Summary
Denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner for å gjøre fullstendig korrigerte nøyaktige FRET-målinger på individuelle, fritt diffuserende biomolekyler ved hjelp av åpen kildekode, billig smfBox, fra slå på, gjennom justering og fokusering, til datainnsamling og analyse.
Abstract
SmfBox er et nylig utviklet kostnadseffektivt, åpen kildekode-instrument for enkeltmolekylet Förster Resonance Energy Transfer (smFRET), som gjør målinger på fritt diffuserende biomolekyler mer tilgjengelige. Denne oversikten inkluderer en trinnvis protokoll for bruk av dette instrumentet for å gjøre målinger av presis FRET-effektivitet i dupleks-DNA-prøver, inkludert detaljer om prøvepreparering, instrumentoppsett og justering, datainnsamling og komplette analyserutiner. Den presenterte tilnærmingen, som inkluderer hvordan man bestemmer alle korreksjonsfaktorene som kreves for nøyaktige FRET-avledede avstandsmålinger, bygger på en stor mengde nylig samarbeidsarbeid på tvers av FRET-samfunnet, som tar sikte på å etablere standardprotokoller og analysetilnærminger. Denne protokollen, som lett kan tilpasses en rekke biomolekylære systemer, bidrar til den økende innsatsen for å demokratisere smFRET for det bredere vitenskapelige samfunnet.
Introduction
Enkeltmolekyl Förster resonans energioverføring (smFRET) er en teknikk som måler FRET-effektiviteten mellom to fargestoffer - en donor og en akseptor -på nivået av individuelle molekyler. FRET er en fotofysisk prosess som oppstår fra det overlappende energispektraet av to fargestoffer: donoren er begeistret av lys av en bestemt bølgelengde og overfører energi ikke-stråling til akseptoren, noe som resulterer i utslipp fra akseptoren. Effektiviteten til denne overføringen er omvendt proporsjonal med den sjette kraften i avstanden mellom de to fargestoffene, slik at overføringseffektiviteten varierer med avstand1. Dermed kan denne FRET-effektiviteten brukes til å bestemme romlig informasjon om molekylet (e) 2 som fargestoffene er festet til, innenfor et område på 3-10 nm. Denne skalaen, og det faktum at endringer i FRET-effektivitet er følsomme for Angstrom molekylære bevegelser3, gjør teknikken godt egnet til å undersøke strukturell informasjon om biomolekyler - som nukleinsyrer og proteiner - uten komplikasjoner av ensemblet i gjennomsnitt 4,5,6. Mens endringer i relativ FRET-effektivitet kan brukes til å overvåke biomolekylære interaksjoner og konformasjonsdynamikk, kaste lys over viktige cellulære prosesser som protein (un)folding, transkripsjon og DNA-replikasjon og reparasjon, har absolutt FRET-effektivitet blitt brukt til å bestemme nøyaktige avstander for biomolekylær strukturbestemmelse7,8,9,10,11 , overvinne behovet for krystallisering eller frysing som kreves for noen andre strukturelle metoder4,12.
smFRET eksperimenter tar oftest to former, konfekt eller total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Mellom begge tilnærminger kan molekylær dynamikk av biomolekyler vanligvis undersøkes på tidsskalaer fra pico- til millisekunder (konfokale, fritt diffuserende molekyler) opptil millisekunder til timer (TIRF, overflate immobiliserte molekyler). Dette skyldes de forskjellige oppsettene som er involvert i hver teknikk. I TIRF-mikroskopi immobiliseres molekyler på overflaten av et lysbilde og begeistres av en unnvikende bølge (figur 1A). Her er imidlertid fokuset på konfikal mikroskopi, da dette er formatet til smfBox. Ved konfokal mikroskopi blir ikke molekyler immobilisert og sprer seg i stedet fritt via brownsk bevegelse gjennom det konfokale volumet (~1 fL), dannet ved å fokusere en laserstråle gjennom en høy numerisk blenderåpningslinse til et sted på en bestemt dybde i løsningen (figur 1B). Det resulterende utslippet er fokusert tilbake gjennom samme blenderåpning og filtreres gjennom et dikroisk speil (figur 1C for fullt skjematisk). Den fokuseres deretter gjennom et hull for å fjerne ethvert utefokuslys og inn på en skredfotodiode (APD). Når APD oppdager en foton, gir den en TTL-puls, hvis tid kan registreres med opptil picosecond-oppløsning. Observasjonstiden til disse fritt diffuserende molekylene i nærheten av det konfiske volumet er vanligvis innenfor rekkefølgen av millisekunder.
Figur 1: Skjemaer som viser prinsipper for mikroskopi og smfBox-oppsettet. (A) Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopiprinsipp: Eksitasjonslys er rettet inn i kanten av målet (Obj.) og gjennomgår total intern refleksjon ved coverlip-buffergrensesnittet som genererer et eksponentielt forfallende evanescensfelt for å begeistre overflatetilknyttede molekyler. (B) Konfokal mikroskopi: Fritt diffuserende molekyler er begeistret av et nesten diffraksjonsbegrenset sted fokusert inn i prøven. (C) SmfBox-oppsettet som brukes i denne protokollen, som viser alle nøkkelkomponenter: skredfotodioder (APD), bjelkesplitter (BS), dikroiske speil (DM), filtre (F), speil (M), objektiv (O) og pinhole (P). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mer nylig innlemmet smFRET-teknikker to fargeeksitasjoner, hvor lasere som matcher donoren og akseptoreksitasjonsbølgelengdene veksles5. Dette kan gjøres på en av to måter, den første ved å modulere kontinuerlige bølgelasere på KHz-tidsskalaen, som er kjent som vekslende lasereksitasjon (ALEX) 13,14. Den andre metoden interleaves raske pulser på MHz tidsskala; Dette er nanosekund-ALEX15 eller pulsert sammenflettet eksitasjon (PIE)16. I alle disse tilnærmingene fører informasjon fra akseptorlaseren til beregning av den såkalte stoichiometrien, som kan diskriminere mellom molekyler med lav FRET-effektivitet og de som mangler en akseptor (enten gjennom ufullstendig merking eller fotobleaching). Bruk av PIE/ns-ALEX gir i tillegg tilgang til fluorescerende levetider på enkeltmolekylnivå, og anisotropier kan måles når de kombineres med polariserende optikk. Denne kombinasjonen av målinger er kjent som multiparameter fluorescensdeteksjon (MFD)9.
Til tross for de mange fordelene med smFRET, er det ikke mye brukt utenfor spesialiserte laboratorier på grunn av de høye kostnadene ved kommersielle instrumenter og mangel på enkle, selvbygde alternativer. En økende trend mot utvikling av lavkostnads opensource-mikroskopi finner sted, og andre plattformer har nylig dukket opp, inkludert Planktonscope17, OpenFlexure Microscope18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21 og Squid22. Her beskriver studien protokollen for bruk av smfBox, et nylig utviklet kostnadseffektivt konfokalt oppsett som er i stand til å måle FRET-effektiviteten mellom to fargestoffer på fritt diffuserende enkeltmolekyler. Detaljerte byggeinstruksjoner og all nødvendig driftsprogramvare er fritt tilgjengelig på: https://craggslab.github.io/smfBox/ 23. Det optiske arrangementet av smfBox er montert fra lett tilgjengelige komponenter kjøpt fra rimelige og allment tilgjengelige produsenter, mens mikroskophuset (ansvarlig for mesteparten av utgiftene i et standard konfokalt oppsett) har blitt erstattet av en tilpasset lystett anodisert aluminiumsboks (slik at målinger kan gjøres under omgivelseslysforhold). Denne boksen inneholder viktige optiske komponenter, inkludert eksitasjonsdiktropien, objektivt og pinhole, og en mekanisk laserlås, noe som muliggjør sikker drift som et klasse I-laserprodukt (se figur 1C for et fullstendig skjematisk). SmfBox bruker ALEX til å validere fargestoffet stoichiometri og for å bestemme nøyaktige FRET korreksjonsfaktorer. Den drives ved hjelp av spesialskrevet programvare med åpen kildekode (smOTTER), som styrer alle aspekter av datainnsamlingen og sender ut dataene i open source photon-HDF5 format24, kompatibel med mange tredjeparts analyseverktøy. SmfBox og protokollene for innsamling og dataanalyse ble nylig testet mot >20 andre instrumenter (både konfokale og TIRF) i en multi-lab blind studie25. FRET-effektiviteten som ble oppnådd var i utmerket samsvar med alle de andre instrumentene, til tross for at smfBox bare kostet en brøkdel av prisen på kommersielt tilgjengelige oppsett.
Her skisseres en trinnvis protokoll for å anskaffe og analysere nøyaktig, absolutt FRET-effektivitet på fritt diffuserende DNA-duplekser ved hjelp av smfBox, helt fra å slå på, gjennom justering og fokusering, til datainnsamling og analyse. Prøvene som brukes her er tre duplekse DNAer (med høy, middels og lav FRET-effektivitet, se tabell 1) som ble vurdert i den verdensomspennende blinde studien25; Metoden er imidlertid tilpasningsdyktig til mange molekylære systemer, inkludert proteiner og andre nukleinsyrer. Håpet er at en slik detaljert protokoll, sammen med de allerede eksisterende byggeinstruksjonene for smfBox23, vil bidra til å gjøre denne kraftige teknikken enda mer tilgjengelig for et bredt spekter av laboratorier.
Protocol
1. Komponenter for påsending
- Slå på de seks pluggene (ingen spesiell rekkefølge): Piezoconcept (z-focus), APD0, APD1, grønn laser, rød laser og fotodetektor.
2. Programvare 1-Eksperimentelt oppsett
- Start laserkontrollsenteret.
- Kontroller at modus for kontinuerlig bølge - vekselstrømsmodus (CW-ACC) er valgt.
- Slå på begge laserne.
- Kontroller/still inn laserkreftene.
MERK: Lasereffekten må justeres som målt like før eksitasjonsdiktroen, da ND-filtre og strålesplittere i eksitasjonsbanen vil redusere lasereffekten fra tallet som er gitt på laserkontrollpanelet. Tallene som er gitt her er strøm ved eksitasjonsdiktroen, men kraften på laserkontrollen som tilsvarer dette må utarbeides.- 220 μW grønn laser (515 nm, 40 mW)
- μ70 W for rød laser (638 nm, 10 mW)
- smOTTER-anskaffelsesprogramvare
- Koble til lasere, detektorer, z-trinn og kamera. Konfigurer dem riktig (kan variere avhengig av innstillingene for bestemt NI-kortoppsett).
3. Justering av utslippsbanen (ikke rutinemessig nødvendig)
- Definere justering
- Pipette 10 μL fritt Cy3B-fargestoff (~100 nM) på mikroskopet og fokus som beskrevet i trinn 4.3-4.5 nedenfor.
MERK: Et annet donorfargestoff med noe lekkasje i akseptorkanalen vil også fungere. - Åpne justeringsfanen i smOTTER, senk lasereffekten og endre y-akseskalaen til avlesningen er sett fra detektorene.
MERK: Målet her er å øke signalet, så vekten må kanskje endres igjen etter at signalet øker. - Skru ut de fire skruene foran på smfBox og fjern frontpanelet.
- Pipette 10 μL fritt Cy3B-fargestoff (~100 nM) på mikroskopet og fokus som beskrevet i trinn 4.3-4.5 nedenfor.
- Justering av hull
- Vri x-knappen på pinhole-posisjoneringen mens du ser på signalet på justeringsfanen, og prøv å øke signalet i grønt og rødt.
- Drei nå y-knappen for å justere hullet i den andre retningen.
- Gå tilbake til x-knappen for å se etter ytterligere økning i signalet.
- Justering av pinhole-objektiv
- Vri linsen x knotten i en retning, dette vil redusere signalet.
- Vri pinhole x-knappen i samme retning for å øke signalet igjen.
- Hvis det nye makssignalet er høyere enn før, fortsetter du å flytte både hullhullet og objektivet i den retningen. Hvis den er lavere enn før, beveger den seg i motsatt retning.
- Gjenta ovenfor for y.
- JUSTERING AV APD-objektiv
- Start med den grønne APD-en, og beveg x-knappen til det grønne signalet er maksimalt.
- Gjenta for y knotten.
- Gå tilbake til x-knappen, flytt frem og tilbake for å finne terskelpunktene der signalet begynner å falle, og la det stå halvveis mellom disse to punktene.
- Gjenta for x-knappen.
- Gjenta trinnene ovenfor for det røde APD-objektivet, og se på det røde signalet.
- Plasser frontpanelet tilbake på smfBox og sett inn skruene igjen.
MERK: Utfør justeringen ovenfor, og som et forsiktighetstiltak hvis det mistenkes at mikroskopet har utviklet en justeringsfeil mellom målinger.
4. Innsamling av måledata
- For den første prøven, rengjør scenen med linserengjøringsvev gjennomvåt i metanol; tørk forsiktig over målet fra den ene enden til den andre.
- Påfør 3-4 dråper nedsenkningsolje for mikroskopi på midten av målet; etterfyll etter behov mellom prøver.
- Prøvepreparering
- Pipette 10 μL prøve (første gangs bruk Type I ultrapure vann) på midten av et rent dekselglass.
- Plasser dekselglasset forsiktig på objektivlinsen og senk det i en vinkel mot oljen for å unngå å fange luftbobler mellom dekkglasset og målet.
MERK: Skyv om nødvendig dekselglasset rundt for å skyve luftbobler inn i oljen bort fra fokuspunktet.
- For å utføre alternerende lasereksitasjon (ALEX) eksperimenter konfigurere laseren i laserens driftssykluser panel som følger.
- Donor (grønn laser) 0 av, 45 på, 55 av
- Akseptor (rød laser) 50 av, 45 på, 5 av
- ALEX-periode (μs): 100
- Klikk på Z-fokusfanen på båndet; i oppkjøpspanelet, bytt laserne til Live og start kameraet; justere eksponeringen slik at et lyspunkt vises sentralt omgitt av svart.
MERK: Kameraet fanger opp lys som reflekteres av glass/vann-grensesnittet mellom dekslene og prøven, og den synlige lyssirkelen er i den minste diameteren når fokuspunktet er ved dette grensesnittet. Det er derfor nødvendig å starte under dette grensesnittet, øke z-høyden til grensesnittet, og deretter litt lenger for å fokusere over dekslene og i prøven som måles.- Start fra en lav Z-posisjon, øk høyden til det lyse stedet når sin minimale størrelse, og øk deretter høyden ytterligere med opptil 20 μm for å fokusere laseren over oljen og dekkglasset og i prøven.
- Stopp kameraet når du er i fokus.
- For å bekrefte at oppsettet er utført på riktig måte, må du overvåke sporet av type I ultrapure vann for å se ingen fluorescenssignaler; gjenta bekreftelsen på renhet for bufferne der det utarbeides prøver.
- Fjern forsiktig dekkglasset med gummi-ended pinsett for å unngå skadelig mål, og plasser deretter prøven av interesse forberedt som ovenfor på målet. Etterfyll nedsenkningsoljen etter behov for å opprettholde et ensartet kontaktområde mellom dekselglass og objektiv (spesiell oppmerksomhet rettet mot prøvens kontaktområde på dekkglass og fokusområde)
- Konsentrasjon bingo
- For å sikre at enkeltmolekyldata oppnås, må prøver være i en konsentrasjon der 1-5 brister per sekund observeres i live sporpanelet til smOTTER (dette minimerer sjansen for at mer enn ett molekyl er til stede i deteksjonsvolumet samtidig). Ta målingene når riktig konsentrasjon er bestemt.
- For å forhindre fordampning under lange eksperimenter, lag et lufttett prøvekammer. Trykk silikonisolatorene (8-9 mm diameter hull) ned på midten av et dekselglass (farget inn med pipettespiss). Rør deretter forsiktig en prøve inn i midten, unngå kontakt med silikonet. Legg deretter et annet dekselglass på toppen og trykk for å danne en forsegling.
- Kontroller live stoichiometri vs FRET effektivitet (ES) histogram for å se om prøven oppfører seg som forventet, dvs. forventet FRET effektivitet og rimelig stoichiometri (~ 0,5).
- Når eksemplet er klart, skriver du inn detaljene for eksperimentet i lagringsinnstillingspanelet. Velg en passende katalog og filnavn ved å klikke på ellipseikonet (filer lagret i HDF5 / h5-format) i lagringsinnstillingspanelet.
- Angi informasjon for eksempelnavn, eksempeldetaljer, donor- og akseptoretiketter, buffer, donor- og akseptoreksitasjonsbølgelengder, deteksjonsbølgelengder og laserkraft og bruker- og brukertilhørighet.
- Gå tilbake til live trace-fanen på båndet, og skriv inn eksperimentlengde (i minutter) i oppkjøpspanelet for å redusere potensielt tap av data i tilfelle feil. Velg Lagre laserkrefter om nødvendig.
- Trykk startknappen for å ta dataene.
MERK: For å muliggjøre nøyaktig FRET-bestemmelse må minst to prøver måles med samme donor- og akseptorfargestoffer, men med tilstrekkelig forskjellig FRET-effektivitet.
5. Analyse/programvare 2
- Start Jupyter bærbar PC med FRETBursts python-pakken (installasjonsinstruksjoner finner du her: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html)
- Hvis korrigering for absolutt FRET-effektivitet ikke er nødvendig (dvs. bare relative endringer i FRET er tilstrekkelig for målingen) start Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb. Bruk dette til å eksportere tall eller data som CSV-filer for videre analyse eller plotting i annen programvare.
MERK: Hver bærbare PC inneholder detaljerte instruksjoner for å veilede brukeren gjennom analyseprosedyrene. Hvis du vil ha en mer detaljert beskrivelse av analyseprosedyrer, inkludert burst-søkealgoritmer, bakgrunnskorrigering og alle korrigeringsparametere, kan du se23,25. - Hvis det er behov for korreksjon for absolutt FRET-effektivitet, begynner du med å beregne krysstaleparametrene alfa (lekkasje av donorutslipp i akseptorkanalen) og delta (andel av direkte eksitasjon av akseptoren under donoreksitasjon).
- Start først Jupyter bærbar PC Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb og bestem alfa- og deltaparametrene.
MERK: Hvis disse er inkonsekvente mellom prøver, kan mikroskopet ha utviklet et justeringsproblem mellom målinger eller fargestoffenes spektra varierer mellom prøver. - Hvis alfa- og deltaparameterne er konsekvente, starter du Jupyter notebook Correction Factor Finder Gamma-Beta.ipynb for å bestemme gamma- og betaparametrene (som står for forskjeller i eksitasjons- og deteksjonseffektivitet mellom fargestoffene).
MERK: Hvis gamma- og betaplottet ikke passer godt, kan mikroskopet ha utviklet et justeringsproblem mellom målinger, kvanteutbytter eller utryddelseskoeffisientene til fargestoffene varierer mellom prøver. - Når de fire krysstaleparametrene er bestemt, kan disse faktorene brukes i FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter bærbar PC for å fastslå absolutt FRET-effektivitet.
- Start først Jupyter bærbar PC Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb og bestem alfa- og deltaparametrene.
6. Feilsøking
- Hvis alle signaler er lave eller antall per serie er lavere enn forventet (dette er fargestoffavhengig, men for ATTO-550 og ATTO-647N på smfBox typiske verdier er mellom 50 og 100 teller per ms under et enkeltmolekylutbrudd), omjuster smfBox.
- Bro mellom dobbelt og enkeltmerkede populasjoner på ES-histogram.
MERK: Dette kan skyldes enten å jobbe med for høy konsentrasjon (utbedre dette ved å fortynne prøven), eller ved fotobleking, som kan skyldes bruk av for høy lasereffekt (utbedre dette ved å redusere laserkraften). - Hvis bristehastigheten faller gjennom hele eksperimentet (fluorescerende merkede molekyler sannsynligvis holder seg til glassdekslene), bruk en økt konsentrasjon av BSA for å rette opp.
- Hvis sprengningshastigheten øker gjennom hele eksperimentet (prøven fordamper sannsynligvis), klargjør du et lufttett prøvekammer som beskrevet ovenfor.
- Hvis signalet krasjer til null under justering (programvaren blir sannsynligvis overveldet av signal fra detektorene), senk lasereffekten eller bruk en mer fortynnet justeringsprøve.
- Hvis Z-focus viser konsentriske ringer (kan skje hvis flere coverlips er plassert på målet), se etter flere coverlips på målet.
- Hvis prøven inneholder lyse, lange utbrudd av mellomliggende stoichiometries (forårsaket av aggregerte molekyler), bruk vaskemidler eller endre prøverensingsprotokoller.
MERK: Å få en ren buffer kan være et problem, da noen bufferkomponenter ofte vil inneholde svært små mengder moderat fluorescerende forurensninger som er nok til å presentere som enkeltfargeutbrudd på tidssporet. Hvis det er for mye av dette i bufferen, kan det falle sammen med prøveutbrudd og endre FRET-effektiviteten eller stoichiometrien som måles. Spesielt BSA kan ofte være problematisk i denne forbindelse, så det er nyttig å utsette en lager BSA-løsning for en sterk lyskilde for å fotobleach forurensningene.
Representative Results
Protokollen nødvendiggjør kritisk vurdering av eksperimentelle forhold under installasjonen (se protokoll trinn 4.8). De første resultatene oppnådd som bestemmer suksess eller svikt i eksperimentet oppnås på dette stadiet. Et positivt resultat vil være å ha mellom fem og en brist per sekund (se figur 2B,C). Et negativt resultat vil være å ha for mange (figur 2A) eller for få utbrudd (figur 2D) innen denne tidsrammen. Det er fortsatt mulig på dette stadiet å rette opp disse feilene: en prøve med for høy konsentrasjon må bare fortynnes; Hvis konsentrasjonen er for lav, kan det imidlertid hende at en ny prøve må utarbeides (determinanten er om det fortsatt er mulig ved denne lave konsentrasjonen å samle inn data innen en rimelig tidsramme).
Figur 2: Skjermbilder fra live spor under eksperimentelt oppsett som viser forskjellige konsentrasjoner av dobbeltmerkede dupleks-DNA-prøver. (A) for høye, (B) øvre akseptable grense, (C) målkonsentrasjon, (D) for lav. Antall foton (1 ms bins) vises i de tre deteksjonskanalene. donorutslipp etter donoreksitasjon (DD), akseptorutslipp etter donoreksitasjon (DA), og akseptorutslipp etter akseptoreksitasjon (AA). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et statisk enkeltartssystem vil vanligvis kreve 30 til 60 minutters måling for å oppnå de nødvendige ~ 1000 bristene som trengs for robust dataanalyse. Tiden og antallet eksplosjoner som kreves vil øke med flere arter eller dynamiske systemer. Etter datainnsamling og analyse ved hjelp av protokolltallene eksporteres fra Jupyter bærbare PC-er. Vekslingsplottet (figur 3A) skal samsvare med ALEX-perioden for det eksperimentelle oppsettet. Tidssporingen (figur 3B) brukes til kvalitativt å vurdere at prøvekonsentrasjonen er rimelig. Bakgrunnstegningen (figur 3C) viser fordelingen av forsinkelsesperioder mellom foton med lineær tilpasning til de lengre tidene for å beregne bakgrunnsfrekvensen26. Bakgrunnssporingen (figur 3D) kan identifisere om det var endringer i utvalget i løpet av eksperimentets varighet. dette skyldes først og fremst fordampning i lengre oppkjøpstider. ES-histogrammer genereres for alle fotoner (figur 3E) og dobbeltmerkede arter (figur 3F). Til slutt genereres et 1D E-histogram (figur 3G) med gaussisk tilpasning av burst-dataene.
Figur 3: Eksempel på figurutgang av analyserte data generert av Jupyter Notebooks. (A) Vekslingsplott, (B) Tidssporing, (C) Bakgrunnsbestemmelse, (D) Bakgrunnsfrekvenser, (E) Alle foton ES-histogram, (F) Dual channel ES histogram og (G) 1D E histogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn | Sekvens |
| 1a | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1b | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1c | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' |
Tabell 1: DNA-sekvenser som brukes i protokollen. Nukleotider er uthevet i blått og rødt som representerer C2 aminomodifiserte tyminrester merket med henholdsvis Atto-550 og Atto-647N.
Correction Factor Finder Alpha-Delta: Klikk her for å laste ned denne filen.
Correction Factor Finder Gamma-Beta: Klikk her for å laste ned denne filen.
FRET Analysis 1.4 Korrigert: Klikk her for å laste ned denne filen.
FRET Analysis 1.4 Ukorrigert: Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
De mest kritiske trinnene i protokollen er justeringen av mikroskopet og justering av prøvekonsentrasjonen til riktig fortynning. Hvis justeringen er av, kan det være utilstrekkelig signal for å identifisere sprekker og plott histogrammer, og hvis feiljustering oppstår mellom prøver, kan nøyaktig FRET-korreksjon mislykkes på grunn av endringer i lekkasje og deteksjon / eksitasjonseffektivitet. Bruken av en passende konsentrasjon er også viktig, for høy konsentrasjon vil gi tilfeldige utbrudd, som inneholder flere molekyler med potensielt forskjellige FRET-effektivitet eller merking av stoichiometries. For lav konsentrasjon vil gi for få utbrudd for robust dataanalyse.
Protokollen som er beskrevet her er for måling av avstander i statiske enkelt FRET-arter. Hvis prøven har mer enn én topp i FRET-effektivitets histogrammet, eller toppene ser brede ut (som kan skje med dynamiske arter), kan det være nødvendig med flere eksplosjoner for å passe histogrammer til samme grad av presisjon. For to godt separerte topper vil det være behov for omtrent dobbelt så mye data, men hvis populasjonene overlapper litt, er det nødvendig med enda mer data.
Hvis de to populasjonene interkonverterer på tidsskalaen til eksperimentet, kan systemets dynamikk og kinetikk potensielt bestemmes. Tester som BVA27 og 2CDE28 kan bekrefte at mellomtonene er dynamiske, mens analyser som dPDA29,30 eller H2MM31 kan bestemme graden av interkonversjon. Jupyter bærbare PC-er for BVA og 2CDE er tilgjengelige på FRETBursts26-nettstedet, og den MATLab-baserte programvaren PAM32 kan kjøre BVA-, 2CDE- og PDA-analyser.
Confocal single-molekyl FRET kan lett observere stater mye mer kort levetid (~ 1 ms) enn TIRF; De korte observasjonstidene, begrenset av diffusjon, gir imidlertid ingen molekylær historie, og kan derfor ikke bestemme lengre oppholdstider, eller komplekse overgangsnettverk på den måten som overflate immobiliserte eksperimenter kan.
Ettersom protokollen måler fritt diffuserende molekyler ved en svært lav konsentrasjon, fungerer den best når man måler intramolekylære avstander på samme molekyl. Intermolekylære avstander mellom forbigående bundne molekyler kan måles forutsatt at Kd av de to molekylene er lav nok til at komplekset eksisterer i en betydelig mengde ved den lave arbeidskonsentrasjonen som kreves av eksperimentet (~ 100 pM). Hvis Kd er mye høyere enn dette, vil bare syngende merkede molekyler bli sett. Dette problemet kan løses ved å bruke mikrofluidikk for å blande de to merkede komponentene sammen ved høy konsentrasjon og deretter raskt fortynne og strømme over målet før komplekset dissosierer33,34.
Måling av FRET-effektivitet på enkeltmolekylnivå har en betydelig fordel i forhold til ensembleteknikker, som det informerer om heterogene subpopulasjoner, som i et ensembleeksperiment ville bli gjennomsnittet. Videre gir enkeltmolekylet FRET med ALEX tilgang til nøyaktig FRET-effektivitet, som kan konverteres til nøyaktige avstander. Dette muliggjør bestemmelse av mer detaljert strukturell informasjon i stedet for bare å undersøke relative avstandsendringer. SmfBox har alle disse fordelene og mulighetene, men kan konstrueres på et mye lavere budsjett enn sammenlignbare kommersielt tilgjengelige mikroskoper som er i stand til konfokal smFRET23.
SmfBox representerer en mye lavere inngangsbarriere for smFRET-teknikker, slik at forskere kan måle konformasjonsendringer og nøyaktige avstander i og mellom proteiner og nukleinsyrer7,8,9,10,11,35.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig følgende finansieringskilder: BBSRC (BB / T008032 / 1); EPSRC (Studentship til B.A.) og MRC (Studentship til A. R.-T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino modified oligonucleotide | Eurogentec | N/A | May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes |
| Avalanche photodiode (APD) | Excelitas | SPCM-AQRH-14 | Two APDs are required for the smfBox setup |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | A2153 | System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer) |
| Compact Laser Combiner | OMICRON | LightHUB-2 | 515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers |
| Coverglass | VWR | 630-2742 | Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22x22 mm |
| Cy3B | Cytiva | PA63101 | 1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg) |
| FRETBursts Python Package | N/A | N/A | Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io |
| Imaging Buffer | N/A | System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA | |
| Immersion Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Jupyter notebooks | Project Jupyter | N/A | Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | MC-50E is same item in bulk |
| Magnesium Chloride | Merck | M2670 | System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer) |
| MilliQ/Ultrapure water | N/A | ||
| Nanopoistioner | Piezoconcept | FOC300 | Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective |
| NHS-ester modified ATTO-550 | ATTO-TEC | AD 550-31 | 1 mg, AD 550-35 (5 mg) |
| NHS-ester modified ATTO-647N | ATTO-TEC | AD 647N-31 | 1 mg, AD 647N-35 (5 mg) |
| Objective lens | Olympus | N1480700 | Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300 |
| OMICRON Control Center (OCC)- laser control center | OMICRON | N/A | v3.5.34 - OMICRON laser driver software |
| Press-To-Seal silicone isolator | Grace Bio-Labs | 664201 | 8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth |
| smOTTER | N/A | N/A | Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER |
| Sodium Chloride | Merck | S7653 | System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer) |
| Tris base | Merck | 93362 | System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer) |
| Type I ultrapure water | Merck | ZIQ7000T0 | Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System |
References
- Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).
- Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131 (2013).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Lerner, E., et al. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).
- Craggs, T. D., et al. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).
- Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676 (2019).
- Nagy, J., et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161 (2015).
- LeBlanc, S. J., et al. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).
- Segal, M., et al. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Kapanidis, A. N., et al.
- Müller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. C.
- Laurence, T. A., Kong, X., Jager, M., Weiss, S. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).
- Pollina, T., et al. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978 (2020).
- Collins, J. T., et al. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).
- Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949 (2020).
- Martens, K. J. A., et al. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552 (2019).
- Auer, A., et al. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).
- Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613 (2020).
- Ambrose, B., et al. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641 (2020).
- Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716 (2016).
- Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).
- Tomov, T. E., et al. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
- Pirchi, M., et al. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).
- Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).
- Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
- Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
- Bennet, I. A., et al. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).
