amorces ont également été comparées à l’aide de la ddPCR dans les travaux précédents7. Les amorces RBD2 et la sonde13 ont été développées en interne et jugées aptes à la RT-ddPCR. Étant donné que les tests peuvent être utilisés pour différentes applications, y compris le diagnostic, le gène humain spécifique de la sous-unité p30 de la protéine P de la ribonuclease P (RPP30) a été inclus dans tous les tests multiplex. Ces gènes peuvent être utilisés comme contrôle endogène humain pour des expériences de diagnostic. Cependant, dans le cas d’un échantillonnage environnemental ou d’autres recherches qui n’ont pas besoin du gène de référence humain, on peut alterner cette cible avec une autre cible SARS-CoV-2.
Dans tous les essais, il est important d’inclure des témoins pour valider les essais et les données expérimentales. Ces contrôles peuvent comprendre : NTC (eau exempte de nucléase comme échantillon) pour aider à établir des seuils et à localiser les grappes de gouttelettes négatives; contrôle positif (échantillon avec toutes les cibles du SRAS-CoV-2, y compris le gène de référence humain) pour évaluer la défaillance du réactif, l’intégrité de l’amorce et de la sonde, ainsi que la détection et la localisation substantielles de la transcription inverse des cibles de gouttelettes positives; et les contrôles d’extraction (échantillons humains regroupés de volontaires sains ou acide nucléique total extrait d’une cellule humaine cultivée non infectieuse) pour détecter l’échec ou le succès de l’étape d’extraction.
La plupart des systèmes ddPCR, y compris le système QX200, ont une plage dynamique étroite de 1 à 120 000 copies/réaction de 20 μL. Lors de la détection d’échantillons inconnus, la concentration cible dans l’échantillon de départ est souvent inconnue, ce qui peut poser des défis lors de la quantification d’échantillons hautement concentrés. Pour surmonter ce problème, il est recommandé de prévoir de réduire l’échantillon de départ en conséquence lors de la quantification d’échantillons soupçonnés de contenir de grandes quantités de molécules cibles (telles que la culture cellulaire). Dans le cas où le nombre de copies cibles/génome est inconnu, il convient de déterminer la quantité de départ optimale par une série de dilutions en série de quatre fois de chaque échantillon à la plage numérique attendue. En analysant ces quatre points, on s’assure que l’un des points de données se situe dans la plage numérique optimale.
L’utilisation d’une amorce élevée et d’une faible concentration de sonde est un avantage de la plupart des expériences de ddPCR simplex et duplex. Cette différence de concentration augmente la distance de séparation d’amplitude entre les grappes de gouttelettes positives et négatives, ce qui facilite l’analyse des données. Cependant, lors de la mise au point d’essais multiplex d’ordre supérieur, les changements dans ces concentrations peuvent entraîner des changements dans la position des cibles de gouttelettes positives, comme le montrent les figures 3 et 4. En conséquence, une option d’optimisation du test en dehors de la température de recuit serait de modifier la concentration de l’amorce ou de la sonde cible pour distinguer les gouttelettes. Ce phénomène a été utilisé et expliqué avant14,15,16.
Malgré les performances du test, ce travail est un flux de travail RT-ddPCR en deux étapes. L’étape supplémentaire de transcription inverse avant la ddPCR laisse place à la contamination des échantillons. Cependant, si des techniques de manipulation d’échantillons prudentes et appropriées sont utilisées, ce ne sera pas un problème. Positivement, l’ADN est connu pour être plus stable que l’ARN. La conversion de l’ARN en ADNc peut prolonger la durée de conservation de l’échantillon pendant le stockage par rapport à l’ARN. Une expérience RT-ddPCR en deux étapes est également moins chère qu’une expérience RT-ddPCR en une étape.
Comparée à la RT-qPCR, la RT-ddPCR est chère. Par conséquent, des considérations doivent être prises en compte lors de l’exécution de la RT-ddPCR. Par exemple, lors du diagnostic, on peut utiliser la RT-ddPCR dans le cas où leurs échantillons ont des cibles peu abondantes. Cependant, il est possible que les coûts des instruments et des réactifs dPCR diminuent bientôt, et la technique sera adaptée dans de nombreux laboratoires, comme cela s’est produit dans le passé avec la PCR régulière et la qPCR. Par conséquent, il est important de définir des protocoles comme celui-ci pour les utilisateurs actuels et futurs de dPCR. En conclusion, les tests développés permettent aux utilisateurs potentiels de varier les cibles en fonction de leurs applications. Le multiplexage permettra de détecter efficacement de nombreuses cibles dans un seul échantillon en une seule réaction. Jusqu’à présent, c’est peut-être le premier protocole qui donne tous les détails sur la façon d’utiliser le système AutoDG, y compris le logiciel externe dans la détection du SARS-CoV-2. D’autres travaux sur l’optimisation des essais doivent encore être effectués pour obtenir une meilleure séparation dans le test quadruplex. L’utilisation de normes contribuera également à améliorer les essais développés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit à révéler.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le mégaprojet de contrôle des maladies infectieuses du ministère de la Santé de Chine, numéro de subvention 2017ZX10302301-005 et le Centre conjoint de recherche sino-africain, numéro de subvention SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
