Summary
Den här artikeln innehåller steg-för-steg-instruktioner för att göra fullständigt korrigerade exakta FRET-mätningar på enskilda, fritt diffusa biomolekyler med hjälp av öppen källkod, billig smfBox, från påslagning, genom justering och fokusering, till datainsamling och analys.
Abstract
SmfBox är ett nyligen utvecklat kostnadseffektivt instrument med öppen källkod för enmolekylig Förster Resonance Energy Transfer (smFRET), vilket gör mätningar på fritt diffusa biomolekyler mer tillgängliga. Den här översikten innehåller ett steg-för-steg-protokoll för att använda det här instrumentet för att göra mätningar av exakta FRET-effektivitetsvinster i duplex-DNA-prover, inklusive information om provberedning, instrumentinställning och justering, datainsamling och fullständiga analysrutiner. Det presenterade tillvägagångssättet, som omfattar hur man fastställer alla korrigeringsfaktorer som krävs för exakta FRET-härledda avståndsmätningar, bygger på ett stort omfattande samarbete på senare tid inom FRET-gemenskapen, som syftar till att fastställa standardprotokoll och analysmetoder. Detta protokoll, som lätt kan anpassas till en rad biomolekylära system, bidrar till de växande ansträngningarna för att demokratisera smfret för det bredare vetenskapliga samfundet.
Introduction
Enmolekylig Förster resonansenergiöverföring (smFRET) är en teknik som mäter FRET-effektiviteten mellan två färgämnen- en givare och en acceptor-på nivån för enskilda molekyler. FRET är en fotofysisk process som härrör från det överlappande energispektrat av två färgämnen: givaren är upphetsad av ljus av en specifik våglängd och överför energi icke-radiativt till acceptorn, vilket resulterar i utsläpp från acceptorn. Effektiviteten av denna överföring är omvänt proportionell mot den sjätte kraften i avståndet mellan de två färgämnena, så överföringseffektiviteten varierar med avståndet1. Således kan denna FRET-effektivitet användas för att bestämma rumslig information om de molekyler som färgämnena är fästa vid, inom ett intervall av 3-10 nm. Denna skala, och det faktum att förändringar i FRET-effektivitet är känsliga för Angstrom molekylära rörelser3, gör tekniken väl lämpad för att undersöka strukturell information om biomolekyler-såsom nukleinsyror och proteiner -utan komplikationer av ensemble i genomsnitt4,5,6. Medan förändringar i relativa FRET-effektivitetsvinster kan användas för att övervaka biomolekylära interaktioner och konformationsdynamik, vilket belyser viktiga cellulära processer som protein (un)vikning, transkription och DNA-replikering och reparation, har absoluta FRET-effektivitet använts för att bestämma exakta avstånd för biomolekylär strukturbestämning7,8,9,10,11 , övervinna behovet av kristallisering eller frysning som krävs för vissa andra strukturella metoder4,12.
smFRET experiment tar oftast två former, konfokal eller total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Mellan båda tillvägagångssätten kan biomolekylernas molekylära dynamik vanligtvis undersökas på tidsskalor från pico- till millisekund (konfokala, fritt diffuserande molekyler) upp till millisekund till timmar (TIRF, ytimperialiserade molekyler). Detta beror på de olika installationerna som är involverade i varje teknik. I TIRF-mikroskopi immobiliseras molekyler på ytan av en rutschkana och upphetsades av en evanescent våg (figur 1A). Här ligger dock fokus på konfokal mikroskopi eftersom det här är formatet på smfBox. Vid konfokal mikroskopi immobiliseras inte molekyler och sprids istället fritt via browniansk rörelse genom den konfokala volymen (~1 fL), som bildas genom att fokusera en laserstråle genom en hög numerisk bländare lins till en plats på något särskilt djup i lösningen (figur 1B). Det resulterande utsläppet fokuseras tillbaka genom samma bländare och filtreras genom en dichroisk spegel (figur 1C för fullständig schematisk). Den fokuseras sedan genom ett pinhole för att ta bort allt ofokuserat ljus och på en lavinfotodiod (APD). När APD upptäcker en foton, matar den ut en TTL-puls, vars tidpunkt kan spelas in med upp till picosekundupplösning. Observationstiden för dessa fritt diffuserande molekyler i närheten av den konfokala volymen ligger vanligen i millisekundernas ordning.
Figur 1: Scheman som visar principerna för mikroskopi och smfBox-inställningen. (A) Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopiprincip: excitationsljus riktas in i målets kant (Obj.) och genomgår total intern reflektion vid coverslip-buffertgränssnittet som genererar ett exponentiellt sönderfallande evanescencefält för att excitera ytanslutna molekyler. (B) Konfokal mikroskopi: Fritt diffusa molekyler är upphetsade av en nära diffraktionsbegränsad plats fokuserad i provet. (C) Den smfBox-inställning som används i detta protokoll och som visar alla viktiga komponenter: lavinfotodioder (APD), stråldelare (BS), dichroiska speglar (DM), filter (F), speglar (M), mål (O) och pinhole (P). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Mer nyligen införlivade smFRET-tekniker två färgexcitation, där lasrar som matchar givaren och acceptor excitation våglängder alterneras5. Detta kan göras på ett av två sätt, det första genom att modulera kontinuerliga våglasrar på KHz-tidsskalan, som kallas alternerande laserexcitation (ALEX)13,14. Den andra metoden interleaves snabba pulser på MHz-tidsskalan; Detta är nanosekunden ALEX15 eller pulserad interfolierade excitation (PIE)16. I alla dessa metoder leder information från acceptorlasern till beräkning av den så kallade stökiometrin, som kan diskriminera mellan molekyler med låg FRET-effektivitet och de som saknar en acceptor (antingen genom ofullständig märkning eller fotoblekning). Användning av PIE/ns-ALEX ger dessutom tillgång till fluorescerande livslängder på enmolekylsnivå, och anisotropier kan mätas i kombination med polariserande optik. Denna kombination av mätningar kallas multiparameter fluorescensdetektering (MFD)9.
Trots de många fördelarna med smFRET används det inte i stor utsträckning utanför specialistlaboratorier på grund av de höga kostnaderna för kommersiella instrument och bristen på enkla, självbyggda alternativ. En växande trend mot utveckling av billig opensource-mikroskopi äger rum och andra plattformar har nyligen dykt upp, inklusive Planktonscope17, OpenFlexure Microscope18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21 och Squid22. Häri beskriver studien protokollet för användning av smfBox, en nyligen utvecklad kostnadseffektiv konfokal installation som kan mäta FRET-effektiviteten mellan två färgämnen på fritt diffuserande enskilda molekyler. Detaljerade bygginstruktioner och all nödvändig operativ programvara är fritt tillgängliga på: https://craggslab.github.io/smfBox/ 23. SmfBox optiska arrangemang monteras av lättillgängliga komponenter som köpts från prisvärda och allmänt tillgängliga tillverkare, medan mikroskopkroppen (som ansvarar för huvuddelen av kostnaden i en vanlig konfokal uppsättning) har ersatts av en anpassad lättstät anodiserad aluminiumlåda (så att mätningar kan göras under omgivande ljusförhållanden). Denna låda innehåller viktiga optiska komponenter, inklusive excitation dichroic, mål och pinhole, och en mekanisk laserförregling, vilket möjliggör säker drift som en klass I laserprodukt (se figur 1C för en fullständig schematisk). SmfBox använder ALEX för att validera färgämnet stökiometri och för att bestämma exakta FRET-korrigeringsfaktorer. Det drivs med hjälp av specialskriven programvara med öppen källkod (smOTTER), som styr alla aspekter av datainsamlingen och matar ut data i photon-HDF5-formatet med öppen källkod24, kompatibel med många analysverktyg från tredje part. SmfBox och förvärvs- och dataanalysprotokollen testades nyligen mot >20 andra instrument (både konfokala och TIRF) i en blindstudie med flera labb25. De effektiviseringar av FRET som erhölls överenss väl med alla andra instrument, trots att smfBox bara kostade en bråkdel av priset på kommersiellt tillgängliga inställningar.
Här beskrivs ett steg-för-steg-protokoll för att förvärva och analysera exakta, absoluta FRET-effektivitetsvinster på fritt diffusa DNA-duplex med hjälp av smfBox, hela vägen från påslagning, genom justering och fokusering, till datainsamling och analys. De prover som används här är tre duplex-DMA (uppvisar hög-, medel- och låg-FRET-effektivitet, se tabell 1) som bedömdes i den världsomfattande blinda studien25; Metoden är dock anpassningsbar till många molekylära system, inklusive proteiner och andra nukleinsyror. Förhoppningen är att ett så detaljerat protokoll, tillsammans med de redan befintliga bygginstruktionerna för smfBox23, kommer att bidra till att göra denna kraftfulla teknik ännu mer tillgänglig för ett brett spektrum av laboratorier.
Protocol
1. Power-on-komponenter
- Slå på de sex pluggarna (ingen särskild ordning): Piezoconcept (z-focus), APD0, APD1, grön laser, röd laser och fotodetektor.
2. Programvara 1-Experimentell installation
- Starta laserkontrollcentret.
- Se till att läget Kontinuerlig våg - Alternerande konstant ström (CW-ACC) är valt.
- Slå på båda lasrarna.
- Kontrollera/ställ in laserkrafterna.
OBS: Lasereffekten måste justeras enligt mätt strax före excitationsdichroic, eftersom ND-filter och stråldelare i excitationsbanan minskar lasereffekten från det nummer som anges på laserkontrollpanelen. Siffrorna som anges här är kraft vid excitation dichroic, men kraften på laserkontrollen som motsvarar detta måste utarbetas.- 220 μW grön laser (515 nm, 40 mW)
- μ70 W för röd laser (638 nm, 10 mW)
- smOTTER-förvärvsprogram
- Anslut lasrar, detektorer, z-steg och kamera. Konfigurera dem korrekt (kan variera beroende på inställningarna för vissa NI-kortinställningar).
3. Justering av utsläppsvägen (krävs inte rutinmässigt)
- Ställa in justering
- Pipetter 10 μL fritt Cy3B-färgämne (~100 nM) på mikroskopet och fokusera enligt beskrivningen i steg 4.3-4.5 nedan.
OBS: Ett annat donatorfärgämne med visst läckage i acceptorkanalen skulle också fungera. - Öppna fliken Justering i smOTTER, sänk lasereffekten och ändra y-axelns skala tills avläsningen ses från detektorerna.
OBS: Målet här är att öka signalen, så skalan kan behöva ändras igen när signalen ökar. - Skruva loss de fyra skruvarna på framsidan av smfBox och ta bort frontpanelen.
- Pipetter 10 μL fritt Cy3B-färgämne (~100 nM) på mikroskopet och fokusera enligt beskrivningen i steg 4.3-4.5 nedan.
- Justering av pinhole
- Vrid x-ratten på pinhole-positioneringen medan du tittar på signalen på fliken Justering och försök att öka signalen i grönt och rött.
- Vrid nu på y-ratten för att rikta in pinhole i andra riktningen.
- Återgå till x-ratten för att kontrollera om signalen ökar ytterligare.
- Justering av pinhole-lins
- Vrid linsen x ratt i en riktning, detta kommer att minska signalen.
- Vrid pinhole x-ratten i samma riktning för att öka signalen igen.
- Om den nya maxsignalen är högre än tidigare, fortsätt att iterativt flytta både pinhole och linsen i den riktningen. Om det är lägre än tidigare, rör sig iterativt i motsatt riktning.
- Upprepa ovan för y.
- JUSTERING AV APD-objektiv
- Börja med den gröna APD: et, flytta x-ratten tills den gröna signalen är på ett maximum.
- Upprepa för y-ratten.
- Återgå till x-ratten, flytta fram och tillbaka för att hitta de tröskelpunkter där signalen börjar falla och lämna den på ett läge halvvägs mellan dessa två punkter.
- Upprepa för x-ratten.
- Upprepa stegen ovan för den röda APD-linsen och titta på den röda signalen.
- Placera tillbaka frontpanelen på smfBox och sätt tillbaka skruvarna.
OBS: Utför ovanstående justeringsmånadsyl och som en försiktighetsåtgärd om man misstänker att mikroskopet har utvecklat ett justeringsfel mellan mätningarna.
4. Förvärv av mätdata
- För det första provet, rengör scenen med linsrengöringsvävnad indränkt i metanol; torka försiktigt över målet från ena änden till den andra.
- Applicera 3-4 droppar nedsänkningsolja för mikroskopi på mitten av målet; vid behov fyllas på mellan proverna.
- Provberedning
- Pipett 10 μL prov (använd först ultrapurvatten av typ I) på mitten av ett rent täckglas.
- Placera försiktigt täckglaset på objektivlinsen och sänk det i en vinkel mot oljan för att förhindra att luftbubblor fastnar mellan täckglaset och målet.
OBS: Skjut vid behov omslaget runt glaset för att trycka bort luftbubblor i oljan från brännpunkten.
- För att utföra alexexperiment (Alternating-Laser Excitation) konfigurerar du lasern i laserstrålecyklernas panel enligt följande.
- Donator (grön laser) 0 av, 45 på, 55 av
- Acceptor (röd laser) 50 av, 45 på, 5 av
- ALEX period (μs): 100
- Klicka på fliken Z-fokus i menyfliksområdet; i förvärvspanelen, byt lasrarna till Live och starta kameran; justera exponeringen så att en ljuspunkt visas centralt omgiven av svart.
OBS: Kameran fångar ljus som reflekteras av glas-/vattengränssnittet mellan täcket och provet och den synliga ljuscirkeln har sin minsta diameter när fokuspunkten är vid detta gränssnitt. Det är därför nödvändigt att börja under detta gränssnitt, öka z-höjden till gränssnittet och sedan något ytterligare för att fokusera ovanför täckslipet och i det prov som mäts.- Börja från ett lågt Z-läge, öka höjden tills den ljusa punkten når sin minimala storlek och höj sedan höjden ytterligare med upp till 20 μm för att fokusera lasern ovanför oljan och täckglaset och i provet.
- Stoppa kameran en gång i fokus.
- För att bekräfta att installationen har utförts på lämpligt sätt, övervaka spåret av ultrapurvatten av typ I för att inte se några fluorescenssignaler. Upprepa bekräftelse av renheten för de buffertar där proverna bereds.
- Ta försiktigt bort täckglaset med gummiändade pincett för att undvika att skada målet och placera sedan det intressanta provet som är förberett enligt ovan på målet. Fyll på nedsänkningsoljan vid behov för att upprätthålla ett enhetligt kontaktområde mellan täckglas och mål (särskild uppmärksamhet ägnas åt provets kontaktyta på täckglas och objektivt område)
- Koncentration bingo
- För att säkerställa att enmolekylsdata erhålls måste prover ha en koncentration vid vilken 1-5 bursts per sekund observeras i den levande spårningspanelen för smOTTER (detta minimerar risken för att mer än en molekyl finns i detektionsvolymen på en gång). Gör mätningarna när lämplig koncentration har fastställts.
- För att förhindra avdunstning under långa experiment, förbered en lufttät provkammare. Tryck ner silikonisolatorerna (hål med 8-9 mm diameter) på mitten av ett täckglas (infärgat med pipettspets). Rör sedan försiktigt ett prov i mitten och undvik all kontakt med silikonet. Placera sedan ett andra täckglas ovanpå och tryck för att bilda en tätning.
- Kontrollera det levande stoichiometri vs FRET-effektivitets-histogrammet (ES) för att se om provet beter sig som förväntat, dvs. förväntad FRET-effektivitet och rimlig stökiometri (~ 0,5).
- När exemplet är klart anger du informationen för experimentet på panelen spara inställningar. Välj en lämplig katalog och filnamn genom att klicka på ellipsikonen (filer som sparas i hdf5/h5-format) på panelen Spara inställningar.
- Ange information för exempelnamn, exempelinformation, donator- och acceptoretiketter, buffert-, donator- och acceptorexcitationsvåglängder, identifieringsvåglängder och laserkraft samt användar- och användartillhörighet.
- Återgå till fliken livespårning i menyfliksområdet och välj ett lämpligt sparintervall i hämtningspanelen (på några minuter) för att minska potentiell dataförlust vid ett fel. Välj Spara laserkrafter om det behövs.
- Tryck på Start för att ta data.
OBS: För att möjliggöra korrekt FRET-bestämning måste minst två prover mätas som innehåller samma donator- och acceptorfärgämnen, men med tillräckligt olika FRET-effektivitet.
5. Analys/programvara 2
- Starta Jupyter notebook med FRETBursts python-paketet (installationsinstruktioner hittar du här: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html)
- Om korrigering för absolut FRET-effektivitet inte behövs (dvs. endast relativa förändringar i FRET är tillräckliga för mätningen) starta Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb. Använd detta för att exportera siffror eller data som csv-filer för ytterligare analys eller plottning i annan programvara.
VARJE anteckningsbok innehåller detaljerade instruktioner för att vägleda användaren genom analysprocedurerna. För en mer detaljerad diskussion om analysprocedurer, inklusive burst-sökalgoritmer, bakgrundskorrigering och alla korrigeringsparametrar, se23,25. - Om det krävs korrigering för absolut FRET-effektivitet, börja med att beräkna korstalkparametrarna alfa (läckage av donatorutsläpp i acceptorkanalen) och delta (andel direkt excitation av acceptorn under givarexcitation).
- Starta först Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb och bestäm alfa- och deltaparametrarna.
OBS: Om dessa är inkonsekventa mellan proverna kan mikroskopet ha utvecklat ett justeringsproblem mellan mätningarna eller färgämnenas spektra skiljer sig mellan proverna. - Om alfa- och deltaparametrarna är konsekventa startar du Jupyter notebook Correction Factor Finder Gamma-Beta.ipynb för att bestämma gamma- och betaparametrarna (som tar hänsyn till skillnader i excitation och detektionseffektivitet mellan färgämnena).
OBS: Om gamma- och betadiagrammet inte passar bra kan mikroskopet ha utvecklat ett justeringsproblem mellan mätningarna, eller kvantutbytena, eller färgämnenas utdöendekoefficienter skiljer sig mellan proverna. - Med de fyra crosstalk parametrarna fastställda, dessa faktorer kan användas i FRET Analys 1.4 Korrigerad.ipynb Jupyter notebook för att bestämma absoluta FRET effektivitet.
- Starta först Jupyter notebook Correction Factor Finder Alpha-Delta.ipynb och bestäm alfa- och deltaparametrarna.
6. Felsökning
- Om alla signaler är låga eller antalet per burst är lägre än förväntat (detta är färgberoende - men för ATTO-550 och ATTO-647N på smfBox typiska värden är mellan 50 och 100 räkningar per ms under en enda molekyl burst), justera smfBox.
- Överbrygga mellan dubbelt och enigt märkta populationer på ES histogram.
OBS: Detta kan orsakas antingen genom att arbeta med för hög koncentration (åtgärda detta genom att späda ut provet) eller genom fotoblekning, vilket kan orsakas av att använda för hög lasereffekt (åtgärda detta genom att minska lasereffekten). - Om spränghastigheten faller under hela experimentet (fluorescerande märkta molekyler sannolikt håller sig till glastäcket), använd en ökad koncentration av BSA för att korrigera.
- Om spränghastigheten ökar under hela experimentet (provet sannolikt avdunstar), förbered en lufttät provkammare enligt beskrivningen ovan.
- Om signalen kraschar till noll under justeringen (programvaran sannolikt överväldigas av signal från detektorerna), sänk lasereffekten eller använd ett mer utspädd justeringsprov.
- Om Z-focus visar koncentriska ringar (kan hända om flera täckslipar har placerats på målet), kontrollera om det finns flera täcken på målet.
- Om provet innehåller ljusa, långa skurar av mellanliggande stoichiometrier (orsakade av aggregerade molekyler), använd tvättmedel eller modifiera provreningsprotokoll.
OBS: Att få en ren buffert kan vara ett problem, eftersom vissa buffertkomponenter ofta innehåller mycket små mängder måttligt fluorescerande föroreningar som är tillräckligt för att presentera som enstaka färgsprängningar på tidsspårningen. Om det finns för mycket av detta i bufferten kan det sammanfalla med provsprängningar och ändra FRET-effektiviteten eller stökiometrin som mäts. BSA i synnerhet kan ofta vara problematiskt i detta avseende, så det är bra att utsätta en BSA-lösning för en stark ljuskälla för att fotoblecka föroreningarna.
Representative Results
Protokollet kräver kritisk bedömning av experimentella tillstånd under installationen (se protokollsteg 4.8). De första resultaten som avgör experimentets framgång eller misslyckande uppnås i detta skede. Ett positivt resultat skulle vara mellan fem och en bristning per sekund (se figur 2B,C). Ett negativt resultat skulle vara att ha för många (figur 2A) eller för få bursts (figur 2D) inom den tidsramen. Det är fortfarande möjligt att rätta till dessa fel: ett prov med för hög koncentration måste helt enkelt spädas ut; Om koncentrationen är för låg kan dock ett nytt prov behöva utarbetas (avgörande faktorn är om det fortfarande är möjligt vid denna låga koncentration att samla in data inom rimlig tid).
Bild 2: Skärmdumpar från levande spår under experimentell installation som visar olika koncentrationer av dubbelt märkta duplex-DNA-prover. (A) för hög, (B) övre godtagbar gräns, (C) målkoncentration, (D) för låg. Antalet foton (1 ms lagerplatser) visas i de tre identifieringskanalerna. Givarens utsläpp efter givarexcitation (DD), acceptorutsläpp efter givarexcitation (DA) och acceptorutsläpp efter acceptor excitation (AA). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Ett statiskt enartssystem skulle vanligtvis kräva 30 till 60 minuters mätning för att få de nödvändiga ~ 1 000 bursts som behövs för robust dataanalys. Den tid och antalet skurar som krävs kommer att öka med flera arter eller dynamiska system. Efter datainsamling och analys med hjälp av protokollfigurerna exporteras från Jupyter-anteckningsböckerna. Alterneringsdiagrammet (figur 3A) bör matcha ALEX-perioden för den experimentella installationen. Tidsspårningen (figur 3B) används för att kvalitativt bedöma att stickprovskoncentrationen är rimlig. Bakgrundsdiagrammet (figur 3C) visar fördelningen av fördröjningsperioder mellan fotoner med en linjär anpassning till de längre tiderna för att uppskatta bakgrundshastigheten26. Bakgrundsspåret (figur 3D) kan identifiera om det har skett ändringar i urvalet under försökets varaktighet. främst skulle detta bero på avdunstning under längre förvärvstider. ES histogram genereras för alla fotoner (figur 3E) och dubbelt märkta arter (figur 3F). Slutligen genereras ett 1D E-histogram (figur 3G) med gaussisk montering av burst-data.
Figur 3: Exempel på utdata av analyserade data som genererats av Jupyter Notebooks. (A) Alterneringsdiagram, (B) Tidsspårning, (C) Bakgrundsbestämning, (D) Bakgrundsfrekvenser, (E) Alla foton ES-histogram, (F) Dual channel ES histogram och (G) 1D E histogram. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Namn | Sekvens |
| 1a | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1b | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' | |
| 1c | 5'- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3' |
| 3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5' |
Tabell 1: DNA-sekvenser som används i protokollet. Nukleotider är markerade i blått och rött som representerar C2 aminomodifierade tyminrester märkta med Atto-550 respektive Atto-647N.
Correction Factor Finder Alpha-Delta: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Korrigeringsfaktor Finder Gamma-Beta: Klicka här för att ladda ner den här filen.
FRET Analysis 1.4 Korrigerad: Klicka här för att ladda ner den här filen.
FRET Analysis 1.4 Uncorrected: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
De mest kritiska stegen i protokollet är justeringen av mikroskopet och anpassningen av provkoncentrationen till rätt utspädning. Om justeringen är inaktiverad kan det inte finnas tillräcklig signal för att identifiera bursts och plot histogram, och om feljustering sker mellan proverna kan korrekt FRET-korrigering misslyckas på grund av förändringar i läckage och detektering / excitation effektivitet. Användningen av en lämplig koncentration är också viktig, för hög koncentration kommer att ge sammanfallande sprängningar, som innehåller flera molekyler med potentiellt olika FRET-effektivitet eller märkning av stoichiometrier. För låg koncentration ger för få bursts för robust dataanalys.
Protokollet som beskrivs här är för att mäta avstånd i statiska enskilda FRET-arter. Om provet har mer än en topp i FRET-effektivitets histogrammet, eller om toppar verkar breda (vilket kan hända med dynamiska arter), kan fler sprängningar behövas för att passa histogram med samma precision. För två väl åtskilda toppar kommer ungefär dubbelt så mycket data att behövas, men om populationerna överlappar något krävs ännu mer data.
Om de två populationerna interkonverteras på experimentets tidsskala kan systemets dynamik och kinetik potentiellt bestämmas. Tester som BVA27 och 2CDE28 kan bekräfta att de mellanliggande sprängningarna är dynamiska till sin natur, medan analyser inklusive dPDA29,30 eller H2MM31 kan bestämma interkonverseringshastigheten. Jupyter bärbara datorer för BVA och 2CDE finns tillgängliga på FRETBursts26-webbplatsen, och den MATLab-baserade programvaran PAM32 kan köra BVA-, 2CDE- och PDA-analyser.
Konfokal enmolekyl fret kan lätt observera tillstånd mycket mer kortlivade (~ 1 ms) än TIRF; De korta observationstiderna, begränsade av diffusion, ger dock ingen molekylär historia och kan därför inte bestämma längre uppehållstider, eller komplexa övergångsnätverk på det sätt som yt immobiliserade experiment kan.
Eftersom protokollet mäter fritt diffuserande molekyler vid en mycket låg koncentration fungerar det bäst när man mäter intramolekylära avstånd på samma molekyl. Intermolekylära avstånd mellan övergående bundna molekyler kan mätas förutsatt att KD av de två molekylerna är tillräckligt låg för att komplexet finns vid en betydande mängd vid den låga arbetskoncentration som krävs av experimentet (~ 100 pM). Om KD är mycket högre än så, kommer endast ensed märkta molekyler att ses. Detta problem kan övervinnas genom att använda mikrofluidik för att blanda de två märkta komponenterna vid en hög koncentration och sedan snabbt späda och flöda över målet innan komplexet separerar33,34.
Mätning av FRET-effektivitet på enmolekylnivå har en betydande fördel jämfört med ensembletekniker, eftersom det informerar om heterogena subpopulationer, som i ett ensembleexperiment skulle vara genomsnittliga. Dessutom ger enmolekyls FRET med ALEX tillgång till exakta FRET-effektivitetsvinster, som kan omvandlas till exakta avstånd. Detta möjliggör bestämning av mer detaljerad strukturell information snarare än att bara undersöka relativa avståndsförändringar. SmfBox har alla dessa fördelar och funktioner men kan konstrueras på en mycket lägre budget än jämförbara kommersiellt tillgängliga mikroskop som kan konfokal smFRET23.
SmfBox representerar en mycket lägre inträdesbarriär för smFRET-tekniker, vilket gör det möjligt för forskare att mäta konformationella förändringar och exakta avstånd inom och mellan proteiner och nukleinsyror7,8,9,10,11,35.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt följande finansieringskällor: BBSRC (BB/T008032/1); EPSRC (Studentship till B.A.) och MRC (Studentship till A. R.-T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino modified oligonucleotide | Eurogentec | N/A | May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes |
| Avalanche photodiode (APD) | Excelitas | SPCM-AQRH-14 | Two APDs are required for the smfBox setup |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | A2153 | System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer) |
| Compact Laser Combiner | OMICRON | LightHUB-2 | 515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers |
| Coverglass | VWR | 630-2742 | Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22x22 mm |
| Cy3B | Cytiva | PA63101 | 1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg) |
| FRETBursts Python Package | N/A | N/A | Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io |
| Imaging Buffer | N/A | System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA | |
| Immersion Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Jupyter notebooks | Project Jupyter | N/A | Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | MC-50E is same item in bulk |
| Magnesium Chloride | Merck | M2670 | System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer) |
| MilliQ/Ultrapure water | N/A | ||
| Nanopoistioner | Piezoconcept | FOC300 | Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective |
| NHS-ester modified ATTO-550 | ATTO-TEC | AD 550-31 | 1 mg, AD 550-35 (5 mg) |
| NHS-ester modified ATTO-647N | ATTO-TEC | AD 647N-31 | 1 mg, AD 647N-35 (5 mg) |
| Objective lens | Olympus | N1480700 | Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300 |
| OMICRON Control Center (OCC)- laser control center | OMICRON | N/A | v3.5.34 - OMICRON laser driver software |
| Press-To-Seal silicone isolator | Grace Bio-Labs | 664201 | 8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth |
| smOTTER | N/A | N/A | Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER |
| Sodium Chloride | Merck | S7653 | System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer) |
| Tris base | Merck | 93362 | System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer) |
| Type I ultrapure water | Merck | ZIQ7000T0 | Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System |
References
- Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).
- Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131 (2013).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Lerner, E., et al. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).
- Craggs, T. D., et al. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).
- Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676 (2019).
- Nagy, J., et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161 (2015).
- LeBlanc, S. J., et al. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).
- Segal, M., et al. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Kapanidis, A. N., et al.
- Müller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. C.
- Laurence, T. A., Kong, X., Jager, M., Weiss, S. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).
- Pollina, T., et al. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978 (2020).
- Collins, J. T., et al. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).
- Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949 (2020).
- Martens, K. J. A., et al. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552 (2019).
- Auer, A., et al. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).
- Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613 (2020).
- Ambrose, B., et al. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641 (2020).
- Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716 (2016).
- Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).
- Tomov, T. E., et al. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
- Pirchi, M., et al. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).
- Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).
- Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
- Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
- Bennet, I. A., et al. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).
