Summary
Dit artikel biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van volledig gecorrigeerde nauwkeurige FRET-metingen op individuele, vrij verspreidende biomoleculen met behulp van de open-source, goedkope smfBox, van inschakelen, via uitlijning en scherpstellen, tot gegevensverzameling en -analyse.
Abstract
De smfBox is een recent ontwikkeld kosteneffectief, open-source instrument voor single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET), dat metingen aan vrij diffunderende biomoleculen toegankelijker maakt. Dit overzicht bevat een stapsgewijs protocol voor het gebruik van dit instrument om metingen te doen van nauwkeurige FRET-efficiëntie in duplex DNA-monsters, inclusief details van de monstervoorbereiding, instrumentopstelling en -uitlijning, gegevensverzameling en volledige analyseroutines. De gepresenteerde aanpak, die omvat hoe alle correctiefactoren kunnen worden bepaald die nodig zijn voor nauwkeurige fret-afgeleide afstandsmetingen, bouwt voort op een groot aantal recente samenwerkingsverbanden in de FRET-gemeenschap, die gericht zijn op het vaststellen van standaardprotocollen en analysebenaderingen. Dit protocol, dat gemakkelijk kan worden aangepast aan een reeks biomoleculaire systemen, draagt bij aan de groeiende inspanningen om smFRET te democratiseren voor de bredere wetenschappelijke gemeenschap.
Introduction
Single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET) is een techniek die de FRET-efficiëntie meet tussen twee kleurstoffen - een donor en een acceptor - op het niveau van individuele moleculen. FRET is een fotofysisch proces dat voortkomt uit de overlappende energiespectra van twee kleurstoffen: de donor wordt geëxciteerd door licht van een specifieke golflengte en draagt energie niet-stralingsmatig over aan de acceptor, wat resulteert in emissie van de acceptor. De efficiëntie van deze overdracht is omgekeerd evenredig met het zesde vermogen van de afstand tussen de twee kleurstoffen, dus de overdrachtsefficiëntie varieert met de afstand1. Deze FRET-efficiëntie kan dus worden gebruikt om ruimtelijke informatie te bepalen over het molecuul (en) 2 waaraan de kleurstoffen zijn bevestigd, binnen een bereik van 3-10 nm. Deze schaal, en het feit dat veranderingen in FRET-efficiëntie gevoelig zijn voor angstrom moleculaire bewegingen3, maakt de techniek zeer geschikt voor het onderzoeken van structurele informatie over biomoleculen - zoals nucleïnezuren en eiwitten - zonder de complicaties van ensemblegemiddelde4,5,6. Hoewel veranderingen in relatieve FRET-efficiëntie kunnen worden gebruikt om biomoleculaire interacties en conformatiedynamiek te monitoren en licht te werpen op belangrijke cellulaire processen zoals eiwit(on)vouwing, transcriptie en DNA-replicatie en -reparatie, zijn absolute FRET-efficiënties gebruikt om precieze afstanden te bepalen voor biomoleculaire structuurbepaling7,8,9,10,11 , het overwinnen van de noodzaak van kristallisatie of bevriezing zoals vereist is voor sommige andere structurele methoden4,12.
smFRET-experimenten nemen meestal twee vormen aan, confocale of totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Tussen beide benaderingen kan de moleculaire dynamica van biomoleculen doorgaans worden onderzocht op tijdschalen van pico- tot milliseconde (confocale, vrij diffunderende moleculen) tot milliseconde tot uren (TIRF, oppervlakte geïmmobiliseerde moleculen). Dit komt door de verschillende opstellingen die bij elke techniek betrokken zijn. Bij TIRF-microscopie worden moleculen geïmmobiliseerd op het oppervlak van een dia en geëxciteerd door een evanescente golf (figuur 1A). Hier ligt de focus echter op confocale microscopie, omdat dit het formaat van de smfBox is. Bij confocale microscopie worden moleculen niet geïmmobiliseerd en diffunderen ze in plaats daarvan vrij via Brownse beweging door het confocale volume (~ 1 fL), gevormd door een laserstraal door een lens met een hoog numeriek diafragma te richten op een plek op een bepaalde diepte in de oplossing (figuur 1B). De resulterende emissie wordt teruggefocusseerd door hetzelfde diafragma en gefilterd door een dichroïsche spiegel (figuur 1C voor volledig schematisch). Het wordt vervolgens door een gaatje gericht om onscherp licht te verwijderen en op een lawinefotodiode (APD). Wanneer de APD een foton detecteert, geeft het een TTL-puls af, waarvan de timing kan worden opgenomen met een resolutie tot picoseconde. De waarnemingstijd van deze vrij diffurende moleculen in de nabijheid van het confocale volume ligt gewoonlijk binnen de orde van milliseconden.
Figuur 1: Schema's met principes van microscopie en de smfBox-opstelling. (A) Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopieprincipe: excitatielicht wordt gericht op de rand van het objectief (Obj.) en ondergaat totale interne reflectie op de coverslip-bufferinterface die een exponentieel rottend evanescence-veld genereert om aan het oppervlak gehechte moleculen te prikkelen. (B) Confocale microscopie: Vrij diffunderende moleculen worden geëxciteerd door een bijna diffractie-beperkte plek gericht in het monster. (C) De smfBox-opstelling die in dit protocol wordt gebruikt en toont alle belangrijke componenten: lawinefotodiodes (APD), beam splitter (BS), dichroïsche spiegels (DM), filters (F), spiegels (M), objectief (O) en pinhole (P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Meer recent bevatten smFRET-technieken twee kleurexcitaties, waarbij lasers die overeenkomen met de donor- en acceptor-excitatiegolflengten worden afgewisseld5. Dit kan op twee manieren worden gedaan, de eerste door continue golflasers te moduleren op de KHz-tijdschaal, die bekend staat als alternating laser excitation (ALEX)13,14. De tweede methode interleaves snelle pulsen op de MHz-tijdschaal; dit is nanoseconde-ALEX15 of gepulseerde interleaved excitatie (PIE)16. Bij al deze benaderingen leidt informatie van de acceptorlaser tot berekening van de zogenaamde stoichiometrie, die onderscheid kan maken tussen moleculen met een lage FRET-efficiëntie en moleculen zonder acceptor (hetzij door onvolledige etikettering of fotobleaching). Het gebruik van PIE/ns-ALEX geeft bovendien toegang tot fluorescerende levensduur op het niveau van één molecuul, en anisotropieën kunnen worden gemeten in combinatie met polariserende optica. Deze combinatie van metingen staat bekend als multiparameter fluorescentiedetectie (MFD)9.
Ondanks de vele voordelen van smFRET, wordt het niet veel gebruikt buiten gespecialiseerde laboratoria vanwege de hoge kosten van commerciële instrumenten en een gebrek aan eenvoudige, zelfbouwalternatieven. Een groeiende trend naar de ontwikkeling van goedkope opensourcemicroscopie vindt plaats en andere platforms zijn onlangs ontstaan, waaronder Planktonscope17, OpenFlexure Microscope18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21 en Squid22. Hierin beschrijft de studie het protocol voor het gebruik van de smfBox, een recent ontwikkelde kosteneffectieve confocale opstelling die in staat is om de FRET-efficiëntie tussen twee kleurstoffen op vrij diffunderende afzonderlijke moleculen te meten. Gedetailleerde bouwinstructies en alle benodigde operationele software zijn vrij beschikbaar op: https://craggslab.github.io/smfBox/ 23. De optische opstelling van de smfBox is samengesteld uit direct beschikbare componenten die zijn gekocht bij betaalbare en breed toegankelijke fabrikanten, terwijl de microscoopbehuizing (verantwoordelijk voor het grootste deel van de kosten in een standaard confocale opstelling) is vervangen door een aangepaste lichtdichte geanodiseerde aluminium doos (waardoor metingen kunnen worden uitgevoerd onder omgevingslichtomstandigheden). Deze doos bevat belangrijke optische componenten, waaronder de excitatie dichroïcum, objectief en pinhole, en een mechanische laservergrendeling, waardoor het veilig kan werken als een klasse I laserproduct (zie figuur 1C voor een volledig schema). De smfBox gebruikt ALEX om de kleurstof stoichiometrie te valideren en nauwkeurige FRET-correctiefactoren te bepalen. Het wordt bediend met behulp van op maat geschreven, open-source software (smOTTER), die alle aspecten van de gegevensverzameling controleert en de gegevens uitvoert in het open-source foton-HDF5-formaat24, compatibel met veel analysetools van derden. De smfBox en de acquisitie- en data-analyseprotocollen zijn onlangs getest tegen >20 andere instrumenten (zowel confocale als TIRF) in een blinde studie met meerdere laboratoria25. De verkregen FRET-efficiënties waren uitstekend in overeenstemming met alle andere instrumenten, ondanks dat de smfBox slechts een fractie van de prijs van commercieel verkrijgbare opstellingen kostte.
Hier wordt een stapsgewijs protocol geschetst voor het verwerven en analyseren van nauwkeurige, absolute FRET-efficiënties op vrij verspreidende DNA-duplexen met behulp van de smfBox, helemaal van inschakelen, via uitlijning en focus, tot gegevensverzameling en -analyse. De hier gebruikte monsters zijn drie duplex-DNA's (met hoge, midden- en lage FRET-efficiënties, zie tabel 1) die werden beoordeeld in de wereldwijde blinde studie25; de methode is echter aanpasbaar aan vele moleculaire systemen, waaronder eiwitten en andere nucleïnezuren. De hoop is dat zo'n gedetailleerd protocol, samen met de reeds bestaande bouwinstructies voor de smfBox23, zal helpen om deze krachtige techniek nog toegankelijker te maken voor een breed scala aan laboratoria.
Protocol
1. Power-on componenten
- Schakel de zes stekkers in (geen specifieke volgorde): Piezoconcept (z-focus), APD0, APD1, groene laser, rode laser en fotodetector.
2. Software 1-Experimentele setup
- Start het lasercontrolecentrum.
- Zorg ervoor dat de modus Continue golf - Alternating Constant Current (CW-ACC) is geselecteerd.
- Schakel beide lasers in.
- Controleer/stel de laservermogens in.
OPMERKING: Het laservermogen moet worden aangepast zoals gemeten net voor de excitatie dichroïcum, omdat ND-filters en straalsplitters in het excitatiepad het laservermogen verminderen van het nummer dat op het laserbedieningspaneel wordt gegeven. De getallen die hier worden gegeven zijn vermogen bij de excitatie dichroïcum, maar het vermogen op de laserbesturing dat hiermee overeenkomt, moet worden uitgewerkt.- 220 μW groene laser (515 nm, 40 mW)
- μ70 W voor rode laser (638 nm, 10 mW)
- smOTTER acquisitie software
- Sluit de lasers, detectoren, z-stage en camera aan. Configureer ze correct (kan variëren afhankelijk van de instellingen van een bepaalde NI-kaartinstelling).
3. Uitlijning van het emissiepad (niet routinematig vereist)
- Uitlijning instellen
- Pipetteer 10 μL vrije Cy3B-kleurstof (~ 100 nM) op de microscoop en focus zoals beschreven in stappen 4.3-4.5 hieronder.
OPMERKING: Een andere donorkleurstof met wat lekkage in het acceptorkanaal zou ook werken. - Open het tabblad Uitlijning in smOTTER, verlaag het laservermogen en wijzig de y-asschaal totdat de uitlezing van de detectoren wordt gezien.
OPMERKING: Het doel hier is om het signaal te verhogen, dus de schaal moet mogelijk opnieuw worden gewijzigd nadat het signaal is toegenomen. - Schroef de vier schroeven aan de voorkant van de smfBox los en verwijder het voorpaneel.
- Pipetteer 10 μL vrije Cy3B-kleurstof (~ 100 nM) op de microscoop en focus zoals beschreven in stappen 4.3-4.5 hieronder.
- Pinhole uitlijning
- Draai aan de x-knop op de pinhole positioner terwijl u het signaal op het tabblad Uitlijning bekijkt en probeer het signaal in groen en rood te verhogen.
- Draai nu aan de y-knop om het gaatje in de andere richting uit te lijnen.
- Keer terug naar de x-knop om te controleren op een verdere toename van het signaal.
- Pinhole-lens uitlijning
- Draai de lens x-knop in één richting, dit zal het signaal verminderen.
- Draai de pinhole x-knop in dezelfde richting om het signaal weer te verhogen.
- Als het nieuwe max-signaal hoger is dan voorheen, blijf dan zowel het gaatje als de lens iteratief in die richting bewegen. Als het lager is dan voorheen, beweegt het iteratief in de tegenovergestelde richting.
- Herhaal hierboven voor y.
- APD lens uitlijning
- Begin met de groene APD en beweeg de x-knop totdat het groene signaal maximaal is.
- Herhaal dit voor de y-knop.
- Keer terug naar de x-knop, beweeg heen en weer om de drempelpunten te vinden waar het signaal begint te vallen en laat het op een positie halverwege tussen deze twee punten.
- Herhaal dit voor de x-knop.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor de rode APD-lens en bekijk het rode signaal.
- Plaats het voorpaneel terug op de smfBox en plaats de schroeven terug.
OPMERKING: Voer de bovenstaande uitlijningsmaandyl uit, en uit voorzorg als wordt vermoed dat de microscoop een uitlijningsfout tussen de metingen heeft ontwikkeld.
4. Acquisitie van meetgegevens
- Reinig voor het eerste monster het podium met lensreinigingsweefsel gedrenkt in methanol; veeg zachtjes over het doel van het ene uiteinde naar het andere.
- Breng 3-4 druppels onderdompelingsolie aan voor microscopie op het midden van het doel; vul indien nodig aan tussen de monsters.
- Monstervoorbereiding
- Pipetteer 10 μL monster (gebruik eerst type I ultrapuur water) op het midden van een schoon afdekglas.
- Plaats het afdekglas voorzichtig op de objectieflens en laat deze onder een hoek ten opzichte van de olie zakken om te voorkomen dat luchtbellen tussen het afdekglas en het objectief worden opgevangen.
OPMERKING: Schuif indien nodig glas rond om luchtbellen in de olie weg te duwen van het brandpunt.
- Om alternating-laser excitation (ALEX) experimenten uit te voeren configureert u de laser in het laser duty cycles panel als volgt.
- Donor (groene laser) 0 uit, 45 aan, 55 uit
- Acceptor (rode laser) 50 uit, 45 aan, 5 uit
- ALEX periode (μs): 100
- Klik op het tabblad Z-focus in het lint; schakel in het acquisitiepaneel de lasers naar Live en start de camera; pas de belichting aan zodat een heldere vlek centraal wordt weergegeven, omringd door zwart.
OPMERKING: De camera vangt licht op dat wordt gereflecteerd door de glas/water-interface tussen de coverslip en het monster en de zichtbare cirkel van licht bevindt zich op de kleinste diameter wanneer het brandpunt zich op dit raakvlak bevindt. Het is daarom noodzakelijk om onder deze interface te beginnen, de z-hoogte naar de interface te verhogen en vervolgens iets verder te focussen boven de coverslip en in het monster dat wordt gemeten.- Begin vanuit een lage Z-positie, verhoog de hoogte totdat de heldere vlek zijn minimale grootte bereikt en verhoog vervolgens de hoogte verder met maximaal 20 μm om de laser boven de olie en het dekglas en in het monster te richten.
- Stop de camera zodra deze is scherpgesteld.
- Om te bevestigen dat de installatie correct is uitgevoerd, controleert u het spoor van type I ultrapuur water om geen fluorescentiesignalen te zien; herhaal de bevestiging van de zuiverheid voor de buffers waarin monsters worden bereid.
- Verwijder voorzichtig het afdekglas met een pincet met rubberen uiteinde om beschadiging van het doel te voorkomen en plaats vervolgens het hierboven voorbereide interessante monster op het objectief. Vul de dompelolie zo nodig aan om een uniform contactgebied tussen afdekglas en objectief te behouden (speciale aandacht voor het contactgebied van het monster op afdekglas en het brandpuntsgebied van het objectief)
- Concentratie bingo
- Om ervoor te zorgen dat gegevens met één molecuul worden verkregen, moeten monsters een concentratie hebben waarbij 1-5 uitbarstingen per seconde worden waargenomen in het live trace panel van smOTTER (dit minimaliseert de kans dat meer dan één molecuul tegelijk in het detectievolume aanwezig is). Voer de metingen uit wanneer de juiste concentratie is bepaald.
- Om verdamping tijdens lange experimenten te voorkomen, bereidt u een luchtdichte monsterkamer voor. Druk de siliconen isolatoren (gat met een diameter van 8-9 mm) op het midden van een afdekglas (ingekleurd met een pipetpunt). Pipetteer vervolgens voorzichtig een monster in het midden en vermijd elk contact met de siliconen. Plaats vervolgens een tweede dekglas bovenop en druk om een afdichting te vormen.
- Controleer het live stoichiometrie vs FRET efficiency (ES) histogram om te zien of het monster zich gedraagt zoals verwacht, d.w.z. verwachte FRET-efficiëntie en redelijke stoichiometrie (~ 0,5).
- Wanneer het voorbeeld klaar is, voert u de details voor het experiment in het deelvenster Instellingen opslaan in. Kies een geschikte map en bestandsnaam door op het beletseltekenpictogram (bestanden die zijn opgeslagen in hdf5/h5-indeling) in het instellingenpaneel Opslaan te klikken.
- Voer informatie in voor monsternaam, monstergegevens, donor- en acceptorlabels, buffer-, donor- en acceptorexcitatiegolflengten, detectiegolflengten en laservermogen, en aansluiting van gebruiker en gebruiker.
- Ga terug naar het tabblad live traceren op het lint en voer in het acquisitievenster de experimentlengte in (in minuten) en selecteer een geschikt opslaginterval om mogelijk gegevensverlies in geval van een fout te beperken. Selecteer indien nodig Laservermogens opslaan.
- Druk op Start om de gegevens op te nemen.
OPMERKING: Om een nauwkeurige FRET-bepaling mogelijk te maken, moeten ten minste twee monsters worden gemeten die dezelfde donor- en acceptorkleurstoffen bevatten, maar met voldoende verschillende FRET-efficiënties.
5. Analyse/software 2
- Start Jupyter notebook met het FRETBursts python pakket (setup instructies zijn hier te vinden: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html)
- Als correctie voor absolute FRET-efficiënties niet nodig is (d.w.z. alleen relatieve veranderingen in FRET zijn voldoende voor de meting), start u Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb. Gebruik dit om cijfers of gegevens te exporteren als csv-bestanden voor verdere analyse of plotten in andere software.
OPMERKING: Elk notitieblok bevat gedetailleerde instructies om de gebruiker door de analyseprocedures te leiden. Voor een meer gedetailleerde bespreking van analyseprocedures, inclusief burst-zoekalgoritmen, achtergrondcorrectie en alle correctieparameters, zie23,25. - Als correctie voor absolute FRET-efficiënties nodig is, begin dan met het berekenen van de overspraakparameters alfa (lekkage van donoremissie in het acceptorkanaal) en delta (aandeel van directe excitatie van de acceptor onder donorexcitatie).
- Start eerst Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb en bepaal de alfa- en deltaparameters.
OPMERKING: Als deze inconsistent zijn tussen monsters, kan de microscoop een uitlijningsprobleem tussen metingen hebben ontwikkeld of verschillen de spectra van de kleurstoffen tussen monsters. - Als de alfa- en deltaparameters consistent zijn, start u Jupyter notebook Correction Factor Finder Gamma-Beta.ipynb om de gamma- en bètaparameters te bepalen (die rekening houden met verschillen in excitatie- en detectie-efficiëntie tussen de kleurstoffen).
OPMERKING: Als de gamma- en bètaplot niet goed past, kan de microscoop een uitlijningsprobleem hebben ontwikkeld tussen metingen, of de kwantumopbrengsten, of de extinctiecoëfficiënten van de kleurstoffen verschillen tussen monsters. - Met de vier overspraakparameters bepaald, kunnen deze factoren worden gebruikt in de FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter notebook om de absolute FRET-efficiëntie te bepalen.
- Start eerst Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb en bepaal de alfa- en deltaparameters.
6. Problemen oplossen
- Als alle signalen laag zijn of het aantal per burst lager is dan verwacht (dit is afhankelijk van kleurstof, maar voor ATTO-550 en ATTO-647N op de smfBox liggen de typische waarden tussen 50 en 100 tellen per ms tijdens een burst met één molecuul), richt u de smfBox opnieuw uit.
- Brug tussen dubbel en afzonderlijk gelabelde populaties op ES-histogram.
OPMERKING: Dit kan worden veroorzaakt door te werken bij een te hoge concentratie (verhelp dit door het monster te verdunnen), of door fotobleaching, wat kan worden veroorzaakt door het gebruik van een te hoog laservermogen (verhelp dit door het laservermogen te verminderen). - Als de barstsnelheid tijdens het experiment daalt (fluorescerend gelabelde moleculen hechten zich waarschijnlijk aan de glazen afdekkingslip), gebruik dan een verhoogde concentratie BSA om te corrigeren.
- Als de barstsnelheid gedurende het experiment toeneemt (monster verdampt waarschijnlijk), bereidt u een luchtdichte monsterkamer voor zoals hierboven beschreven.
- Als het signaal tijdens de uitlijning naar nul crasht (de software wordt waarschijnlijk overweldigd door het signaal van de detectoren), verlaagt u het laservermogen of gebruikt u een meer verdund uitlijningsmonster.
- Als Z-focus concentrische ringen vertoont (kan gebeuren als er meerdere coverslips op het objectief zijn geplaatst), controleer dan op meerdere coverslips op het objectief.
- Als het monster heldere, lange uitbarstingen van tussenliggende stoichiometrieën (veroorzaakt door geaggregeerde moleculen) bevat, gebruik dan detergentia of wijzig de monsterzuiveringsprotocollen.
OPMERKING: Het verkrijgen van een schone buffer kan een probleem zijn, omdat sommige buffercomponenten vaak zeer kleine hoeveelheden matig fluorescerende verontreinigingen bevatten die voldoende zijn om zich te presenteren als enkele kleuruitbarstingen op het tijdspoor. Als er te veel hiervan in de buffer zit, kan dit samenvallen met monsteruitbarstingen en de FRET-efficiëntie of stoichiometrie die wordt gemeten veranderen. Met name BSA kan in dit opzicht vaak problematisch zijn, dus het is nuttig om een BSA-oplossing bloot te stellen aan een sterke lichtbron om de verontreinigingen te fotograferen.
Representative Results
Het protocol vereist een kritische beoordeling van de experimentele omstandigheden tijdens het instellen (zie protocolstap 4.8). De eerste verkregen resultaten die het succes of falen van het experiment bepalen, worden in dit stadium bereikt. Een positief resultaat zou zijn dat er tussen de vijf en één bursts per seconde zouden zijn (zie figuur 2B,C). Een negatief resultaat zou zijn dat er te veel (figuur 2A) of te weinig uitbarstingen (figuur 2D) zijn binnen dat tijdsbestek. Het blijft in dit stadium mogelijk om deze fouten te corrigeren: een monster met een te hoge concentratie hoeft alleen maar te worden verdund; als de concentratie echter te laag is, moet mogelijk een nieuw monster worden bereid (de bepalende factor is of het bij deze lage concentratie mogelijk blijft om binnen een redelijke termijn gegevens te verzamelen).
Figuur 2: Schermafbeeldingen van live sporen tijdens experimentele opstelling met verschillende concentraties dubbel gelabelde duplex DNA-monsters. (A) te hoog, (B) bovenste aanvaardbare limiet, (C) doelconcentratie, (D) te laag. Fotonentellingen (1 ms bins) worden weergegeven in de drie detectiekanalen; donoremissie na donorexcitatie (DD), acceptoremissie na donorexcitatie (DA) en acceptoremissie na acceptorexcitatie (AA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een statisch systeem met één soort vereist doorgaans 30 tot 60 minuten meting om de benodigde ~ 1.000 bursts te verkrijgen die nodig zijn voor robuuste gegevensanalyse. De tijdsduur en het aantal benodigde bursts zal toenemen met meerdere soorten of dynamische systemen. Na gegevensverzameling en analyse met behulp van het protocol worden cijfers geëxporteerd uit de Jupyter-notebooks. De afwisselingsplot (figuur 3A) moet overeenkomen met de ALEX-periode van de experimentele opstelling. Het tijdsspoor (figuur 3B) wordt gebruikt om kwalitatief te beoordelen of de monsterconcentratie redelijk is. De achtergrondplot (figuur 3C) toont de verdeling van inter-fotonvertragingsperioden met een lineaire aanpassing aan de langere tijden om de achtergrondsnelheid te schatten26. Het achtergrondspoor (figuur 3D) kan identificeren of er gedurende de duur van het experiment veranderingen in het monster zijn geweest; dit zou vooral te wijten zijn aan verdamping tijdens langere overnametijden. ES-histogrammen worden gegenereerd voor alle fotonen (figuur 3E) en dubbel gelabelde soorten (figuur 3F). Ten slotte wordt een 1D E-histogram (figuur 3G) gegenereerd met gaussiaanse aanpassing van de burst-gegevens.
Figuur 3: Voorbeeld figuur output van geanalyseerde gegevens gegenereerd door de Jupyter Notebooks. (A) Alternatie plot, (B) Tijd trace, (C) Achtergrondbepaling, (D) Achtergrondsnelheden, (E) Alle foton ES histogram, (F) Dual channel ES histogram, en (G) 1D E histogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Volgorde |
| 1 bis | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1b | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1 quater | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' |
Tabel 1: DNA-sequenties die in het protocol worden gebruikt. Nucleotiden zijn gemarkeerd in blauw en rood die C2 amino gemodificeerde thymineresiduen vertegenwoordigen, gelabeld met respectievelijk Atto-550 en Atto-647N.
Correctiefactorzoeker Alpha-Delta: Klik hier om dit bestand te downloaden.
CorrectieFactor Finder Gamma-Beta: Klik hier om dit bestand te downloaden.
FRET Analysis 1.4 Gecorrigeerd: Klik hier om dit bestand te downloaden.
FRET Analysis 1.4 Uncorrected: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De meest kritische stappen in het protocol zijn de uitlijning van de microscoop en het aanpassen van de monsterconcentratie aan de juiste verdunning. Als de uitlijning is uitgeschakeld, is er mogelijk onvoldoende signaal om bursts te identificeren en histogrammen uit te zetten, en als er een verkeerde uitlijning optreedt tussen monsters, kan een nauwkeurige FRET-correctie mislukken als gevolg van veranderingen in lekkage en detectie / excitatie-efficiëntie. Het gebruik van een geschikte concentratie is ook belangrijk, een te hoge concentratie zal samenvallende uitbarstingen geven, die meerdere moleculen bevatten met potentieel verschillende FRET-efficiënties of stoichiometrieën labelen. Een te lage concentratie geeft te weinig bursts voor robuuste data-analyse.
Het hier beschreven protocol is voor het meten van afstanden in statische enkele FRET-soorten. Als het monster meer dan één piek in het FRET-efficiëntiehistogram heeft, of pieken breed lijken (wat kan gebeuren met dynamische soorten), dan kunnen meer uitbarstingen nodig zijn om histogrammen met dezelfde mate van precisie te passen. Voor twee goed gescheiden pieken is ongeveer twee keer zoveel data nodig, maar als de populaties elkaar iets overlappen dan zijn er nog meer data nodig.
Als de twee populaties interconverteren op de tijdschaal van het experiment, kunnen de dynamiek en kinetiek van het systeem mogelijk worden bepaald. Tests zoals BVA27 en 2CDE28 kunnen bevestigen dat de tussenliggende bursts dynamisch van aard zijn, terwijl analyses zoals dPDA29,30 of H2MM31 de snelheden van interconversie kunnen bepalen. Jupyter notebooks voor BVA en 2CDE zijn beschikbaar op de FRETBursts26 website, en de MATLab gebaseerde software PAM32 kan BVA, 2CDE en PDA analyses uitvoeren.
Confocale single-molecule FRET kan gemakkelijk toestanden waarnemen die veel korter leven (~ 1 ms) dan TIRF; de korte waarnemingstijden, beperkt door diffusie, geven echter geen moleculaire geschiedenis en kunnen dus geen langere verblijftijden of complexe overgangsnetwerken bepalen op de manier waarop oppervlakte-geïmmobiliseerde experimenten dat kunnen.
Omdat het protocol vrij diffunderende moleculen meet bij een zeer lage concentratie, werkt het het beste bij het meten van intramoleculaire afstanden op hetzelfde molecuul. Intermoleculaire afstanden tussen tijdelijk gebonden moleculen kunnen worden gemeten op voorwaarde dat de Kd van de twee moleculen laag genoeg is dat het complex in een significante hoeveelheid bestaat bij de lage werkconcentratie die vereist is voor het experiment (~ 100 pM). Als de Kd veel hoger is dan dit, dan zullen alleen afzonderlijk gelabelde moleculen worden gezien. Dit probleem kan worden opgelost door microfluïdica te gebruiken om de twee gelabelde componenten in een hoge concentratie samen te mengen en vervolgens snel te verdunnen en over het objectief te stromen voordat het complex dissocieert33,34.
Het meten van FRET-efficiëntie op het niveau van één molecuul heeft een aanzienlijk voordeel ten opzichte van ensembletechnieken, omdat het informeert over heterogene subpopulaties, die in een ensemble-experiment gemiddeld zouden zijn. Bovendien geeft single-molecule FRET met ALEX toegang tot nauwkeurige FRET-efficiënties, die kunnen worden omgezet in nauwkeurige afstanden. Dit maakt het mogelijk om meer gedetailleerde structurele informatie te bepalen in plaats van alleen relatieve afstandsveranderingen te onderzoeken. De smfBox heeft al deze voordelen en mogelijkheden, maar kan worden gebouwd met een veel lager budget dan vergelijkbare commercieel verkrijgbare microscopen die in staat zijn tot confocale smFRET23.
De smfBox vertegenwoordigt een veel lagere toetredingsdrempel voor smFRET-technieken, waardoor onderzoekers conformatieveranderingen en nauwkeurige afstanden binnen en tussen eiwitten en nucleïnezuren kunnen meten7,8,9,10,11,35.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar de volgende financieringsbronnen: BBSRC (BB/T008032/1); EPSRC (Studentship to B.A.) en MRC (Studentship to A.R.-T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino modified oligonucleotide | Eurogentec | N/A | May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes |
| Avalanche photodiode (APD) | Excelitas | SPCM-AQRH-14 | Two APDs are required for the smfBox setup |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | A2153 | System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer) |
| Compact Laser Combiner | OMICRON | LightHUB-2 | 515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers |
| Coverglass | VWR | 630-2742 | Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22x22 mm |
| Cy3B | Cytiva | PA63101 | 1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg) |
| FRETBursts Python Package | N/A | N/A | Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io |
| Imaging Buffer | N/A | System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA | |
| Immersion Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Jupyter notebooks | Project Jupyter | N/A | Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | MC-50E is same item in bulk |
| Magnesium Chloride | Merck | M2670 | System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer) |
| MilliQ/Ultrapure water | N/A | ||
| Nanopoistioner | Piezoconcept | FOC300 | Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective |
| NHS-ester modified ATTO-550 | ATTO-TEC | AD 550-31 | 1 mg, AD 550-35 (5 mg) |
| NHS-ester modified ATTO-647N | ATTO-TEC | AD 647N-31 | 1 mg, AD 647N-35 (5 mg) |
| Objective lens | Olympus | N1480700 | Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300 |
| OMICRON Control Center (OCC)- laser control center | OMICRON | N/A | v3.5.34 - OMICRON laser driver software |
| Press-To-Seal silicone isolator | Grace Bio-Labs | 664201 | 8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth |
| smOTTER | N/A | N/A | Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER |
| Sodium Chloride | Merck | S7653 | System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer) |
| Tris base | Merck | 93362 | System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer) |
| Type I ultrapure water | Merck | ZIQ7000T0 | Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System |
References
- Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).
- Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131 (2013).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Lerner, E., et al. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).
- Craggs, T. D., et al. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).
- Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676 (2019).
- Nagy, J., et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161 (2015).
- LeBlanc, S. J., et al. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).
- Segal, M., et al. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Kapanidis, A. N., et al.
- Müller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. C.
- Laurence, T. A., Kong, X., Jager, M., Weiss, S. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).
- Pollina, T., et al. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978 (2020).
- Collins, J. T., et al. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).
- Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949 (2020).
- Martens, K. J. A., et al. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552 (2019).
- Auer, A., et al. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).
- Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613 (2020).
- Ambrose, B., et al. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641 (2020).
- Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716 (2016).
- Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).
- Tomov, T. E., et al. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
- Pirchi, M., et al. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).
- Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).
- Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
- Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
- Bennet, I. A., et al. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).
