Summary
Denne artikel indeholder trinvise instruktioner til at foretage fuldt korrigerede nøjagtige FRET-målinger på individuelle, frit diffuse biomolekyler ved hjælp af open source, billig smfBox, fra tænd, over justering og fokusering, til dataindsamling og -analyse.
Abstract
SmfBox er et nyligt udviklet omkostningseffektivt open source-instrument til enkeltmolekylet Förster Resonance Energy Transfer (smFRET), som gør målinger på frit spredende biomolekyler mere tilgængelige. Denne oversigt omfatter en trinvis protokol til brug af dette instrument til at foretage målinger af præcise FRET-effektivitetsgevinster i duplex-DNA-prøver, herunder oplysninger om prøveforberedelsen, instrumentopsætning og -justering, dataindsamling og komplette analyserutiner. Den fremlagte tilgang, som omfatter, hvordan man kan bestemme alle de korrektionsfaktorer, der er nødvendige for nøjagtige FRET-afledte afstandsmålinger, bygger på en lang række nylige samarbejdsarbejder i hele FRET-Fællesskabet, som har til formål at etablere standardprotokoller og analysetilgange. Denne protokol, som let kan tilpasses en række biomolekyllære systemer, bidrager til den voksende indsats for at demokratisere smFRET for det bredere videnskabelige samfund.
Introduction
Single-molekyle Förster resonans energioverførsel (smFRET) er en teknik, der måler FRET effektivitet mellem to farvestoffer-en donor og en acceptor-på niveau med de enkelte molekyler. FRET er en fotofysisk proces, der opstår som følge af det overlappende energispektre af to farvestoffer: Donoren er begejstret for lyset af en bestemt bølgelængde og overfører energi ikke-radiativt til acceptoren, hvilket resulterer i emission fra acceptoren. Effektiviteten af denne overførsel er omvendt proportional med den sjette effekt af afstanden mellem de to farvestoffer, så overførselseffektiviteten varierer med afstand1. Således kan denne FRET-effektivitet bruges til at bestemme rumlige oplysninger om det eller de molekyler, som farvestofferne er fastgjort til, inden for et interval på 3-10 nm. Denne skala, og det faktum, at ændringer i FRET effektivitet er følsomme over for Angstrom molekylære bevægelser3, gør teknikken velegnet til at undersøge strukturelle oplysninger om biomolekyler-såsom nukleinsyrer og proteiner-uden komplikationer af ensemble gennemsnit4,5,6. Mens ændringer i relative FRET effektivitetsgevinster kan bruges til at overvåge biomolekylær interaktioner og kropsbygningsdynamik, kaste lys på centrale cellulære processer såsom protein (un)foldning, transskription, og DNA replikation og reparation, absolut FRET effektivitet er blevet brugt til at bestemme præcise afstande for biomolekylær struktur bestemmelse7,8,9,10,11 , overvinde behovet for krystallisering eller frysning, som er nødvendig for nogle andre strukturelle metoder4,12.
smFRET-eksperimenter oftest har to former, konfocal eller total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Mellem begge tilgange kan biomolekylernes molekylære dynamik typisk undersøges på tidshorisonter fra pico- til millisekunder (confocal, frit diffuse molekyler) op til millisekunder til timer (TIRF, overflade immobiliserede molekyler). Dette skyldes de forskellige opsætninger, der er involveret i hver teknik. I TIRF-mikroskopi immobiliseres molekyler på overfladen af et dias og ophidses af en evanescentbølge (Figur 1A). Her er fokus dog på konfokal mikroskopi, da dette er formatet af smfBox. I konfokal mikroskopi, molekyler er ikke immobiliseret og i stedet frit diffus via Brownian bevægelse gennem confocal volumen (~ 1 fL), dannet ved at fokusere en laserstråle gennem en høj numerisk blænde linse i et sted på nogle udpegede dybde i løsningen (Figur 1B). Den resulterende emission er fokuseret tilbage gennem den samme blænde og filtreret gennem en dichroic spejl (Figur 1C for fuld skematisk). Det er derefter fokuseret gennem et pinhole for at fjerne enhver out-of-fokus lys og på en lavine photodiode (APD). Når APD registrerer en foton, udsender den en TTL-puls, hvis timing kan registreres med op til picosecondopløsning. Observationstiden for disse frit diffuse molekyler i nærheden af det konfokale volumen er almindeligvis inden for rækkefølgen af millisekunder.
Figur 1: Skemaer, der viser principperne for mikroskopi og smfBox-opsætningen. (A) Total Internal Reflection Fluorescens (TIRF) Mikroskopiprincip: Excitationslys ledes ind i kanten af målet (Obj.) og gennemgår total intern refleksion ved coverslip-buffer-grænsefladen, der genererer et eksponentielt forfaldent evanescencefelt for at ophidse overfladeknyttede molekyler. (B) Konfokal mikroskopi: Frit diffuserende molekyler er begejstrede for en næsten diffraktion-begrænset stedet fokuseret på prøven. (C) Den smfBox-opsætning, der anvendes i denne protokol, og som viser alle nøglekomponenter: lavinefotodioder (APD), strålekløver (BS), dichroiske spejle (DM), filtre (F), spejle (M), mål (O) og pinhole (P). Klik her for at se en større version af dette tal.
For nylig, smFRET teknikker indarbejdet to farve excitation, hvor lasere matcher donor og acceptor excitation bølgelængder er vekslet5. Dette kan gøres på en af to måder, den første ved at modulere kontinuerlige bølge lasere på KHz tidsskala, som er kendt som skiftevis laser excitation (ALEX)13,14. Den anden metode blander hurtige impulser på MHz-tidsskalaen. dette er nanosekund-ALEX15 eller pulserende interleaved excitation (PIE)16. I alle disse tilgange fører oplysninger fra acceptorlaseren til beregning af den såkaldte stoichimetri, som kan skelne mellem molekyler med en lav FRET-effektivitet og dem, der mangler en acceptor (enten gennem ufuldstændig mærkning eller fotobleaching). Ved hjælp af PIE/ns-ALEX giver derudover adgang til fluorescerende levetid på enkeltmolekyleniveau, og anisotropier kan måles, når de kombineres med polariserende optik. Denne kombination af målinger kaldes multiparameter fluorescensdetektering (MFD)9.
På trods af de mange fordele ved smFRET er det ikke meget udbredt uden for specialiserede laboratorier på grund af de høje omkostninger ved kommercielle instrumenter og mangel på enkle, selvbyggede alternativer. En stigende tendens til udvikling af billige opensource mikroskopi finder sted, og andre platforme er for nylig dukket op, herunder Planktonscope17, OpenFlexure Microscope18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21, og Squid22. Heri beskriver undersøgelsen protokollen for brug af smfBox, en nyligt udviklet omkostningseffektiv konfokal set-up, der er i stand til at måle FRET-effektiviteten mellem to farvestoffer på frit diffuse enkelte molekyler. Detaljerede byggeinstruktioner og al den nødvendige driftssoftware er frit tilgængelige på: https://craggslab.github.io/smfBox/ 23. SmfBoxens optiske arrangement samles fra lettilgængelige komponenter købt hos overkommelige og bredt tilgængelige producenter, mens mikroskophuset (ansvarlig for størstedelen af udgiften i et standardkonfokalt set-up) er blevet erstattet af en brugerdefineret lystæt anodiseret aluminiumskasse (hvilket gør det muligt at foretage målinger under omgivende lysforhold). Denne boks huser vigtige optiske komponenter, herunder excitation dichroic, mål, og pinhole, og en mekanisk laser interlock, muliggør sin sikker drift som en klasse I laser produkt (se figur 1C for en fuld skematisk). SmfBox bruger ALEX til at validere farvestof stoichimetri og til at bestemme nøjagtige FRET korrektion faktorer. Det drives ved hjælp af specialskrevet, open source-software (smOTTER), som styrer alle aspekter af dataindsamlingen og udsender dataene i open source photon-HDF5 format24, der er kompatibel med mange tredjepartsanalyseværktøjer. SmfBox og erhvervelses- og dataanalyseprotokollerne blev for nylig testet mod >20 andre instrumenter (både confocal og TIRF) i et multilaboratoriet blindstudie25. Fret-effektivitetsgevinsterne var i god overensstemmelse med alle de andre instrumenter, på trods af at smfBox kun kostede en brøkdel af prisen på kommercielt tilgængelige opsætninger.
Her er en trin-for-trin protokol skitseret for at erhverve og analysere nøjagtige, absolutte FRET-effektivitetsgevinster på frit spredeNDE DNA-duplex'er ved hjælp af smfBox, hele vejen fra tænd, over justering og fokusering til dataindsamling og analyse. De prøver, der anvendes her, er tre duplex-DNA'er (der udviser høj-, mellem- og lav-FRET-effektivitet, se tabel 1), som blev vurderet i det verdensomspændende blindstudie25; metoden kan dog tilpasses mange molekylære systemer, herunder proteiner og andre nukleinsyrer. Håbet er, at en sådan detaljeret protokol, sammen med de allerede eksisterende byggeinstruktioner til smfBox23, vil bidrage til at gøre denne kraftfulde teknik endnu mere tilgængelig for en bred vifte af laboratorier.
Protocol
1. Strømstyringskomponenter
- Strøm på de seks stik (ingen bestemt rækkefølge): Piezoconcept (z-fokus), APD0, APD1, grøn laser, rød laser og fotodetektor.
2. Software 1-Eksperimentel opsætning
- Start laserkontrolcentret.
- Sørg for kontinuerlig bølge - Veksel konstant strøm (CW-ACC) tilstand er valgt.
- Tænd begge lasere.
- Kontroller/indstil laserkræfterne.
BEMÆRK: Lasereffekten skal justeres som målt lige før excitation dichroic, da ND-filtre og strålekløvere i excitationsstien reducerer lasereffekten fra det antal, der er angivet på laser kontrolpanelet. De tal, der gives her, er magt ved excitation dichroic, men strømmen på laserstyringen, der svarer til dette, skal udarbejdes.- 220 μW grøn laser (515 nm, 40 mW)
- μ70 W for rød laser (638 nm, 10 mW)
- smOTTER erhvervelse software
- Tilslut lasere, detektorer, z-stage og kamera. Konfigurer dem korrekt (kan variere afhængigt af indstillingerne for den bestemte NI-kortopsætning).
3. Tilpasning af emissionsvejen (ikke rutinemæssigt påkrævet)
- Opsætning af justering
- Pipette 10 μL frit Cy3B-farvestof (~100 nM) på mikroskopet og fokus som beskrevet i trin 4.3-4.5 nedenfor.
BEMÆRK: En anden donor farvestof med nogle lækage i acceptor kanal ville også arbejde. - Åbn fanen Justering i smOTTER, sænk lasereffekten, og rediger y-akseskalaen, indtil udlæsningen ses fra detektorerne.
BEMÆRK: Målet her er at øge signalet, så skalaen muligvis skal ændres igen, når signalet stiger. - Skru de fire skruer af forenden af smfBoxen, og fjern frontpanelet.
- Pipette 10 μL frit Cy3B-farvestof (~100 nM) på mikroskopet og fokus som beskrevet i trin 4.3-4.5 nedenfor.
- Pinhole justering
- Drej x-knappen på pinhole positioner, mens du ser signalet på fanen Justering, forsøger at øge signalet i grønt og rødt.
- Drej nu y-knappen for at justere pinhole i den anden retning.
- Gå tilbage til x-knappen for at kontrollere, om signalet skal øges yderligere.
- Pinhole-linse justering
- Drej objektivet x drejeknap i én retning, vil dette mindske signalet.
- Drej pinhole x knappen i samme retning for at øge signalet igen.
- Hvis det nye max-signal er højere end før, skal du fortsætte med at bevæge både pinhole og linse i den retning. Hvis det er lavere end før, bevæger du sig gentagneligt i den modsatte retning.
- Gentag ovenfor for y.
- Justering af APD-objektiver
- Start med den grønne APD, flytte x drejeknap, indtil det grønne signal er på et maksimum.
- Gentag for y-knappen.
- Gå tilbage til x-knappen, gå frem og tilbage for at finde de tærskelpunkter, hvor signalet begynder at falde, og lad det stå på en position halvvejs mellem disse to punkter.
- Gentag for x-knappen.
- Gentag ovenstående trin for den røde APD linse, ser det røde signal.
- Placer frontpanelet tilbage på smfBox og udskift skruerne.
BEMÆRK: Udfør ovenstående justering monthyl, og som en sikkerhedsforanstaltning, hvis der er mistanke om, at mikroskopet har udviklet en justeringsfejl mellem målingerne.
4. Erhvervelse af måledata
- For den første prøve, rense scenen med linse rengøring væv gennemblødt i methanol; tørre forsigtigt hen over målet fra den ene ende til den anden.
- Påfør 3-4 dråber nedsænkning olie til mikroskopi på midten af målet; genopfyldes efter behov mellem prøverne.
- Prøveforberedelse
- Pipette 10 μL prøve (første brug type I ultrapure vand) på midten af et rent dækglas.
- Placer forsigtigt dækglasset på den objektive linse, der sænker det i en vinkel på olien for at forhindre, at du fanger luftbobler mellem dækglasset og målet.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal du skubbe dækglas rundt for at skubbe luftbobler i olien væk fra brændpunktet.
- Hvis du vil udføre ALEX-eksperimenter (alternating-laser excitation) skal du konfigurere laseren i panelet lasertjenestecyklusser på følgende måde.
- Donor (grøn laser) 0 off, 45 på, 55 off
- Acceptor (rød laser) 50 off, 45 på, 5 off
- ALEX periode (μs): 100
- Klik på fanen Z-fokus på båndet. i anskaffelsespanelet skal du skifte lasere til Live og starte kameraet; justere eksponeringen, så et lyspunkt vises centralt omgivet af sort.
BEMÆRK: Kameraet opfanger lys, der reflekteres af glas/vand-grænsefladen mellem dækslet og prøven, og den synlige lyscirkel har sin mindste diameter, når brændpunktet er ved denne grænseflade. Det er derfor nødvendigt at starte under denne grænseflade, øge z-højden til grænsefladen og derefter lidt yderligere at fokusere over dækslen og i den prøve, der måles.- Startende fra en lav Z-position, øge højden, indtil det lyse punkt når sin minimale størrelse, derefter hæve højden yderligere med op til 20 μm at fokusere laseren over olie og dække glas og i prøven.
- Stop kameraet, når det er i fokus.
- For at bekræfte, at opsætningen er udført korrekt, skal du overvåge sporet af type I ultrapure vand for ikke at se fluorescenssignaler; gentag bekræftelse af renhed for de buffere, hvor prøverne fremstilles.
- Fjern forsigtigt dækglasset med gummiaffyrede pincet for at undgå skadelige mål, og placer derefter prøven af interesse, der er forberedt som ovenfor, på målet. Genopfyld nedsænkningsolien efter behov for at opretholde et ensartet kontaktområde mellem dækglas og mål (særlig opmærksomhed på stikprøvens kontaktområde på dækglas og målområde)
- Koncentration bingo
- For at sikre, at der opnås data om enkeltmolekyler, skal prøverne være i en koncentration, hvor der observeres 1-5 udbrud i sekundet i det levende sporpanel af smOTTER (dette minimerer risikoen for, at mere end et molekyle er til stede i detektionsvolumen på én gang). Tag målingerne, når den relevante koncentration er fastlagt.
- For at forhindre fordampning under lange forsøg skal du forberede et lufttæt prøvekammer. Tryk silikoneiolatorerne (8-9 mm diameter hul) ned på midten af et dækglas (farvet ind med en pipettespids). Derefter forsigtigt pipette en prøve i midten, undgå enhver kontakt med silikone. Derefter placeres et andet dækglas på toppen og tryk for at danne en forsegling.
- Kontroller det levende stoichimetri vs FRET-effektivitet (ES) histogramme for at se, om prøven opfører sig som forventet, dvs. forventet FRET-effektivitet og rimelig stoichimetri (~ 0,5).
- Når eksemplet er klar, skal du indtaste oplysningerne for eksperimentet i panelet Gem indstillinger. Vælg en passende mappe og et passende filnavn ved at klikke på ellipseikonet (filer, der er gemt i hdf5/h5-format) i panelet Gem indstillinger.
- Angiv oplysninger om eksempelnavn, eksempeldetaljer, donor- og acceptoretiketter, buffer-, donor- og acceptor excitationsbølgelængder, detektionsbølgelængder og laserkraft samt bruger- og brugertilhørsforhold.
- Gå tilbage til fanen live trace på båndet, og angiv eksperimentlængde (i minutter) i anskaffelsespanelet for at mindske potentielle tab af data i tilfælde af en fejl. Vælg Gem laserkræfter, hvis det er nødvendigt.
- Tryk på Start for at tage dataene.
BEMÆRK: For at muliggøre nøjagtig FRET-bestemmelse skal der måles mindst to prøver, der indeholder de samme donor- og acceptorfarvestoffer, men med tilstrækkeligt forskellige FRET-effektivitetsgevinster.
5. Analyse/software 2
- Start Jupyter notebook med FRETBursts python pakke (opsætningsinstruktioner kan findes her: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html)
- Hvis korrektion for absolut FRET effektivitet ikke er nødvendig (dvs. kun relative ændringer i FRET er tilstrækkelige til målingen) lancering Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb. Brug denne til at eksportere tal eller data som csv-filer til yderligere analyse eller plotte i anden software.
BEMÆRK: Hver notesbog indeholder detaljerede instruktioner til at guide brugeren gennem analyseprocedurerne. For en mere detaljeret diskussion af analyseprocedurer, herunder burst søgealgoritmer, baggrundskorrektion, og alle korrektion parametre se23,25. - Hvis der er behov for korrektion for absolut FRET-effektivitet, skal du begynde med at beregne krydstaleparametrene alfa (lækage af donoremission til acceptkanalen) og delta (andel af direkte excitation af acceptoren under donor excitation).
- Første lancering Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb og bestemme alfa og delta parametre.
BEMÆRK: Hvis disse er inkonsekvente mellem prøverne, kan mikroskopet have udviklet et tilpasningsproblem mellem målingerne, eller farvestoffernes spektre varierer mellem prøverne. - Hvis alfa- og deltaparametrene er konsistente, skal du starte Jupyter notebook Correction Factor Finder Gamma-Beta.ipynb for at bestemme gamma- og betaparametrene (som tegner sig for forskelle i excitation og detektionseffektivitet mellem farvestofferne).
BEMÆRK: Hvis gamma- og betaplottet ikke passer godt, kan mikroskopet have udviklet et justeringsproblem mellem målingerne eller kvanteudbyttet, eller farvestoffernes udryddelseskoefficienter varierer mellem prøverne. - Når de fire krydstaleparametre bestemmes, kan disse faktorer anvendes i FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter-notesbogen til at bestemme de absolutte FRET-effektivitetsgevinster.
- Første lancering Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb og bestemme alfa og delta parametre.
6. Fejlfinding
- Hvis alle signaler er lave eller tæller pr burst er lavere end forventet (dette er farvestof afhængige-men for ATTO-550 og ATTO-647N på smfBox typiske værdier er mellem 50 og 100 tæller pr ms under en enkelt-molekyle brast), justere smfBox.
- Bro mellem dobbelt og singly mærket populationer på ES histogramme.
BEMÆRK: Dette kan skyldes enten at arbejde ved for høj koncentration (afhjælpe dette ved at fortynde prøven) eller ved fotobleaching, som kan skyldes brug af for høj laserkraft (afhjælpe dette ved at reducere lasereffekten). - Hvis bursthastigheden falder i hele eksperimentet (fluorescerende mærkede molekyler sandsynligvis overholder glasdækslet), skal du bruge en øget koncentration af BSA til at rette op på.
- Hvis bursthastigheden stiger i hele eksperimentet (prøven fordamper sandsynligvis), skal du forberede et lufttæt prøvekammer som beskrevet ovenfor.
- Hvis signalet går ned til nul under justering (softwaren sandsynligvis bliver overvældet af signal fra detektorerne), sænk lasereffekten eller brug en mere fortyndet justeringsprøve.
- Hvis Z-fokus viser koncentriske ringe (kan ske, hvis flere coverslips er blevet placeret på målet), skal du kontrollere for flere coverslips på målet.
- Hvis prøven indeholder lyse, lange udbrud af mellemliggende stoichiometrier (forårsaget af aggregerede molekyler), skal du bruge vaskemidler eller ændre prøverensningsprotokoller.
BEMÆRK: At få en ren buffer kan være et problem, da nogle bufferkomponenter ofte vil indeholde meget små mængder moderat fluorescerende forurenende stoffer, der er nok til at præsentere som enkeltfarveudbrud på tidssporet. Hvis der er for meget af dette i bufferen, kan det falde sammen med prøveudbrud og ændre FRET-effektiviteten eller stoichimetrien, der måles. Især BSA kan ofte være problematisk i denne henseende, så det er nyttigt at udsætte en BSA-lagerløsning for en stærk lyskilde for at fotoblere forureningerne.
Representative Results
Protokollen kræver en kritisk vurdering af forsøgsbetingelserne under installationen (se protokoltrin 4.8). De første opnåede resultater, der bestemmer eksperimentets succes eller fiasko, opnås på dette stadium. Et positivt resultat ville være at have mellem fem og en byger i sekundet (se figur 2B, C). Et negativt resultat ville være at have for mange (Figur 2A) eller for få byger (Figur 2D) inden for denne tidsramme. Det er fortsat muligt på nuværende tidspunkt at rette op på disse fejl: En prøve med for høj koncentration skal simpelthen fortyndes; Hvis koncentrationen er for lav, kan det dog være nødvendigt at fremstille en ny prøve (det er afgørende, om det fortsat er muligt ved denne lave koncentration at indsamle data inden for en rimelig tidsramme).
Figur 2: Skærmbilleder fra live trace under eksperimentel opsætning, der viser forskellige koncentrationer af dobbeltmærkede duplex DNA-prøver. (A) for høj, (B) øvre acceptabel grænse, (C) målkoncentration, (D) for lav. Fotontællinger (1 ms-placeringer) vises i de tre registreringskanaler. donorudslip efter donor excitation (DD), acceptor emission efter donor excitation (DA), og acceptor emission efter acceptor excitation (AA). Klik her for at se en større version af dette tal.
Et statisk enkeltartssystem vil typisk kræve 30 til 60 minutters måling for at opnå de nødvendige ~ 1.000 byger, der er nødvendige for robust dataanalyse. Længden af tid og antallet af byger, der kræves, vil stige med flere arter eller dynamiske systemer. Efter dataindsamling og -analyse ved hjælp af protokoltallene eksporteres fra Jupyter-notebooks. Generatorplottet (Figur 3A) skal svare til ALEX-perioden for den eksperimentelle opsætning. Tidssporet (figur 3B) anvendes til kvalitativt at vurdere, at stikprøvekoncentrationen er rimelig. Baggrundsplottet (Figur 3C) viser fordelingen af inter-foton forsinkelsesperioder med en lineær pasform til de længere tider for at estimere baggrundsfrekvensen26. Baggrundssporet (figur 3D) kan identificere, om der var ændringer i prøven i løbet af forsøgets varighed. primært dette ville skyldes fordampning i længere opkøbstider. ES-histogrammer genereres for alle fotoner (figur 3E) og dobbeltmærkede arter (Figur 3F). Endelig genereres et 1D E histogram (Figur 3G) med gaussisk montering af burst-dataene.
Figur 3: Eksempel på figuroutput af analyserede data genereret af Jupyter Notebooks. (A) Generatorplot, (B) Tidssporing, (C) Baggrundsbestemmelse, (D) Baggrundsfrekvenser, (E) Alle foton ES histogram, (F) Dual channel ES histogram og (G) 1D E histogram. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Sekvens |
| 1a | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1b | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1c | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' |
Tabel 1: DNA-sekvenser, der anvendes i protokollen. Nukleotider er fremhævet i blå og rød, der repræsenterer C2 amino modificerede thyminrester mærket med henholdsvis Atto-550 og Atto-647N.
Rettelse faktor finder Alpha-Delta: Klik her for at downloade denne fil.
Rettelse Faktor Finder Gamma-Beta: Klik her for at downloade denne fil.
FRET Analyse 1.4 Rettet: Klik her for at downloade denne fil.
FRET Analysis 1.4 Ikke-korrigeret: Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
De mest kritiske trin i protokollen er justeringen af mikroskopet og justering af prøvekoncentrationen til den korrekte fortynding. Hvis justeringen er slukket, kan der være utilstrækkeligt signal til at identificere byger og plot histogrammer, og hvis forskydning opstår mellem prøverne derefter præcis FRET korrektion kan mislykkes på grund af ændringer i lækage og detektion / excitation effektivitetsgevinster. Brugen af en passende koncentration er også vigtig, for høj en koncentration vil give tilfældige udbrud, der indeholder flere molekyler med potentielt forskellige FRET-effektivitetsgevinster eller mærkning af stoichiometrier. For lav koncentration vil give for få byger til robust dataanalyse.
Den protokol, der er beskrevet her, er til måling af afstande i statiske enkelt FRET arter. Hvis prøven har mere end én top i FRET-effektivitets histogrammet, eller toppe forekommer brede (hvilket kan ske med dynamiske arter), kan der være behov for flere udbrud for at passe histogrammer til samme grad af præcision. For to velseparerede toppe vil der være behov for ca. dobbelt så mange data, men hvis populationerne overlapper lidt, er der behov for endnu flere data.
Hvis de to populationer interkonverterer på eksperimentets tidsskala, kan systemets dynamik og kinetika potentielt bestemmes. Test som BVA27 og 2CDE28 kan bekræfte, at de mellemliggende udbrud er dynamiske, mens analyser, herunder dPDA29, 30 eller H2MM31, kan bestemme interkonverteringsraterne. Jupyter notebooks til BVA og 2CDE er tilgængelige på FRETBursts26 hjemmeside, og MATLab baseret software PAM32 kan køre BVA, 2CDE, og PDA analyser.
Confocal enkeltmolekyle FRET kan nemt observere tilstande meget mere kortvarigt (~ 1 ms) end TIRF; men de korte observationstider, begrænset af diffusion, giver ingen molekylær historie, og kan derfor ikke bestemme længere opholdstider, eller komplekse overgangsnetværk på den måde, at overflade immobiliserede eksperimenter kan.
Da protokollen måler frit diffuserende molekyler ved en meget lav koncentration, fungerer den bedst, når man måler intramolekylære afstande på det samme molekyle. Intermolekylære afstande mellem forbigående bundne molekyler kan måles, forudsat at KD af de to molekyler er lav nok til, at komplekset eksisterer i en betydelig mængde ved den lave arbejdskoncentration, der kræves af eksperimentet (~ 100 pM). Hvis KD er meget højere end dette, så kun syngende mærket molekyler vil blive set. Dette problem kan løses ved at bruge mikrofluidics til at blande de to mærkede komponenter sammen i en høj koncentration og derefter hurtigt fortynde og flyde over målet, før komplekset dissocierer33,34.
Måling fret effektivitet på enkelt-molekyle niveau har en betydelig fordel i forhold til ensemble teknikker, som det informerer om heterogene subpopulationer, som i et ensemble eksperiment ville være gennemsnit. Desuden giver enkeltmolekylet FRET med ALEX adgang til nøjagtige FRET-effektivitetsgevinster, som kan konverteres til nøjagtige afstande. Dette gør det muligt at fastlægge mere detaljerede strukturelle oplysninger i stedet for blot at undersøge relative afstandsændringer. SmfBox bærer alle disse fordele og kapaciteter, men kan konstrueres på et meget lavere budget end sammenlignelige kommercielt tilgængelige mikroskoper i stand til confocal smFRET23.
SmfBox repræsenterer en meget lavere adgangsbarriere for smFRET-teknikker, der gør det muligt for forskere at måle kropslige ændringer og nøjagtige afstande inden for og mellem proteiner og nukleinsyrer7,8,9,10,11,35.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt følgende finansieringskilder: BBSRC (BB/T008032/1); EPSRC (Studentship til B.A.) og MRC (Studentship til A.R.-T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino modified oligonucleotide | Eurogentec | N/A | May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes |
| Avalanche photodiode (APD) | Excelitas | SPCM-AQRH-14 | Two APDs are required for the smfBox setup |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | A2153 | System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer) |
| Compact Laser Combiner | OMICRON | LightHUB-2 | 515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers |
| Coverglass | VWR | 630-2742 | Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22x22 mm |
| Cy3B | Cytiva | PA63101 | 1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg) |
| FRETBursts Python Package | N/A | N/A | Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io |
| Imaging Buffer | N/A | System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA | |
| Immersion Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Jupyter notebooks | Project Jupyter | N/A | Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | MC-50E is same item in bulk |
| Magnesium Chloride | Merck | M2670 | System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer) |
| MilliQ/Ultrapure water | N/A | ||
| Nanopoistioner | Piezoconcept | FOC300 | Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective |
| NHS-ester modified ATTO-550 | ATTO-TEC | AD 550-31 | 1 mg, AD 550-35 (5 mg) |
| NHS-ester modified ATTO-647N | ATTO-TEC | AD 647N-31 | 1 mg, AD 647N-35 (5 mg) |
| Objective lens | Olympus | N1480700 | Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300 |
| OMICRON Control Center (OCC)- laser control center | OMICRON | N/A | v3.5.34 - OMICRON laser driver software |
| Press-To-Seal silicone isolator | Grace Bio-Labs | 664201 | 8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth |
| smOTTER | N/A | N/A | Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER |
| Sodium Chloride | Merck | S7653 | System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer) |
| Tris base | Merck | 93362 | System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer) |
| Type I ultrapure water | Merck | ZIQ7000T0 | Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System |
References
- Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).
- Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131 (2013).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Lerner, E., et al. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).
- Craggs, T. D., et al. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).
- Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676 (2019).
- Nagy, J., et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161 (2015).
- LeBlanc, S. J., et al. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).
- Segal, M., et al. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Kapanidis, A. N., et al.
- Müller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. C.
- Laurence, T. A., Kong, X., Jager, M., Weiss, S. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).
- Pollina, T., et al. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978 (2020).
- Collins, J. T., et al. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).
- Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949 (2020).
- Martens, K. J. A., et al. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552 (2019).
- Auer, A., et al. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).
- Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613 (2020).
- Ambrose, B., et al. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641 (2020).
- Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716 (2016).
- Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).
- Tomov, T. E., et al. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
- Pirchi, M., et al. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).
- Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).
- Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
- Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
- Bennet, I. A., et al. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).
