Summary
이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
Abstract
진행중인 SARS-CoV-2 전염병의 진단은 전 세계 모든 국가의 우선 순위입니다. 현재 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)은 영구적인 솔루션을 사용할 수 없기 때문에 SARS-CoV-2 진단의 황금 표준입니다. 이 기술이 아무리 효과적일 수 있지만, 특히 낮은 풍부 표적과 관련하여 탐지 및 진단의 한계를 보여주는 연구가 나타났습니다. 대조적으로, qPCR보다 우수한 장점을 가진 최근 신기술인 액적 디지털 PCR(ddPCR)은 낮은 풍부 표적 샘플에서 SARS-CoV-2 진단에서 RT-qPCR의 문제를 극복하는 것으로 나타났습니다. 이 기사에서는 2색 검출 시스템을 사용하여 심플렉스, 듀플렉스, 트리플렉스 프로브 믹스 및 쿼드러플렉스 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줌으로써 RT-ddPCR의 기능을 더욱 확장합니다. SARS-CoV-2 게놈(N, ORF1ab, RPP30 및 RBD2)의 특정 부위를 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하여 이러한 분석법의 개발이 가능한 것으로 나타났습니다. 또한 분석 워크플로를 개선하고 데이터를 분석하는 방법에 대한 단계별 세부 프로토콜, 메모 및 제안이 제공됩니다. 향후 작업에서 이 워크플로우를 조정하면 작은 샘플에서 최대 수의 표적을 민감하게 검출할 수 있어 비용과 샘플 처리량이 크게 향상됩니다.
Introduction
잘 알려진 기술인 중합효소연쇄반응(PCR)은 핵산 연구에 대한 해답을 제공할 수 있는 강력한 기술이 되기 위해 등장한 이후 여러 가지 변형을 거쳤습니다. 이러한 변형은 이전 기술의 지속적인 개선이었습니다. 이러한 변형은 3세대로 요약할 수 있다1. 1세대는 증폭된 표적을 정량화하고 검출하기 위해 겔 전기영동에 의존하는 기존 PCR입니다. 2세대는 실시간으로 시료를 검출할 수 있는 정량적 실시간 PCR(qPCR)이며 표준 곡선을 사용하여 시료의 표적을 직접 정량화할 수 있습니다. 3세대 디지털 PCR(dPCR)은 표준 곡선 없이 핵산 표적의 검출 및 절대 정량을 모두 수행할 수 있습니다. dPCR은 또한 액적 기반 디지털 PCR2에서 볼 수 있는 것과 동일한 웰 내에서 벽의 웰에 의해 오일, 물 및 안정화 화학 물질의 에멀젼으로 분리되는 반응 챔버에서 더욱 개선되었습니다. 액적 디지털 PCR(ddPCR)에서 샘플은 나중에 푸아송 통계 2,3,4를 사용하여 정량화될 개별 표적을 포함하는 수천 나노리터 크기의 액적으로 분할됩니다. 이 기술은 ddPCR이 다른 세대의 PCR과 비교할 때 낮은 농도의 표적을 정량화하는 데 우위를 점할 수 있도록 합니다.
최근에, 다수의 응용은 낮은 풍부 표적 1,5,6을 검출하고 정량화할 때 일반적으로 사용되는 qPCR에 비해 ddPCR의 우월성을 강조했다. SARS-CoV-2도 이러한 응용 프로그램 7,8,9,10,11,12에서 예외는 아닙니다. SARS-CoV-2가 발생한 이후 과학자들은 바이러스를 진단하고 효율적으로 탐지하는 방법에 대한 솔루션을 제시하기 위해 모든 전선에서 노력해 왔습니다. 현재 금본위제는 여전히 qPCR13으로 남아 있습니다. 그러나 RT-ddPCR은 RT-qPCR 7,8,9,10,11,12와 비교할 때 환경 및 임상 모두에서 낮은 풍부 SARS-CoV-2 표적을 검출하는 데 더 정확한 것으로 나타났습니다. SARS-CoV-2 ddPCR 발표 작업의 대부분은 상업용 분석에 따라 다중 분석과 함께 심플렉스 분석에 의존합니다. 따라서 SARS-CoV-2 검출을 위한 다중 RT-dPCR 분석을 개발하는 방법을 설명하기 위해 더 많은 작업을 수행해야 합니다.
적절한 분석 설계에서 멀티플렉싱을 사용하여 비용을 절감하고 시료 처리량을 늘리며 작은 시료 내에서 민감하게 검출할 수 있는 표적 수를 최대화할 수 있습니다. ddPCR로 멀티플렉싱할 때 특정 시스템에서 얼마나 많은 형광단을 검출할 수 있는지 고려해야 합니다. 일부 ddPCR 플랫폼은 최대 3개의 채널을 지원할 수 있는 반면 다른 플랫폼은 2개의 채널만 지원할 수 있습니다. 그러므로, 2개의 채널로 다중화할 때, 2개 이상의 타겟(14,15,16)을 검출하기 위해 고차 다중화를 포함하는 상이한 접근법을 사용해야 한다. 이 작업에서는 2색 ddPCR 검출 시스템을 사용하여 다양한 연구 응용 분야에 적용할 수 있는 다양한 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줍니다.
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Protocol
윤리적 진술
우한 바이러스 연구소(WHIOV)는 SARS-CoV-2에 대한 연구를 수행하고 임상 샘플에서 COVID-19를 검출하기 위해 우한시의 중국 CDC에서 승인한 실험실 및 기관 중 하나입니다. 임상 샘플을 사용한 COVID-19에 대한 새로운 진단 기술 개발에 대한 연구도 우한 바이러스 연구소 윤리 위원회(2020FCA001)의 승인을 받았습니다.
1. 샘플 처리 워크플로(그림 1A)
참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 처리(추출 및 보관), 시약/마스터믹스 준비 및 보관, 반응 혼합물 준비(샘플 및 마스터믹스) 및 검출을 위한 전용 파이펫이 있는 별도의 공간을 사용하는 것이 중요합니다. 개발되는 분석법은 임상 샘플 또는 연구 샘플의 검출에 사용될 수 있다. 모든 샘플은 안전한 실험실 절차를 사용하는 경우에도 감염원을 전염시킬 수 있는 것처럼 취급해야 합니다. 샘플 처리 단계는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용을 포함하여 엄격한 BSL-2 규칙에 따라 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행해야 합니다.
- 샘플 비활성화
- SARS-CoV-1 2mL를 가져가십시오.ampBSL-2 실험실로. 65°C에서 30분 동안 시료를 열 비활성화합니다.
참고: 샘플은 다양한 출처에서 나올 수 있으므로 비활성화할 부피가 후속 RNA 추출을 보장하기에 충분한지 확인해야 합니다. 대부분의 추출 키트에는 최대 200μL의 소량의 시료가 필요하므로 약 1mL의 시료 부피면 비활성화에 충분합니다. 계면활성제, 키트 및 용해 완충액은 실험실 자체 SOP에 따라 직접 비활성화 및 RNA 추출에도 사용할 수 있습니다. - 샘플을 생물 안전 캐비닛(BSC)으로 가져가 잠재적인 에어로졸이 가라앉을 수 있도록 실온에서 10분 동안 그대로 두십시오. 즉시 처리하지 않을 경우 최대 24시간 동안 4°C에 샘플을 보관하십시오.
참고: 샘플 보관을 위해 특정 용기가 필요하지 않습니다. 샘플은 비활성화 중에 사용되는 튜브 또는 용기에 보관할 수 있습니다. 이 작업을 위해 대부분의 샘플은 바이러스 수송 매체(VTM) 튜브 또는 1.5mL 튜브에 보관되었습니다.
- SARS-CoV-1 2mL를 가져가십시오.ampBSL-2 실험실로. 65°C에서 30분 동안 시료를 열 비활성화합니다.
- RNA 추출
참고: 특정 프로토콜이 있는 많은 RNA 추출 기기 및 키트를 즉시 사용할 수 있습니다. 여기에서는 제조업체의 지침에 따른 자동화 된 절차가 제공됩니다.- 미리 채워진 96 깊이의 우물 오리피스 플레이트를 꺼냅니다. 부드럽게 거꾸로 뒤집어 마그네틱 비드를 섞습니다. 혼합 후 평평한 표면에서 플레이트를 부드럽게 흔들어 플레이트 바닥에 벽에 있을 수 있는 시약과 자성 비드를 농축합니다.
- 플레이트의 진동과 액체 유출을 방지하기 위해 알루미늄 호일 밀봉 필름을 조심스럽게 떼어냅니다. 웰당 20μL의 프로테이나제 K와 200μL의 s를 96웰 플레이트의 2열과 8열에 추가합니다. 그런 다음 96-웰 플레이트를 32-채널 자동 핵산 추출 기기의 베이스에 놓습니다.
참고: 샘플을 추가한 후 1시간 이내에 컴퓨터에서 프로그램을 실행합니다. - 마그네틱 바 슬리브를 32채널 자동 핵산 추출 기기의 카드 슬롯에 삽입합니다. GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (퀵 버전) 프로그램을 선택하고 실행하십시오.
- 추출 완료 후 6열과 12열의 핵산 샘플(약 100μL/샘플)을 꺼내 뉴클레아제가 없는 깨끗한 96웰 플레이트에 분배합니다. 샘플을 사용할 때까지 최대 24시간 동안 4°C에서 보관하거나 -20°C에서 더 오랜 시간 동안 보관합니다.
참고: 100μL 멀티채널 피펫을 사용하여 새로운 100-200μL 플레이트로 이송하는 것이 좋습니다.ample 플레이트의 컬럼과 직접 일치할 수 있으므로 le.
- cDNA 생성
알림: s의 경우amp장기간 보관된 경우 여러 번의 동결/해동 주기를 피하십시오. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 키트를 사용하여 cDNA 생성을 수행합니다.- 얼음/냉각 블록에 놓인 100 또는 200 μL PCR 튜브에 반응당 2 μL의 5x RT 마스터 믹스(예: Perfect Real Time), 5 μL의 샘플 RNA, 3 μL의 RNase free ddH2O(총 부피 10 μL)를 추가합니다.
- PCR 튜브를 37°C에서 15분(역전사), 85°C에서 5초(역전사효소의 열 비활성화), 4°C에서 무한 시간 동안 실행하도록 설정된 열 순환기에 넣습니다.
알림: 샘플을 즉시 처리하거나 사용할 때까지 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하거나 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
2. ddPCR 분석 및 워크플로우 최적화
참고: 물방울을 읽기 전/후에 분석을 최적화하십시오. 결과에 따라 작업의 어느 시점에서나 최적화하여 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 다음은 ddPCR 실험을 최적화할 때 고려해야 할 몇 가지 일반적인 요소입니다.
- ddPCR 프라이머 및 프로브를 검증합니다(표 1).
참고: 프라이머 ORF1ab 및 N은 중국 CDC 17, Lu etal.18의 인간 내인성 조절 유전자(RPP30), Nyaruaba et al.13의 RBD2에서 채택되었습니다. RBD2를 제외한 모든 프라이머 및 프로브는 이미 ddPCR 테스트 및 최적화되었습니다 7,8,18. - ddPCR 테스트를 실행하여 양성 대조군(4개의 표적을 모두 갖는 샘플)을 포함하는 대조군, No Template Control(NTC; 뉴클레아제가 없는 물 또는 표적이 없는 샘플) 및 추출/음성 대조군(비감염성 배양 인간 세포에서 추출한 총 핵산 또는 건강 지원자로부터 풀링된 샘플).
참고: 표적 유전자의 알려진 사본이 있는 표준 대조군 샘플이 선호됩니다. 그러나 표준이 없는 경우에는 사용 가능한 샘플을 사용하여 컨트롤 또는 샘플 행렬을 정의합니다. 테스트 샘플과 함께 컨트롤을 실행합니다. - PCR의 어닐링 단계(단계 3.2)에 55°C 내지 65°C의 온도 구배를 삽입하여 어닐링 온도(도 2D)를 최적화한다.
알림: 어닐링 온도 최적화는 최소한의 비로 액적 분리가 최대(쉬운 표적 식별)인 최적의 온도를 찾는 데 도움이 됩니다. 결과를 얻은 후 더 나은 최적화를 위해 온도 범위를 좁힙니다(예: 55°C에서 60°C). - 프라이머 및 프로브 농도를 최적화합니다. 분석에서 양성 및 음성 액적 사이의 최적 분리가 이루어지지 않으면 프라이머(300-900nM) 및/또는 프로브(100-400nM) 농도를 변경합니다.
참고: 프라이머/프로브 농도를 낮추면 표적 액적 진폭이 낮아지고 이를 높이면 표적의 진폭도 증가합니다. 이는 진폭 기반 멀티플렉싱에 도움이 될 수 있습니다. - 블랭크 한계(LoB), 검출 한계(LoD), 특이도 및 감도를 포함한 다양한 매개변수를 고려하여 분석 감도를 표준물질과 테스트 샘플을 모두 사용하여 테스트합니다.
3. ddPCR 워크플로우(그림 1B) 및 분석 개발(표 2)
참고: 다른 ddPCR 검출 시스템과 마찬가지로 이 워크플로우도 반응 혼합물 준비, 액적 생성, PCR 증폭 및 액적 판독을 포함한 4단계(그림 1B)로 구성됩니다.
- 반응 혼합물 준비
참고: 모든 분석을 깨끗한 별도의 방과 BSC 내부에서 준비합니다. 깨끗한 장갑, 깨끗한 피펫, 뉴클레아제가 없는 물 및 소독제 사용을 포함한 표준 예방 조치를 준수하십시오. 분취 시약을 별도의 튜브에 넣고 -20 oC에서 보관하여 반복되는 동결 해동 주기를 방지합니다. 표 2와 같이 분석법을 준비합니다. 프라이머 및 프로브 원액은 100μM의 고농도로 보관해야 합니다. 작업 용액은 20-40 μM (뉴 클레아 아제 자유 수로 희석)의 분취량으로 저장할 수 있습니다.- 모든 분석의 공통 단계
알림: 분석을 준비하기 전에 샘플 수에 따라 필요한 마스터믹스의 총 부피를 계산하십시오. 여기서, 각 마스터믹스 성분 부피에 1.05를 곱하여 피펫팅 오류를 설명했습니다.- 반응 물질을 해동하고 실온으로 평형을 이룹니다. 균질성을 보장하기 위해 반응 성분을 짧게(30초) 소용돌이치고 튜브 바닥에서 내용물을 수집하기 위해 잠시 원심분리합니다.
- 작업 용액으로부터 표 2 에 자세히 설명된 바와 같이 특정 반응 부피를 혼합하여 분석 당 프라이머-프로브(PP) 혼합물을 준비합니다.
- 프로브용 2x ddPCR 슈퍼믹스 11μL(1x), PP 믹스(작업 용액의 표 2 에 나타낸 바와 같은 분석에 따라 다름) 및 뉴클레아제 유리수를 웰당 19.8μL의 최종 부피로 혼합하여 마스터믹스를 준비합니다. 샘플 수에 따라 뉴클레아제가 없는 96웰 ddPCR 플레이트의 웰에 마스터믹스를 분배합니다.
알림: 샘플 플레이트의 경우 한 컬럼의 8개 웰에 모두 용액이 있는지 확인하십시오. 몇 개의 웰만 사용하는 경우(예: 샘플 5개), 다른 3개의 웰을 각각 22μL의 뉴클레아제가 없는 물 또는 대조군 완충액으로 채웁니다. - 최종 반응 혼합물 부피(22 μL)를 얻기 위해, 마스터믹스가 함유된 웰당 2.2 μL의 cDNA 샘플을 추가한다. 일회용 PCR 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉합니다.
알림: 지정된 방에서 샘플 추가를 수행합니다. 대조군(예: 양성, NTC 및 추출)을 포함합니다. 또한 RNA 샘플의 농도가 낮은 경우 마스터믹스의 물의 부피를 줄이고 그에 따라 샘플 부피를 최대 5.5uL까지 늘립니다. - 일단 반응 혼합물이 웰 당 분배되면, 짧게(15-30 s) 와동하고, 원심분리기(10-15 s)하여 플레이트의 바닥에서 내용물을 수집한다. 액적 생성을 진행합니다.
- 모든 분석의 공통 단계
- 자동 액적 생성(보충 그림 1)
알림: 다른 액적 발생기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 연구는 자동 액적 발생기(AutoDG)로 수행되었습니다. 앰플리콘 오염을 방지하려면 액적 발생기와 판독기가 별도의 영역에 전용 공간을 확보해야 합니다. 소모품을 적재할 때 교차 오염을 방지하기 위해 소모품 위로 손이 움직이지 않도록 기기 뒤쪽에서 앞쪽으로 적재를 시작하는 것이 좋습니다.- 프로브용 AutoDG 오일, DG32 카트리지, 피펫 팁, 냉각 블록, 샘플 플레이트, 액적 플레이트(새로운 깨끗한 ddPCR 플레이트) 및 쓰레기통을 포함하여 AutoDG를 설정하는 데 필요한 모든 소모품을 구합니다.
- AutoDG 터치 스크린에서 샘플 플레이트 구성을 터치하고 샘플이 있는 컬럼을 선택합니다.ample 플레이트 를 누르고 OK를 누릅니다.
알림: 화면이 노란색으로 바뀌면 소모품을 넣어야 하는 LOAD를 나타냅니다. - AutoDG 도어를 열고 해당 위치에 소모품을 넣습니다.
알림: 소모품을 적재해야 하는 각 위치에는 노란색 표시기가 있으며 나중에 소모품을 적재하면 녹색으로 바뀝니다. 이것은 터치 스크린과 유사합니다. - 샘플 플레이트와 액적 생성 플레이트를 로드합니다.
알림: 액적 생성판은 냉각 블록에 놓아야 합니다. 냉각 블록이 분홍색이 아닌 보라색(사용 준비)인지 확인합니다(색상이 보라색으로 다시 바뀔 때까지 냉동실에 보관해야 함). - AutoDG 도어를 닫고 화면이 녹색(소모품 로드됨)인지 확인하고 오일 유형이 프로브용 오일 인지 선택한 후 액적 생성 시작을 누릅니다.
- 물방울이 생성될 때까지 기다립니다. 화면에 Droplets Ready 가 표시되면 문을 열고 물방울이 들어 있는 플레이트를 제거합니다.
- 185oC에서 5초 동안 작동하도록 설정된 플레이트 실러를 사용하여 피어싱 가능한 호일 씰로 플레이트를 밀봉합니다. PCR 증폭을 진행합니다.
참고: PCR amplification은 액적 생성 후 30분 이내에 시작해야 합니다.
- PCR 증폭
- 밀봉된 액적 플레이트를 96개 깊이의 웰 열 순환기에 삽입하고 샘플 부피를 40μL로 설정하고 뚜껑 온도를 105°C로 설정합니다.
- PCR 프로그램을 사용하여 액적을 증폭합니다: 95°C에서 10분 동안 변성(효소 활성화), 94°C에서 30초 동안 변성 40주기 및 57°C에서 1분 어닐링/연장, 98°C에서 10분 동안 효소 비활성화, 4°C에서 무기한 유지 단계. PCR 후 액적을 판독하거나 4°C에서 최대 24시간 동안 보관합니다.
알림: 사용amp 2°C/s의 속도, 모든 단계에서amp 속도는 열 순환기에 따라 다를 수 있습니다. 물방울을 읽기 전에 물방울이 안정화될 수 있도록 4°C에서 최소 30분 동안 플레이트를 유지합니다.
- 물방울 판독
- 열 순환 96웰 플레이트를 액적 판독기로 옮기고 액적 판독기에 연결된 컴퓨터에서 함께 제공되는 소프트웨어를 열거나 시작합니다.
- 설정 모드에서 새로 만들기를 선택한 다음 아무 웰이나 두 번 클릭하여 웰 편집기 대화 상자를 엽니다. 읽을 웰을 선택하고 실험: ABS, 슈퍼믹스: 프로브용 ddPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음), 대상 1 유형: Ch1 알 수 없음, 대상 2 유형: Ch2 알 수 없음을 선택합니다.
알림: 네거티브, 블랭크, NTC 또는 포지티브는 대조군 샘플의 대상 1/2 유형 드롭다운 메뉴에서 선택할 수 있습니다. - 플레이트 레이아웃에 따라 대상 또는 샘플 이름을 할당하고 적용(Apply)을 선택합니다. 완료되면 확인을 선택하고 만든 템플릿을 저장합니다. 실행을 클릭하고 메시지가 표시되면 올바른 색상(FAM/HEX)을 선택합니다.
알림: 하루를 처음 실행하기 전에 실행하기 전에 시스템을 프라이밍하는 것이 좋습니다. 또한 리더의 모든 표시등이 녹색인지 확인하고 그렇지 않은 경우 툴팁 상태의 권장 응용 프로그램을 따르십시오. - 데이터 수집이 완료되면 리더에서 플레이트를 제거합니다. 필요에 따라 데이터를 분석합니다.
참고: 예비 결과를 화면에서 볼 수 있기 때문에 첫 번째 웰에서 양성 샘플을 실행하면 실시간 품질 검사에 사용할 수 있습니다.
4. 데이터 분석(보충 그림 2 및 3)
- 모든 우물의 데이터에서 총 물방울 수를 확인하십시오. 액적 수가 <10,000이면 결과를 버리고 분석을 반복합니다. 긍정적이고 부정적인 결과를 받아들이도록 컷오프를 설정하십시오. 예를 들어, 최대 3개 이상의 양의 물방울 수는 양성 결과에 대한 컷오프로 간주될 수 있습니다.
참고: 심플렉스, 듀플렉스, 트리플렉스 프로브 믹스 및 쿼드러플렉스 어세이를 포함한 모든 어세이에 대한 데이터는 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 생성됩니다. 그러나 이 소프트웨어는 심플렉스 및 듀플렉스 분석에만 적합합니다. 고차 멀티플렉스 분석(>3개 표적)의 경우 외부 소프트웨어가 필요합니다. - 심플렉스 및 듀플렉스 분석
참고: 외부 소프트웨어는 단면 및 이중 데이터를 분석할 수도 있습니다. 그러나 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하는 것이 이러한 분석에 더 쉽기 때문에 이 기사에서 사용됩니다.- 분석할 .qlp 파일을 두 번 클릭하여 열고 분석을 선택합니다.
- 1D 진폭 및 2D 진폭의 임계값 도구를 사용하여 올바른 채널의 각 웰에 대해 양수 및 음수 물방울을 구별할 수 있습니다. NTC 및 양성 대조군 샘플은 임계값 설정을 위한 지침으로 사용할 수 있습니다.
참고: FAM 결과는 채널 1에서 볼 수 있고 HEX/VIC는 채널 2에서 볼 수 있습니다. - 임계값 설정 후 결과를 .csv 파일로 내보내고 Excel에서 추가로 분석하거나 결과 창에서 직접 읽어 기록할 수 있습니다.
- Triplex 프로브 믹스(보충 그림 2) 및 Quadruplex 분석(보충 그림 2)
참고: 삼중 프로브 믹스와 사중 분석을 분석하기 전에 외부 소프트웨어를 다운로드하십시오. 설치하기 전에 최소 시스템 요구 사항을 참조하십시오.- .qlp 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 외부 소프트웨어로 열기 를 선택하거나, 외부 소프트웨어를 열고 찾아보기 옵션을 클릭하여 폴더에서 .qlp 파일을 찾거나, .qlp 파일을 끌어서 이미 열려 있는 외부 소프트웨어에 놓기만 하면 됩니다.
- 플레이트 편집기 탭의 오른쪽에서 분석할 웰을 선택합니다.
- 삼중 프로브 혼합의 경우 실험 유형으로 DQ(Direct Quantification) 를 선택하고 분석 정보로 프로브 혼합 삼중 을 선택하고 그에 따라 대상 이름을 입력한 다음 적용을 클릭합니다.
- 4중 분석기의 경우 실험 유형으로 DQ(Direct Quantification) 를 선택하고 분석 정보로 진폭 멀티플렉스(Amplitude Multiplex )를 선택한 다음 그에 따라 대상 이름을 입력한 다음 적용을 클릭합니다.
- 2D 진폭 탭의 왼쪽에서 그래프 도구를 사용하여 Select to Assign Cluster 창 팝업 제안에 따라 다른 대상 클러스터에 특정 색상을 할당합니다.
참고: 기본 클러스터 모드는 사용자의 기본 설정에 따라 적용할 수 있습니다. - 목표 색상이 할당되면 오른쪽 하단의 Well Data Window 에서 정량화 데이터를 읽을 수 있습니다. 웰 데이터 테이블의 오른쪽 상단에 있는 삼중 막대 아이콘을 사용하여 추가 분석을 위해 데이터를 Excel/csv로 내보냅니다.
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Representative Results
개념 증명 연구에서, 다중 분석 분석 성능은 임상 및 연구 샘플19에 대해 테스트되었습니다. 멀티플렉스 분석의 성능은 RT-PCR19의 성능보다 우수했습니다. 액적 수가 적으면 액적 생성 중에 문제가 발생할 수 있으므로 이 기사에서는 경험적 데이터를 기반으로 웰당 10,000개의 액적 컷오프를 설정했습니다.
비 간섭을 최소화하면서 양수 물방울과 음수 물방울을 잘 분리하면 데이터 분석에 도움이 될 수 있습니다. 따라서 좋은 실험에서는 분석 최적화가 핵심입니다19. 도 2D의 온도 구배 분석 결과에서 볼 수 있듯이, 높은 어닐링 온도(예를 들어, 65°C)는 이중 분석(N(FAM) 및 RPP30(HEX))이 실행되었을 때 음의 액적으로부터 양의 액적을 명확하게 구별할 수 없었다. 그러나, 어닐링 온도가 감소함에 따라, 양극 및 음극 액적 사이의 최적 분리가 달성되었다. 57°C의 온도가 최적인 것으로 나타났다. 이는 다른 분석에서도 관찰될 수 있다(19).
2색(FAM/HEX) RT-ddPCR 검출 시스템을 사용하여 단일 샘플 내에서 1개(그림 2A, B), 2개(그림 2C), 3개(그림 3A) 및 4개(그림 3B)의 SARS-CoV-2 표적을 검출할 수 있습니다. 데이터 분석 중에 액적을 판독하는 데 사용되는 동반 소프트웨어는 그림 2와 같이 심플렉스 및 듀플렉스 분석만 분석할 수 있습니다. 즉, 고차 멀티플렉스 분석(>3 표적)의 경우 그림 3, S2 및 S3과 같이 데이터 분석에 외부 소프트웨어를 사용해야 합니다. 또한 외부 소프트웨어를 사용하여 심플렉스 및 듀플렉스 데이터를 분석할 수도 있습니다. 심플렉스 및 듀플렉스 데이터의 경우, 그림 2와 같이 타겟이 각 채널에서 양수 또는 음수 액적으로 분리되기 때문에 분석이 매우 간단합니다. NTC 샘플은 그림 2A와 같이 데이터 분석을 위한 임계값을 설정하는 데 도움이 될 수 있는 음의 액적 위치를 파악하는 데 도움이 될 수 있습니다. 듀플렉스 분석의 경우 개별 채널(그림 2B i, ii) 또는 2D 진폭(그림 2B iii)에서 분석을 수행할 수 있습니다.
고차 멀티플렉스 분석의 경우 데이터 분석이 간단하지 않으며 액적 표적 할당에 주의를 기울여야 합니다. 외부 소프트웨어를 설치한 후 분석할 웰을 선택하고, 적절한 실험 유형을 선택하고, 그림 S2 및 S3과 같이 실험 유형에 따라 대상 클러스터를 할당합니다. Select to Assign Cluster(클러스터 할당을 선택) 창 팝업은 상위 멀티플렉스 분석에서 클러스터를 할당하는 방법을 안내합니다. 그래프 도구를 사용하여 삼중 프로브 혼합 분석에 최대 8개의 액적 클러스터를 할당하고(그림 3A), 사중 진폭 기반 분석에 최대 16개의 액적 클러스터를 할당합니다(그림 3B).
클러스터와 임계값을 할당한 후 외부 소프트웨어의 오른쪽 하단에 있는 웰 데이터 창에서 각 대상에 대한 정량화 데이터를 복사/μL 형태로 읽을 수 있습니다. 이 데이터는 시작 샘플에서 표적의 복사본 수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 2.2 μL의 샘플이 22 μL의 최종 부피에 사용되었고, 소프트웨어가 ORF1ab에 대해 30.5 copies/μL를 기록한 경우, PCR 믹스에 ORF1ab의 30.5 x 22 = 671 카피가 존재한다. 혼합물에는 2.2 μL의 원본 샘플이 포함되어 있으므로 시작 샘플에는 671 개의 ORF1ab 사본이 있었고 원래 샘플에는 671 / 2.2 = 305 copy / μL의 ORF1ab가 있었다. 이 방법은 모든 분석에서 각 표적의 농도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
| 과녁 | 시퀀스 5'에서 3' | 프로브 염료 | 제품 길이 (bp) | 참조 | |
| ORF1ab | 전달 | CCCTGTGGGTT TTACACTTAA 띠칵타 |
5'- FAM 및 BHQ1-3' 5'- 육각 및 BHQ1-3' |
119 | [16] |
| 후진 | ACGATTGTGCAT CAGCTGA (전신) |
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| 탐침 | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG (티타그) |
||||
| N | 전달 | GGGGAACTTCTC (걔가액티티씨) CTGCTAGAAT |
5'- FAM 및 BHQ1-3' 5'- 육각 및 BHQ1-3' |
99 | [16] |
| 후진 | 카가캇트그씨 TCTCAAGCTG (TCTCAAGCTG) |
||||
| 탐침 | TTGCTGCTGCT TGACAGATT (TGACAGATT) |
||||
| RPP30 (RPP30) | 전달 | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- 육각 및 BHQ1-3' | 87 | [8] |
| 후진 | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA (영어) |
||||
| 탐침 | TTTCCTGTGAAG GCG 아트가씨 |
||||
| RBD2 (영문) | 전달 | CTCAAGTGTCT 크랙 GTGGATCACG |
5'- FAM 및 BHQ1-3' | 121 | [17] |
| 후진 | CCTGTGCCTGT 타아캇 |
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| 탐침 | 아카그캣캇트 AGTGTCAGCAA (아그트그카그카) 증권 시세 표시기 |
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표 1: 다양한 SARS-CoV-2 분석을 개발하는 데 사용되는 프라이머 및 프로브 서열.
| 분석당 프라이머-프로브의 최종 농도(nMa) | |||||
| 과녁 | 프라이머/프로브 | 심플렉스b | 듀플렉스c | 트리플렉스 프로브 믹스d | 4플렉스 진폭e |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab 육각 | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N 헥스 | 125 | ||||
| RPP30 (RPP30) | RPP30 에프 | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 팩스 | |||||
| RPP30 육각 | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 (영문) | RBD2 에프 | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 아르 자형 | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 육각 | |||||
| a 모든 분석에서 표적은 사용자 선호도에 따라 상호 교환될 수 있습니다. 사용된 표적은 이 실험의 시연을 위한 것입니다. | |||||
| b FAM 또는 HEX 채널의 심플렉스 분석에서 한 번에 하나의 표적만 검출할 수 있습니다. RBD2는 FAM 채널 결과를 시연하는 데 사용되며 RPP30은 HEX 채널에 사용됩니다. | |||||
| c FAM 및 HEX 채널의 이중 분석에서 한 번에 두 개의 표적을 검출할 수 있습니다. | |||||
| d 두 채널을 사용하여 3개의 표적을 검출할 수 있습니다. 즉, 표적 1은 FAM(1× 프로브 농도), 표적 2는 HEX(1× 프로브 농도), 표적 3은 두 채널에서 모두 검출됩니다(0.5× HEX 및 0.5× FAM 프로브 농축액의 혼합물로 최종 1×). | |||||
| e 각 채널에서 1× 및 O.5× 프로브 농도로 각 채널(FAM 및 HEX)에서 두 개의 표적이 검출됩니다. | |||||
표 2: 분석당 상이한 프라이머 및 프로브 쌍의 최종 농도.
그림 1: 시료 처리 및 액적 디지털 PCR 워크플로우. (A) 샘플 처리 워크플로에는 샘플 수집 및 BSL-2 시설로의 운송, 비활성화, 추출 및 cDNA 생성이 포함됩니다. (B) 액적 디지털 PCR 워크플로우는 마스터믹스 준비, 마스터믹스를 ddPCR 플레이트에 로딩 및 샘플 추가, 액적 생성, PCR로 액적 내부의 표적 증폭, 마지막으로 액적 판독기를 사용하여 증폭된 액적을 판독하는 것으로 시작됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 어닐링 온도 최적화를 포함한 심플렉스 및 듀플렉스 분석 결과. (A) 단일 표적(RBD2)이 FAM 라벨링되었을 때의 심플렉스 분석 결과. (B) 단일 표적(RPP30)에 HEX 표지를 했을 때의 심플렉스 분석 결과. (C) N(i)가 FAM 표지되고 RPP30(ii)이 HEX 표지된 후 1D 및 2D(iii) 채널에서 두 표적의 이중 분석 결과. (D) 어닐링 온도 구배(65°C 내지 55°C) ORF1ab(FAM) 및 RPP30(HEX)으로 표지된 듀플렉스 분석의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Triplex 프로브 믹스 및 Quadruplex 진폭 기반 멀티플렉스 분석 결과. (A) 3개의 표적이 FAM:HEX의 다음 비율로 표지되었을 때의 삼중 프로브 혼합 분석 결과; RBD2(1:0), N(0.5:0.5) 및 RPP30(0:1). (B) 4개의 표적이 FAM:HEX의 다음 비율로 표지된 후의 Quadruplex 진폭 기반 분석 결과; RBD2(0.5:0), N(1:0), RPP30(0:0.5) 및 ORF1ab(0:1). 도 1 및 0.5는 각각 프로브 농도 250 nM 및 125 nM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 자동 액적 발생기를 사용한 액적 생성. (A) AutoDG를 설정하는 데 필요한 소모품. (B) AutoDG 터치 스크린에서 Sample Plate 구성을 터치하고 샘플이 있는 컬럼을 선택합니다.ample 플레이트를 선택한 다음 OK를 누릅니다. (C) 선택하면 화면이 노란색으로 바뀌어 소모품을 적재해야 하는 위치를 나타냅니다. (D) AutoDG 도어를 열고 해당 위치에 소모품을 넣습니다. 뒤쪽에서 앞쪽으로 소모품을 싣습니다. 소모품을 추가할 때마다 해당 위치에서 표시등이 노란색에서 녹색으로 바뀌는지 확인하십시오. (E) 사용된 오일 유형이 프로브용 오일인지 확인하십시오. (F) AutoDG 도어를 닫고 AutoDG 터치 스크린이 녹색인지 확인하여 모든 시약이 제자리에 설정되었는지 확인합니다. (G) START Droplet Generation 을 눌러 물방울을 생성합니다. (H) 액적 생성이 완료되면 AutoDG를 열고 액적 플레이트를 제거합니다. (I) 뚫을 수 있는 호일 열 밀봉을 사용하여 액적 판을 밀봉합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 외부 소프트웨어를 사용한 진폭 기반 멀티플렉스 ddPCR 분석 결과 분석 단계. (A) 컴퓨터에 외부 소프트웨어를 설치합니다. (B) .qlp 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 설치된 외부 소프트웨어로 열기 를 선택하거나 외부 소프트웨어를 열고 찾아보기 폴더에서 파일을 찾는 옵션을 클릭하여 엽니다. 또는 .qlp 파일을 끌어서 열려 있는 외부 소프트웨어에 놓아 열 수 있습니다. (C) 열리면 플레이트 편집기 탭의 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 프로브 믹스 트리플렉스를 선택하고 그에 따라 대상 정보를 할당한 다음 적용을 클릭합니다. (D) 2D 진폭 탭의 왼쪽에서 그래프 도구를 사용하여 감지 및 정량화를 위해 다양한 대상에 특정 색상을 할당합니다. 액적 클러스터 타겟이 식별되면 동일한 2D 진폭 탭의 Well Data 창에서 정량화 결과를 볼 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 외부 소프트웨어를 사용한 진폭 기반 멀티플렉스 ddPCR 분석 결과 분석 단계. (A) 컴퓨터에 외부 소프트웨어를 설치합니다. (B) .qlp 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 설치된 외부 소프트웨어로 열기 를 선택하거나 외부 소프트웨어를 열고 찾아보기 폴더에서 파일을 찾는 옵션입니다. 또는 .qlp 파일을 끌어서 이미 열려 있는 외부 소프트웨어에 놓아 열 수 있습니다. (C) 열리면 플레이트 편집기 탭의 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 진폭 멀티플렉스를 선택하고 그에 따라 대상 정보를 할당한 다음 적용을 클릭합니다. (D) 2D 진폭 탭의 왼쪽에서 그래프 도구를 사용하여 감지 및 정량화를 위해 다양한 대상에 특정 색상을 할당합니다. 액적 클러스터 타겟이 식별되면 동일한 2D 진폭 탭의 Well Data 창에서 정량화 결과를 볼 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SARS-CoV-2 검출을 위한 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 리소스는 거의 없습니다. 이 기사에서는 사용되지 않지만 알려진 사본이 있는 표준 샘플을 사용하여 분석을 개발하고 최적화할 수 있습니다. 그러나 이 작업에서는 Vero-E6 세포에서 성장한 SARS-CoV-2 샘플을 인간 게놈 RNA의 배경에 스파이크하여 분석을 개발하기 위한 표준 샘플로 사용했습니다. 적절한 프라이머 및 프로브 서열은 분석을 개발할 때 필수적입니다. SARS-CoV-2 RT-ddPCR에 대한 대부분의 예비 작업은 ORF1ab 및 N 유전자를 표적으로 하는 중국 CDC 프라이머와 프로브를 사용했기 때문에 이 작업에 포함되기에 적합하다는 것을 발견했습니다 7,8,9,10,11. 이들 프라이머의 분석적 특이성과 민감도는 또한 이전 연구에서 ddPCR을 사용하여 비교되었다7. RBD2 프라이머와 프로브13은 사내에서 개발되었으며 RT-ddPCR에 적합한 것으로 판명되었습니다. 분석이 진단을 비롯한 다양한 용도에 사용될 수 있기 때문에, 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30 (RPP30) 특이적 인간 유전자가 모든 멀티플렉스 분석에 포함되었다. 이들 유전자는 진단 실험을 위한 인간 내인성 대조군으로서 사용될 수 있다. 그러나 인간 참조 유전자가 필요하지 않은 환경 샘플링 또는 기타 연구의 경우 이 표적을 다른 SARS-CoV-2 표적으로 대체할 수 있습니다.
모든 분석에서 분석 및 실험 데이터를 검증하기 위한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 이러한 제어는 다음을 포함할 수 있다: 임계값을 설정하고 음의 액적 클러스터를 찾는 데 도움이 되는 NTC(샘플로서의 뉴클레아제 없는 물); 양성 대조군(인간 참조 유전자를 포함한 모든 SARS-CoV-2 표적이 있는 샘플)은 시약 실패, 프라이머 및 프로브 무결성, 양성 액적 표적의 실질적인 역전사 검출/위치를 평가합니다. 및 추출 대조군(건강한 지원자로부터 풀링된 인간 샘플 또는 비감염성 배양된 인간 세포에서 추출한 총 핵산)을 통해 추출 단계 실패 또는 성공을 감지합니다.
QX200 시스템을 포함한 대부분의 ddPCR 시스템은 1 - 120,000 copies/20 μL 반응의 좁은 동적 범위를 가지고 있습니다. 알 수 없는 시료를 검출할 때 시작 시료의 목표 농도를 알 수 없는 경우가 많으며 이는 고농축 시료를 정량화할 때 문제가 될 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 다량의 표적 분자를 포함하는 것으로 의심되는 샘플(예: 세포 배양)을 정량화할 때 그에 따라 시작 샘플을 줄이는 계획을 세우는 것이 좋습니다. 표적 복제 수/게놈을 알 수 없는 경우, 예상되는 디지털 범위에서 각 샘플의 일련의 4회 10배 연속 희석을 통해 최적의 시작량을 결정해야 합니다. 이 네 가지 점을 분석하면 데이터 포인트 중 하나가 최적의 디지털 범위 내에 있는지 확인할 수 있습니다.
높은 프라이머와 낮은 프로브 농도를 사용하는 것은 대부분의 심플렉스 및 듀플렉스 ddPCR 실험의 필수 조건입니다. 이러한 농도의 차이는 양과 음의 액적 클러스터 사이의 진폭 분리 거리를 증가시켜 데이터를 쉽게 분석할 수 있도록 합니다. 그러나 고차 다중 분석을 개발할 때 이러한 농도의 변화는 그림 3 및 4와 같이 양성 액적 표적의 위치를 변화시킬 수 있습니다. 결과적으로, 어닐링 온도를 제외한 한 가지 분석 최적화 옵션은 액적을 구별하기 위해 표적 프라이머 또는 프로브 농도를 변경하는 것입니다. 이 현상은14,15,16 이전에 사용되고 설명되었습니다.
분석 성능에도 불구하고 이 작업은 2단계 RT-ddPCR 워크플로우입니다. ddPCR 전에 추가 역전사 단계는 시료 오염을 위한 공간을 제공합니다. 그러나 신중하고 적절한 시료 처리 기술을 사용하면 문제가 되지 않습니다. 긍정적으로 DNA는 RNA보다 더 안정적인 것으로 알려져 있습니다. RNA를 cDNA로 전환하면 RNA에 비해 보관 중 샘플의 저장 수명이 연장될 수 있습니다. 2단계 RT-ddPCR 실험도 1단계 RT-ddPCR 실험보다 저렴합니다.
RT-qPCR에 비해 RT-ddPCR은 비쌉니다. 따라서 RT-ddPCR을 수행할 때 고려해야 합니다. 예를 들어, 진단하는 동안 샘플의 풍부한 표적이 낮은 경우 RT-ddPCR을 사용할 수 있습니다. 그러나 dPCR 기기 및 시약의 비용이 곧 하락할 가능성이 있으며, 과거에 일반 PCR 및 qPCR에서 발생했던 것처럼 이 기술은 많은 실험실에서 적용될 것입니다. 따라서 dPCR의 현재 및 미래 사용자를 위해 이와 같은 프로토콜을 설정하는 것이 중요합니다. 결론적으로, 개발된 분석은 잠재 사용자가 응용 분야에 따라 표적을 다양화할 수 있는 여지를 제공합니다. 멀티플렉싱은 단일 반응에서 단일 샘플 내의 많은 표적을 효율적으로 검출할 수 있도록 합니다. 지금까지 이것은 SARS-CoV-2 감지의 외부 소프트웨어를 포함하여 AutoDG 시스템을 사용하는 방법에 대한 전체 세부 정보를 제공하는 첫 번째 프로토콜일 수 있습니다. 사중체 분석에서 더 나은 분리를 달성하기 위해서는 분석 최적화에 대한 더 많은 작업이 여전히 수행되어야 합니다. 표준물질의 사용은 또한 개발된 분석법을 개선하는 데 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 갈등이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 보건부의 전염병 통제 메가 프로젝트(보조금 번호 2017ZX10302301-005) 및 중국-아프리카 공동 연구 센터(보조금 번호 SAJC201605)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
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- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
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- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
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