Summary
В этой работе обобщены шаги по разработке различных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Шаги проработаны, и были включены примечания о том, как улучшить анализы и результаты экспериментов. Эти анализы могут использоваться для нескольких приложений SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
Диагностика продолжающейся пандемии SARS-CoV-2 является приоритетом для всех стран мира. В настоящее время количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, поскольку постоянного решения нет. Каким бы эффективным ни был этот метод, появились исследования, показывающие его ограничения в обнаружении и диагностике, особенно когда речь идет о малораспространенных мишенях. Напротив, было показано, что капельная цифровая ПЦР (ddPCR), недавно появившаяся технология с превосходными преимуществами по сравнению с кПЦР, преодолевает проблемы ОТ-кПЦР в диагностике SARS-CoV-2 из малораспространенных целевых образцов. В перспективе в этой статье возможности ОТ-дПЦР еще больше расширяются за счет демонстрации шагов по разработке симплексных, дуплексных, триплексных зондовых смесей и квадруплексных анализов с использованием двухцветной системы детектирования. Показано, что разработка этих анализов возможна с использованием праймеров и зондов, нацеленных на определенные участки генома SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 и RBD2). Кроме того, предоставляются пошаговые подробные протоколы, примечания и предложения о том, как улучшить рабочий процесс анализа и анализа данных. Адаптация этого рабочего процесса в будущих работах обеспечит возможность чувствительного обнаружения максимального количества целей в небольшой выборке, что значительно снизит стоимость и пропускную способность выборки.
Introduction
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), хорошо известная методика, с момента своего появления претерпела несколько трансформаций и стала мощным методом, способным дать ответы на исследования нуклеиновых кислот. Эти преобразования были постоянным совершенствованием старой техники. Эти преобразования можно свести к тремпоколениям1. Первое поколение - это обычная ПЦР, которая основана на гель-электрофорезе для количественной оценки и обнаружения амплифицированных мишеней. Второе поколение — это количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), которая может обнаруживать образцы в режиме реального времени и полагаться на стандартную кривую для прямого количественного определения целей в образце. Третье поколение, цифровая ПЦР (дПЦР), может выполнять как обнаружение, так и абсолютное количественное определение мишеней нуклеиновых кислот без необходимости стандартной кривой. дПЦР также была усовершенствована за счет того, что реакционные камеры были разделены скважинами стенки на эмульсии нефти, воды и стабилизирующих химических веществ в той же лунке, что и при цифровой ПЦР2 на основе капель. При капельной цифровой ПЦР (ddPCR) образец разбивается на тысячи капель нанолитрового размера, содержащих отдельные мишени, которые позже будут количественно определены с использованием статистики Пуассона 2,3,4. Этот метод дает ddPCR преимущество в количественной оценке малораспространенных мишеней по сравнению с другими поколениями ПЦР.
В последнее время во многих приложениях подчеркивается превосходство ddPCR над широко используемой qPCR при обнаружении и количественной оценке малораспространенных мишеней 1,5,6. SARS-CoV-2 не является исключением из этих приложений 7,8,9,10,11,12. С момента вспышки SARS-CoV-2 ученые работали на всех фронтах, чтобы найти решения о том, как диагностировать вирус и эффективно его обнаруживать. Нынешним золотым стандартом по-прежнему остается qPCR13. Однако было показано, что ОТ-дПЦР более точна при обнаружении малораспространенных мишеней SARS-CoV-2 как из экологических, так и из клинических образцов по сравнению с ОТ-кПЦР 7,8,9,10,11,12. Большинство опубликованных работ по ddPCR SARS-CoV-2 основаны на симплексных анализах, а мультиплексные - на коммерческих анализах. Следовательно, необходимо сделать больше, чтобы объяснить, как разрабатывать мультиплексные анализы ОТ-дПЦР для обнаружения SARS-CoV-2.
При правильном дизайне анализа мультиплексирование может быть использовано для экономии затрат, увеличения пропускной способности образца и максимизации количества мишеней, которые могут быть чувствительно обнаружены в небольшом образце. При мультиплексировании с помощью ddPCR необходимо учитывать, сколько флуорофоров может быть обнаружено в конкретной системе. Некоторые платформы ddPCR могут поддерживать до трех каналов, в то время как другие поддерживают только два канала. Следовательно, при мультиплексировании с двумя каналами приходится использовать разные подходы, в том числе мультиплексирование более высокого порядка для обнаружения более двух целей14,15,16. В этой работе двухцветная система обнаружения ddPCR используется для демонстрации шагов по разработке различных анализов SARS-CoV-2 RT-ddPCR, которые можно адаптировать для различных исследовательских приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этическое заявление
Уханьский институт вирусологии (WHIOV) входит в число лабораторий и институтов, одобренных Китайским центром по контролю и профилактике заболеваний города Ухань для проведения исследований SARS-CoV-2 и выявления COVID-19 в клинических образцах. Исследования по разработке новых методов диагностики COVID-19 с использованием клинических образцов также были одобрены этическим комитетом Уханьского института вирусологии (2020FCA001).
1. Рабочий процесс обработки образцов (рис. 1A)
ПРИМЕЧАНИЕ: Во всем протоколе важно использовать отдельные помещения со специальными пипетками для обработки образцов (экстракция и хранение), подготовки и хранения реагентов/мастермиксов, подготовки реакционных смесей (образец плюс мастермикс) и обнаружения, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Разрабатываемые анализы могут быть использованы при обнаружении клинических образцов или исследовательских образцов. Со всеми образцами следует обращаться так, как будто они могут передавать инфекционные агенты, даже при использовании безопасных лабораторных процедур. Этапы обработки проб должны выполняться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2) в соответствии со строгими правилами BSL-2, включая ношение соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ).
- Пример инактивации
- Отнесите 1 мл образца SARS-CoV-2 в лабораторию BSL-2. Инактивируйте образцы при 65 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут поступать из разных источников, поэтому следует убедиться, что инактивируемый объем достаточен для обеспечения последующей экстракции РНК. Большинство наборов для экстракции требуют небольшого объема образца до 200 мкл, следовательно, объема образца около 1 мл будет достаточно для инактивации. Поверхностно-активные вещества, наборы и буферы для лизиса также могут использоваться для прямой инактивации и экстракции РНК в соответствии с собственной СОП лабораторий. - Отнесите пробы в шкаф биобезопасности (BSC) и дайте им постоять при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы потенциальные аэрозоли осели. Храните образцы при температуре 4 °C до 24 часов, если их не обработать немедленно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для хранения образцов не требуется специальный контейнер. Образцы можно хранить в пробирках или контейнерах, используемых во время инактивации. Для этой работы большинство образцов хранились в пробирках с вирусными транспортными средами (VTM) или пробирках объемом 1,5 мл.
- Отнесите 1 мл образца SARS-CoV-2 в лабораторию BSL-2. Инактивируйте образцы при 65 °C в течение 30 мин.
- Выделение РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие инструменты и наборы для выделения РНК со специальными протоколами доступны для готового использования. Здесь представлена автоматизированная процедура в соответствии с инструкциями производителя.- Выньте предварительно заполненную диафрагму колодца глубиной 96; Аккуратно переверните его вверх дном, чтобы перемешать магнитные шарики. После смешивания аккуратно встряхните пластину на плоской поверхности, чтобы сконцентрировать реагент и магнитные шарики, которые могут находиться на стене, на дне пластины.
- Осторожно оторвите уплотнительную пленку из алюминиевой фольги, чтобы избежать вибрации пластины и пролития жидкости. Добавьте 20 мкл протеиназы К и 200 мкл образца на лунку в ряды 2 и 8 96-луночного планшета. Затем поместите 96-луночную пластину на основание 32-канального автоматического прибора для экстракции нуклеиновых кислот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите программу на компьютере в течение 1 часа после добавления примера. - Вставьте втулку магнитного стержня в слот для карты 32-канального автоматического прибора для извлечения нуклеиновых кислот. Выберите программу GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (быстрая версия) и запустите ее.
- После завершения экстракции вынимают образцы нуклеиновых кислот в рядах 6 и 12 (около 100 мкл / образец) и распределяют в чистой 96-луночной пластине без нуклеазы. Храните образцы при температуре 4 °C до 24 часов до использования или при температуре -20 °C в течение более длительного времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать многоканальную пипетку объемом 100 мкл для переноса образцов в новую пластину объемом 100-200 мкл, поскольку она может напрямую совпадать с колонками пластины для образцов.
- Генерация кДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, хранящихся в течение длительного времени, избегайте нескольких циклов замораживания/оттаивания. Выполните генерацию кДНК с помощью набора кДНК, следуя инструкциям производителя.- В ПЦР-пробирку объемом 100 или 200 мкл, помещенную на блок льда/охлаждения, добавьте 2 мкл 5-кратной основной смеси RT (например, Perfect Real Time), 5 мкл образца РНК и 3 мкл свободного от РНКазы ddH2O на реакцию (общий объем 10 мкл).
- Поместите ПЦР-пробирку в термоциклер, настроенный на работу при температуре 37 °C в течение 15 мин (обратная транскрипция), 85 °C в течение 5 с (тепловая инактивация обратной транскриптазы) и 4 °C в течение бесконечного времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно обработайте образцы или храните при температуре 4 °C до 24 часов до использования или при -20 °C до 6 месяцев.
2. Оптимизация анализа ddPCR и рабочего процесса
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте анализы до/после считывания капель. В зависимости от результатов, они могут быть оптимизированы на любом этапе работы для достижения лучших результатов. Ниже приведены некоторые общие факторы, которые следует учитывать при оптимизации экспериментов ddPCR.
- Проверьте праймеры и зонды ddPCR (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры ORF1ab и N были адаптированы из China CDC17, эндогенный контрольный ген человека (RPP30) из Lu et al.18 и RBD2 из Nyaruaba et al.13. Все праймеры и зонды, кроме RBD2, уже были протестированы ddPCR и оптимизированы 7,8,18. - Запустите контрольные образцы тестов ddPCR, включающие положительный контроль (образец со всеми четырьмя целями), элемент управления без шаблона (NTC; Вода без нуклеазы или образец без мишеней) и экстракция / отрицательный контроль (общая нуклеиновая кислота, извлеченная из неинфекционной культивируемой клетки человека или объединенных образцов от добровольцев в области здравоохранения).
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтение отдается стандартным контрольным образцам с известными копиями генов-мишеней. Однако при отсутствии стандартов используйте имеющиеся образцы для определения их элементов управления или матрицы выборок. Запустите элементы управления вместе с тестовыми образцами. - Оптимизируйте температуру отжига (рис. 2D), вставив градиент температуры от 55 °C до 65 °C на этапе отжига ПЦР (этап 3.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация температуры отжига помогает найти наилучшую температуру, при которой отделение капель является максимальным (легкая идентификация цели) с минимальным дождем. После получения результатов сузьте температурный диапазон для лучшей оптимизации, например, от 55 °C до 60 °C. - Оптимизируйте концентрацию праймера и зонда. Если в анализах не достигается оптимальное разделение между положительными и отрицательными каплями, варьируйте концентрацию праймера (300-900 нМ) и/или зонда (100-400 нМ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение концентрации праймера/зонда приводит к снижению амплитуды капель мишени, а ее увеличение также увеличивает амплитуду мишени. Это может быть полезно при амплитудном мультиплексировании. - Проверьте аналитическую чувствительность с учетом различных параметров, включая предел пустоты (LoB), предел обнаружения (LoD), специфичность и чувствительность, используя как стандартные, так и тестовые образцы, по желанию.
3. Рабочий процесс ddPCR (рис. 1B) и разработка анализа (табл. 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и другие системы обнаружения ddPCR, этот рабочий процесс также состоит из четырех этапов (рис. 1B), включая подготовку реакционной смеси, генерацию капель, амплификацию ПЦР и считывание капель.
- Приготовление реакционной смеси
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все анализы в чистом отдельном помещении и внутри BSC. Соблюдайте стандартные меры предосторожности, включая использование чистых перчаток, чистых пипеток, воды без нуклеаз и дезинфицирующих средств. Аликвотные реагенты в отдельных пробирках и хранят при температуре -20 °C, чтобы избежать повторных циклов замораживания и оттаивания. Подготовьте анализы, как показано в таблице 2. Растворы праймера и зонда следует хранить в высоких концентрациях 100 мкМ. Рабочие растворы можно хранить в аликвотах 20-40 мкМ (разбавленных в безнуклеазной воде).- Общие этапы во всех анализах
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подготовкой анализов рассчитайте общий объем необходимого мастермикса на основе количества образцов. Здесь объем каждого компонента мастермикса был умножен на 1,05, чтобы учесть любые ошибки пипетирования.- Разморозьте и уравновесьте реакционные материалы до комнатной температуры. Кратковременно встряхните компоненты реакций (30 с) для обеспечения однородности и кратковременно центрифугу для сбора содержимого на дне пробирки.
- Приготовьте смесь праймер-зонд (ПП) для каждого анализа, смешивая конкретные объемы реакции, как указано в таблице 2 , из рабочих растворов.
- Приготовьте мастер-микс путем смешивания 11 мкл (1x) 2x суперсмеси ddPCR для зондов (без dUTP), смеси PP (в зависимости от анализа, как показано в таблице 2 рабочего раствора) и воды, свободной от нуклеаз, до конечного объема 19,8 мкл на лунку. Распределите мастермикс в лунки безнуклеазной 96-луночной планшета ddPCR в зависимости от количества образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пробоотборника убедитесь, что все 8 скважин в одной колонне имеют раствор. Если используется только несколько лунок, например, 5 образцов, заполните остальные 3 лунки 22 мкл воды, не содержащей нуклеаз, или контрольного буфера каждая. - Чтобы получить окончательный объем реакционной смеси (22 мкл), добавьте 2,2 мкл образца кДНК на лунку, содержащую мастермикс. Запечатайте пластину одноразовым запайщиком пластин для ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните добавление образцов в специально отведенном для этого помещении. Включите элементы управления, т. е. положительные, NTC и извлечение. Кроме того, если образцы РНК имеют низкую концентрацию, уменьшите объем воды в мастермиксе и соответственно увеличьте объем образца до 5,5 мкл. - После того, как реакционная смесь распределена по лунке, кратковременно встряхните (15-30 с) и центрифугу (10-15 с), чтобы собрать содержимое на дне пластины. Приступайте к генерации капель.
- Общие этапы во всех анализах
- Автоматическая генерация капель (дополнительный рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать различные генераторы капель; однако это исследование было выполнено с помощью автоматизированного генератора капель (AutoDG). Чтобы избежать загрязнения ампликоном, убедитесь, что генератор капель и считыватели имеют выделенное место в отдельных областях. При загрузке расходных материалов рекомендуется начинать загрузку с задней части прибора, работающей спереди, чтобы избежать перемещения рук над расходными материалами во избежание перекрестного загрязнения.- Приобретите все расходные материалы, необходимые для настройки AutoDG, включая масло AutoDG для зондов, картриджи DG32, наконечники для пипеток, блок охлаждения, планшет для образцов, планшет для капель (новая чистая пластина ddPCR) и мусорный бак.
- На сенсорном экране AutoDG нажмите Configure Sample Plate, выберите столбцы, в которых находятся образцы на образце, и нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экран станет желтым, указывая на LOAD, где должны быть загружены расходные материалы. - Откройте дверцу AutoDG и загрузите расходные материалы на соответствующие места.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие места, где должны быть загружены расходные материалы, будут иметь желтый индикатор, который позже станет зеленым, если расходные материалы будут загружены. Это похоже на сенсорный экран. - Загрузите пластину для образцов и пластину для генерации капель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для генерации капель должна быть размещена на охлаждающем блоке. Убедитесь, что охлаждающий блок фиолетовый (готов к использованию), а не розовый (его следует хранить в морозильной камере, пока цвет не станет фиолетовым). - Закройте дверцу AutoDG, убедитесь, что экран горит зеленым цветом (расходные материалы загружены), и выберите/убедитесь, что тип масла — «Масло для зондов », прежде чем нажимать кнопку «Начать генерацию капель».
- Подождите, пока капли не сгенерируются. Откройте дверцу, как только на экране появится надпись «Капли готовы », и извлеките пластину, содержащую капли.
- Запечатайте пластину с помощью прокалываемой фольги с помощью запайщика пластин, настроенного на работу при 185 °C в течение 5 с. Приступают к ПЦР-амплификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-амплификацию следует начинать в течение 30 минут после генерации капель.
- ПЦР-амплификация
- Вставьте герметичную пластину с каплями в термоциклер глубиной 96 скважин, установите объем образца на 40 мкл и температуру крышки на 105 °C.
- ПЦР амплифицирует капли с помощью программы: 95 °C в течение 10 мин (активация фермента), 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 30 с и 1 мин отжиг/удлинение при 57 °C, дезактивация фермента при 98 °C в течение 10 мин и стадия выдержки при 4 °C в течение неопределенного времени. После ПЦР считайте капли или храните при температуре 4 °C до 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте скорость нарастания 2 °C / с на всех этапах, так как скорость нарастания может отличаться для разных термоциклеров. Держите пластину не менее 30 минут при температуре 4 °C, чтобы обеспечить стабилизацию капель перед считыванием капель.
- Считывание капель
- Перенесите термоциклированную 96-луночную пластину в считыватель капель и на компьютере, подключенном к считывателю капель, откройте/запустите прилагаемое программное обеспечение.
- В режиме настройки выберите « Создать », а затем дважды щелкните любую скважину, чтобы открыть диалоговое окно «Редактор скважин ». Выберите скважины для считывания и выберите Эксперимент: ABS, Супермикс: ddPCR Супермикс для зондов (без dUTP), Тип цели 1: Ch1 Неизвестно, Тип цели 2: Ch2 Неизвестен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный, пустой, NTC или положительный результат можно выбрать в раскрывающемся меню целевого типа 1/2 для контрольных образцов. - Назначьте целевое имя или имя образца на основе макета пластины и нажмите кнопку Применить. Когда закончите, нажмите кнопку ОК и сохраните созданный шаблон. Нажмите « Выполнить» и при появлении запроса выберите правильный цвет (FAM/HEX).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед первым запуском рекомендуется заправить систему перед первым запуском дня. Кроме того, проверьте, все ли индикаторы в считывателе горят зеленым цветом, и если нет, следуйте рекомендациям по применению в состоянии всплывающей подсказки. - После завершения сбора данных снимите пластину со считывателя. Анализируйте данные по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку предварительные результаты можно увидеть на экране, запуск положительных проб в первых скважинах можно использовать для проверки качества в режиме реального времени.
4. Анализ данных (дополнительные рисунки 2 и 3)
- Проверьте данные из всех лунок на общее количество капель. Если количество капель составляет < 10 000, то откажитесь от результатов и повторите анализ. Установите отсечку, чтобы принять положительные и отрицательные результаты. Например, количество капель до 3 или более положительных капель можно рассматривать как порог для положительных результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные для всех анализов, включая симплексные, дуплексные, триплексные зондовые и квадруплексные анализы, генерируются с помощью прилагаемого программного обеспечения. Однако это программное обеспечение подходит только для симплексных и дуплексных анализов. Для мультиплексных анализов высокого порядка (>3 мишени) требуется внешнее программное обеспечение. - Симплексные и дуплексные анализы
ПРИМЕЧАНИЕ: Внешнее программное обеспечение также может анализировать симплексные и дуплексные данные. Тем не менее, использование сопутствующего программного обеспечения проще для этих анализов, поэтому они используются в этой статье.- Дважды щелкните файл .qlp, который нужно проанализировать, чтобы открыть его, и выберите «Анализировать».
- Используйте пороговые инструменты в 1D Amplitude и 2D Amplitude, чтобы различать положительные и отрицательные капли для каждой лунки в правильном канале. NTC и положительные контрольные образцы могут быть использованы в качестве руководства для установки пороговых значений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты FAM видны на канале 1, а HEX/VIC - на канале 2. - После установки порогового значения результаты могут быть экспортированы в виде файла .csv и дополнительно проанализированы в Excel или записаны путем чтения непосредственно в окне результатов.
- Смесь триплексных зондов (дополнительный рисунок 2) и квадруплексные анализы (дополнительный рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед анализом смеси триплексных зондов и квадруплексного анализа загрузите внешнее программное обеспечение. Перед установкой ознакомьтесь с минимальными системными требованиями.- Откройте файл .qlp, щелкнув его правой кнопкой мыши и выбрав « Открыть с помощью внешнего программного обеспечения», или открыв внешнее программное обеспечение и щелкнув параметр « Обзор », чтобы найти файл .qlp в своей папке, или просто перетащив файл .qlp и поместив его в уже открытое внешнее программное обеспечение.
- На вкладке редактора пластин выберите скважины для анализа в правой части вкладки.
- Для смеси триплексных зондов выберите Direct Quantification (DQ) в качестве типа эксперимента, выберите Probe Mix Triplex в качестве информации об анализе и введите соответствующие имена целей, а затем нажмите «Применить».
- Для квадруплекса выберите « Прямое количественное определение» (DQ) в качестве типа эксперимента, выберите «Амплитудный мультиплекс » в качестве информации анализа и введите соответствующие имена целей, а затем нажмите « Применить».
- В левой части вкладки «2D-амплитуда» используйте инструменты «График », чтобы назначить определенные цвета различным целевым кластерам, следуя всплывающим предложениям окна « Выбор для назначения кластера ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительный режим кластера может быть применен в зависимости от предпочтений пользователей. - После того, как целевые цвета назначены, данные количественной оценки можно прочитать в окне «Скважинные данные» в правом нижнем углу. Экспортируйте данные в Excel/csv для дальнейшего анализа с помощью значка с тремя полосами в правом верхнем углу таблицы скважинных данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В экспериментальном исследовании аналитическая эффективность мультиплексных анализов была протестирована на клинических и исследовательских образцах19. Эффективность мультиплексных анализов была выше, чем у ОТ-ПЦР19. Поскольку низкое количество капель может указывать на проблему во время генерации капель, в этой статье на основе эмпирических данных было установлено пороговое значение в 10 000 капель на лунку.
Хорошее разделение между положительными и отрицательными каплями с минимальными помехами дождя может помочь в анализе данных. Следовательно, в хорошем эксперименте оптимизация анализа является ключом19. Как видно из результатов анализа температурного градиента на рисунке 2D, высокие температуры отжига (например, 65 °C) не могли четко отличить положительные капли от отрицательных при проведении дуплексного анализа (N (FAM) и RPP30 (HEX)). Однако при снижении температуры отжига было достигнуто оптимальное разделение между положительными и отрицательными каплями. Оптимальной была определена температура 57 °C. Это также может наблюдаться в других анализах19.
Используя двухцветную (FAM/HEX) систему обнаружения RT-ddPCR, можно обнаружить одну (рис. 2A, B), две (рис. 2C), три (рис. 3A) и четыре (рис. 3B) мишени SARS-CoV-2 в одном образце. Во время анализа данных сопутствующее программное обеспечение, используемое для считывания капель, может анализировать только симплексные и дуплексные анализы, как показано на рисунке 2. Это означает, что для мультиплексных анализов более высокого порядка (мишени >3) следует использовать внешнее программное обеспечение для анализа данных, как показано на рисунках 3, S2 и S3. Важно также отметить, что внешнее программное обеспечение также может использоваться для анализа симплексных и дуплексных данных. Для симплексных и дуплексных данных анализ довольно прост, поскольку мишени разделяются на положительные или отрицательные капли в соответствующих каналах, как показано на рисунке 2. Образец NTC может помочь в обнаружении отрицательных капель, что, в свою очередь, может помочь установить пороговые значения для анализа данных, как показано на рисунке 2A. Для дуплексного анализа анализ может проводиться в отдельных каналах (рис. 2B i, ii) или в 2D-амплитуде (рис. 2B iii).
Для мультиплексных анализов более высокого порядка анализ данных не является простым, и внимание должно быть сосредоточено на назначении цели капель. После установки внешнего программного обеспечения выберите скважины для анализа, выберите соответствующий тип эксперимента и назначьте целевые кластеры на основе типа эксперимента, как показано на рисунках S2 и S3. Всплывающее окно «Выбор для назначения кластера» поможет узнать, как назначать кластеры в анализах с более высоким мультиплексом. Используйте инструменты построения графиков, чтобы назначить до 8 кластеров капель для анализа смеси триплексных зондов (рис. 3A) и до 16 кластеров капель для анализа на основе квадруплексной амплитуды (рис. 3B).
После назначения кластеров и пороговых значений данные количественного определения для каждой цели в виде копий/мкл можно прочитать в окне скважинных данных в правом нижнем углу внешнего программного обеспечения. Эти данные могут быть использованы для оценки количества копий мишеней в стартовом образце. Например, если 2,2 мкл образца использовали в конечном объеме 22 мкл, а программное обеспечение регистрировало 30,5 копий/мкл для ORF1ab, в смеси ПЦР было 30,5 x 22 = 671 копия ORF1ab. Смесь содержала 2,2 мкл исходного образца, следовательно, в исходном образце было 671 копия ORF1ab и 671/2,2 = 305 копий/мкл ORF1ab в исходном образце. Этот метод может быть использован для оценки концентрации каждой мишени во всех анализах.
| Цель | Последовательность от 5 до 3 футов | Зондовые красители | Длина изделия (bp) | Ссылка | |
| ORF1ab | Вперёд | CCCTGTGGGTT ТТАКАКТТАА |
5'- FAM и BHQ1-3' 5'- HEX и BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Обратный | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Зонд | CCGTCTGCGGT АТГТГГАААГГ ТТАТГГ |
||||
| N | Вперёд | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM и BHQ1-3' 5'- HEX и BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Обратный | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Зонд | ТТГКТГКТГКТ ТГАКАГАТТ |
||||
| РПП30 | Вперёд | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX и BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Обратный | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Зонд | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| РБД2 | Вперёд | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM и BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Обратный | CCTGTGCCTGT ТАААККАТТГ |
||||
| Зонд | АКАГКАТКАГТ AGTGTCAGCAA ТГТКТК |
||||
Таблица 1: Последовательности праймеров и зондов, используемые для разработки различных анализов SARS-CoV-2.
| Конечная концентрация праймера-зонда на анализ в нМа | |||||
| Цель | Праймер/зонд | Симплексb | Дуплексc | Триплексный зондсмеси d | Четырехкратная амплитудаe |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEX | 250 | ||||
| N | Н.Ф. | 800 | 800 | 800 | |
| Н Р | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N шестнадцатеричный | 125 | ||||
| РПП30 | РПП30 Ф | 800 | 800 | 800 | 800 |
| РПП30 Р | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEX | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| РБД2 | РБД2 Ф | 800 | 800 | 800 | |
| РБД2 Р | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEX | |||||
| a Во всех анализах целевые показатели могут меняться местами в зависимости от предпочтений пользователей. Используемые мишени предназначены для демонстрационных целей этого эксперимента. | |||||
| b Одновременно в симплексном анализе в канале FAM или HEX может быть обнаружена только одна мишень. RBD2 используется для демонстрации результатов канала FAM, а RPP30 используется для канала HEX. | |||||
| c Две мишени могут быть обнаружены одновременно в дуплексном анализе в каналах FAM и HEX. | |||||
| d Три мишени могут быть обнаружены с использованием обоих каналов, т.е. цель 1 будет обнаружена в концентрации зонда FAM (1×), вторая цель - в концентрации зонда HEX (1×) и мишень 3 в обоих каналах (смесь концентраций зонда 0,5× HEX и 0,5× зонда FAM для получения окончательного 1×). | |||||
| e В каждом канале обнаруживаются две мишени (FAM и HEX) с концентрацией зондов 1× и O.5× в каждом канале. | |||||
Таблица 2: Конечная концентрация различных пар праймера и зонда на анализ.
Рисунок 1: Обработка образцов и рабочий процесс капельной цифровой ПЦР. (A) Рабочий процесс обработки проб включает сбор проб и транспортировку на установку BSL-2, инактивацию, экстракцию и генерацию кДНК. (B) Рабочий процесс капельной цифровой ПЦР начинается с подготовки мастермикса, загрузки мастермикса в планшет ddPCR и добавления образца (образцов), генерации капель, амплификации мишеней внутри капель с помощью ПЦР и, наконец, считывания амплифицированных капель с помощью считывателя капель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Результаты симплексного и дуплексного анализа, включая оптимизацию температуры отжига. (A) Результаты симплексного анализа, когда одна мишень (RBD2) была помечена FAM. (B) Результаты симплексного анализа, когда одна мишень (RPP30) была помечена HEX. (C) Результат дуплексного анализа двух мишеней в 1D и 2D (iii) каналах после того, как N (i) был помечен FAM, а RPP30 (ii) был помечен HEX. (D) Градиент температуры отжига (от 65°С до 55°С) результаты дуплексного анализа, меченного ORF1ab (FAM) и RPP30 (HEX). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Результаты мультиплексного анализа на основе триплексного зонда и мультиплексного мультиплексного анализа на основе амплитуды. (A) Результаты анализа смеси триплексных зондов, когда три мишени были помечены следующими соотношениями FAM: HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) и RPP30 (0:1). (B) Результаты квадруплексного амплитудного анализа после того, как четыре мишени были помечены следующими соотношениями FAM:HEX; RBD2 (0,5:0), N (1:0), RPP30 (0:0,5) и ORF1ab (0:1). 1 и 0,5 являются зондовыми концентрациями 250 нМ и 125 нМ соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Генерация капель с помощью автоматического генератора капель. (A) Расходные материалы, необходимые для настройки AutoDG. (B) На сенсорном экране AutoDG нажмите Configure Sample Plate , выберите столбцы, в которых находятся образцы на пластине для образцов, и нажмите OK. (C) После выбора экран становится желтым, указывая, где следует загрузить расходные материалы. (D) Откройте дверцу AutoDG и загрузите расходные материалы в соответствующие места. Загружайте расходные материалы сзади, работая спереди. Убедитесь, что каждый раз, когда добавляется расходный материал, индикатор меняется с желтого на зеленый в этом месте. (E) Убедитесь, что используется масло для зондов. (F) Закройте дверцу AutoDG и убедитесь, что все реагенты установлены на место, проверив, горит ли зеленый сенсорный экран AutoDG. (G) Нажмите START Droplet Generation (Начать генерацию капель ), чтобы сгенерировать капли. (H) После завершения генерации капель откройте AutoDG и снимите пластину с каплями. (I) Запечатайте пластину с каплями с помощью термосваривания из прокалываемой фольги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Этапы анализа результатов амплитудного мультиплексного анализа ddPCR с использованием внешнего программного обеспечения. (A) Установите внешнее программное обеспечение на компьютер. (B) Откройте файл .qlp, щелкнув его правой кнопкой мыши и выбрав « Открыть с установленным внешним программным обеспечением», или открыв внешнее программное обеспечение и щелкнув « Обзор », чтобы найти файл в вашей папке. Кроме того, можно перетащить файл .qlp и перетащить его в открытое внешнее программное обеспечение, чтобы открыть его. (C) После открытия в правой части вкладки «Редактор пластин» выберите «Триплекс смеси зондов» в раскрывающемся меню, назначьте соответствующую информацию о цели и нажмите «Применить». (D) В левой части вкладки «2D-амплитуда» используйте инструменты «График », чтобы присвоить определенные цвета различным целям для обнаружения и количественной оценки. После того, как мишени кластера капель определены, результаты количественной оценки можно увидеть в окне « Скважинные данные » на той же вкладке «Амплитуда 2D». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Этапы анализа результатов мультиплексного анализа ddPCR на основе амплитуды с использованием внешнего программного обеспечения. (A) Установите внешнее программное обеспечение на компьютер. (B) Откройте файл .qlp, щелкнув его правой кнопкой мыши и выбрав « Открыть с установленным внешним программным обеспечением», или открыв внешнее программное обеспечение и щелкнув опцию « Обзор », чтобы найти файл в вашей папке. Кроме того, можно перетащить файл .qlp и поместить его в уже открытое внешнее программное обеспечение, чтобы открыть его. (C) После открытия в правой части вкладки « Редактор пластин» выберите « Мультиплекс амплитуды» в раскрывающемся меню, назначьте соответствующую информацию о цели и нажмите «Применить». (D) В левой части вкладки «2D-амплитуда» используйте инструменты «График », чтобы присвоить определенные цвета различным целям для обнаружения и количественной оценки. После того, как мишени кластера капель определены, результаты количественной оценки можно увидеть в окне « Скважинные данные » на той же вкладке «Амплитуда 2D». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует мало ресурсов о том, как разрабатывать анализы RT-ddPCR для обнаружения SARS-CoV-2. Хотя стандартные образцы с известными копиями не используются в этой статье, они могут быть использованы для разработки и оптимизации анализов. Однако в этой работе образцы SARS-CoV-2, выращенные в клетках Vero-E6, были добавлены в фон геномной РНК человека и использовались в качестве стандартных образцов для разработки анализов. Правильные последовательности праймера и зонда имеют важное значение при разработке анализов. Поскольку в большинстве предварительных работ по SARS-CoV-2 RT-ddPCR использовался праймер и зонды Китайского CDC, нацеленные на гены ORF1ab и N, они сочли их подходящими для включения в эту работу 7,8,9,10,11. Аналитическая специфичность и чувствительность этих праймеров также сравнивались с использованием ddPCR в предыдущей работе7. Праймеры RBD2 и зонд13 были разработаны собственными силами и признаны пригодными для ОТ-дПЦР. Поскольку анализы могут быть использованы для различных применений, включая диагностику, специфический человеческий ген р30 белка рибонуклеазы Р (RPP30) был включен во все мультиплексные анализы. Эти гены могут быть использованы в качестве эндогенного контроля человека для диагностических экспериментов. Однако в случае отбора проб окружающей среды или других исследований, которые не нуждаются в референтном гене человека, можно чередовать эту мишень с другой мишенью SARS-CoV-2.
Во всех анализах важно включать средства контроля для проверки анализов и экспериментальных данных. Эти средства контроля могут включать: NTC (вода, не содержащая нуклеазы в качестве образца), чтобы помочь в установлении пороговых значений и обнаружении отрицательного кластера капель; положительный контроль (образец со всеми мишенями SARS-CoV-2, включая референсный ген человека) для оценки отказа реагента, целостности праймера и зонда, а также существенного обнаружения/определения местоположения положительных капель с обратной транскрипцией; и контроль экстракции (объединенные человеческие образцы от здоровых добровольцев или общая нуклеиновая кислота, извлеченная из неинфекционной культивируемой клетки человека) для выявления неудачи или успеха на этапе экстракции.
Большинство систем ddPCR, включая систему QX200, имеют узкий динамический диапазон от 1 до 120 000 копий/20 мкл реакции. При обнаружении неизвестных образцов целевая концентрация в исходном образце часто неизвестна, и это может создавать проблемы при количественном определении высококонцентрированных образцов. Чтобы преодолеть это, рекомендуется, чтобы при количественном определении образцов, предположительно содержащих большое количество молекул-мишеней (таких как клеточная культура), следует планировать соответствующее уменьшение исходного образца. В случае, когда число целевой копии/генома неизвестно, следует определить оптимальное начальное количество с помощью серии из четырех десятикратных серийных разведений каждого образца в ожидаемом цифровом диапазоне. Анализируя эти четыре точки, можно гарантировать, что одна из точек данных находится в оптимальном цифровом диапазоне.
Использование высокого праймера и низкой концентрации зонда является обязательным условием большинства симплексных и дуплексных экспериментов ddPCR. Эта разница в концентрации увеличивает расстояние между положительным и отрицательным кластерами капель по амплитуде, что упрощает анализ данных. Однако при разработке мультиплексных анализов более высокого порядка изменения этих концентраций могут привести к изменениям положения положительных мишеней для капель, как показано на рисунках 3 и 4. В результате одним из вариантов оптимизации анализа, помимо температуры отжига, будет изменение целевой концентрации праймера или зонда для различения капель. Это явление использовалось и объяснялось до14,15,16.
Несмотря на эффективность анализа, эта работа представляет собой двухэтапный рабочий процесс RT-ddPCR. Дополнительный этап обратной транскрипции перед ddPCR дает место для контаминации образцов. Однако, если используются осторожные и правильные методы обращения с образцами, это не будет проблемой. Известно, что ДНК более стабильна, чем РНК. Превращение РНК в кДНК может продлить срок годности образца во время хранения по сравнению с РНК. Двухэтапный эксперимент RT-ddPCR также дешевле, чем одноэтапный эксперимент RT-ddPCR.
По сравнению с ОТ-кПЦР, ОТ-ддПЦР стоит дорого. Следовательно, следует учитывать при выполнении ОТ-ддПЦР. Например, во время диагностики можно использовать ОТ-ддПЦР в том случае, когда их образцы имеют низкое количество мишеней. Однако есть вероятность, что стоимость инструментов и реагентов для дПЦР скоро снизится, и методика будет адаптирована во многих лабораториях, как это происходило в прошлом с обычной ПЦР и кПЦР. Следовательно, важно установить такие протоколы для нынешних и будущих пользователей дПЦР. В заключение, разработанные анализы дают потенциальным пользователям возможность варьировать цели в зависимости от их приложений. Мультиплексирование гарантирует, что можно эффективно обнаруживать множество мишеней в одном образце за одну реакцию. На данный момент это может быть первый протокол, который дает полную информацию о том, как использовать систему AutoDG, включая внешнее программное обеспечение для обнаружения SARS-CoV-2. Еще предстоит проделать дополнительную работу по оптимизации анализа, чтобы добиться лучшего разделения в квадруплексном анализе. Использование стандартов также поможет улучшить разработанные анализы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано Мегапроектом по борьбе с инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Китая, номер гранта 2017ZX10302301-005 и Китайско-африканским совместным исследовательским центром, номер гранта SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
