Summary
ヘッドスペース固相マイクロ抽出 - ガスクロマトグラフィープラットフォームは、熟したブラックカラント果実の迅速で信頼性の高い半自動揮発性同定と定量を目的として説明します。この技術は、果実の香りに関する知識を高め、繁殖を目的として強化された風味を有する品種を選択するために使用することができる。
Abstract
熟した果実が放出する揮発性有機化合物(VOC)の測定に関心が高まっており、高められた有機的特性を有する品種や品種を飼育し、消費者の受け入れを高める目的で行われています。ハイスループットメタボロミックプラットフォームは、フルーツの味と香りの品質(揮発性)を担う主要化合物を含む、異なる植物組織における代謝産物の広い範囲を定量化するために最近開発されました。ヘッドスペース固相微小抽出(HS-SPME)とガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を併用した方法を、熟したブラックカラント果実によって放出されるVOCの同定と定量化について、その風味と健康上の利点を高く評価するベリーをここに記載する。
ブラックカラント植物の熟した果実(リブス・ニクルム)を収穫し、液体窒素中で直接凍結した。組織均質化後、微細な粉末を製造し、試料を解凍し、すぐに塩化ナトリウム溶液と混合した。遠心分離後、上清を塩化ナトリウムを含むヘッドスペースガラスバイアルに移した。VOCは、固相微小抽出(SPME)繊維とガスクロマトグラフを用いてイオントラップ質量分析計に結合して抽出した。結果として得られたイオンクロマトグラムに対して揮発性定量を行い、各VOCに対して特定 のm/z イオンを用いて、正しいVOC注釈を用いて、純粋な市販規格の保持時間と質量スペクトルをサンプルと同じ条件で実行して比較することにより確認した。対照的なヨーロッパの場所で栽培された熟したカシスフルーツで60以上のVOCが同定されました。同定されたVOCの中でも、テルペノイドやC6揮発性物質などの主要な香気化合物を、ブラックカラントフルーツ品質のバイオマーカーとして使用することができます。また、将来の改善を含め、この方法の利点と欠点についても議論する。さらに、バッチ補正のための制御の使用とドリフト強度の最小化が強調されている。
Introduction
フレーバーは、あらゆる果物にとって不可欠な品質特性であり、消費者の受け入れに影響を与え、市場性に大きな影響を与えます。味覚は味覚と嗅覚系の組み合わせを伴い、食用植物部分に蓄積する幅広い化合物の存在と濃度に化学的に依存し、VOCの場合には、熟した果実によって放出される1,2。伝統的な繁殖は収量や害虫耐性などの農学特性に焦点を当ててきましたが、風味を含む果物の品質特性の改善は、遺伝的複雑さとこれらの特性を適切に表現するのが難しいため、長い間無視されてきたため、消費者の不満3,4につながっています。メタボロミックプラットフォームの最近の進歩は、フルーツの味とアロマ5,6,7,8を担う主要化合物の同定と定量化に成功しています。さらに、代謝産物プロファイリングとゲノムまたはトランスクリプトツールの組み合わせは、遺伝的に基になる果実フレーバーの解明を可能にし、繁殖プログラムは、強化された有機的特徴を有する新品種を開発するのに役立つ2,4,9,10,11,12,13,14。
ブラックカラント(リブニクルム)ベリーは、ヨーロッパ、アジア、ニュージーランドの温帯で広く栽培されている風味と栄養特性のために高く評価されています15。生産のほとんどは、主にベリーの有機的特性のために、北欧諸国で非常に人気のある食品や飲料のために処理されます。果実の強烈な色と風味は、アントシアニン、糖、酸、および熟した果実に存在するVOCの組み合わせの結果である16,17,18。ブラックカラント揮発性物質の分析は、1960s19,20,21にさかのぼります。最近では、いくつかの研究は、黒カラントVOCに焦点を当て、果物のアロマ知覚のための重要な化合物を同定し、VOCコンテンツ5、17、18、22、23に対する遺伝子型、環境、または貯蔵および処理条件の影響を評価しています。
その多くの利点のために、ハイスループットの揮発性プロファイリングのための選択の技術はHS-SPME/GC-MS24,25である。高分子相で被覆されたシリカ繊維をシリンジ装置に取り付け、平衡相に達するまで繊維中の揮発性物質の吸着を可能にする。ヘッドスペース抽出は、matrix24に存在する不揮発性化合物から繊維を保護する。SPME は、高可変濃度(100万分の1の部品に対する部品)25個あたり多数のVOCを正常に分離することができます。また、限られたサンプル処理を必要とする無溶媒技術です。HS-SPMEの他の利点は、自動化の容易さと比較的低コストです。
しかし、VOCの化学的性質、抽出プロトコル(時間、温度、塩濃度を含む)、サンプル安定性、および十分な果実組織26,27の入手可能性に応じて、その成功は制限される可能性があります。本論文では、HS-SPMEによって分離され、イオントラップ質量分析計と結合されたガスクロマトグラフィーによって分析されるブラックカラントVOCのプロトコルを提示する。植物材料の量、サンプル安定性、抽出期間、クロマトグラフィーの期間のバランスが達成され、多数のブラックカラントサンプルを処理することができ、その一部がこの研究で提示された。特に、5つの品種(「アンデガ」、「ベントロン」、「ベン・ガアン」、「ベン・ティラン」、「ティホープ」)のVOCプロファイルおよび/またはクロマトグラムがサンプルデータとして提示され、議論されます。さらに、同じプロトコルは、イチゴ(フラガリアxアナナッサ)、ラズベリー(ルブシダエウス)、ブルーベリー(ヴァクシニウムspp.)などの他のフルーツベリー種でのVOC測定のために正常に実施されています。
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Protocol
1. フルーツの収穫
- 十分な果物材料と変動性を確保するために、遺伝子型および/または処理ごとに4〜6の植物の間で成長します。
- 可能であれば、同じ日付にサンプルを収穫します。十分な果物材料がない場合は、別の日付に収穫されたサンプルを一緒にプールします。
注意:VOCプロファイルが昼/概日リズム28、29、30、31の影響を受けるので、収穫時間(午前、正午、午後)はほぼ同じままにすることをお勧めします。 - 目視観察32により果実熟成段階を評価する。熟成状態がVOC排出に強く影響を与えるため、同じ熟成段階からフルーツをプールします。損傷を受けた果物や病原体に感染した果物は捨てる。
注:果実の熟度をより良く評価するために、テクスチャ解析を実行することができます33。さらに、開花後の日数をカウントして、プールされた果物が同様の熟成段階に属していることを確認するために使用することができます。 - VOC分析には、生物学的複製(3~5)あたり10~15個の果物を含む。
注:ここでは、2018年夏に「アンデガ」、「ベン・トロン」、「ベン・ガアン」、「ベン・ティラン」、「ティホープ」品種の13〜20個の果物(生物学的複製)の3つの別々のプールが2018年夏に2か所(ポーランドとスコットランド)で収穫され、液体窒素で直接凍結されました。その後、サンプルを実験室に送り、以下に説明するように処理した。 - 収穫後、すべての果物を液体窒素で直ちに凍結し、処理まで-80°Cで保存します。
注:可能であれば、収穫後に直接果物を加工することができます。この場合、新鮮な果実はミキサーで均質化し、計量し、直接分析することができる(ステップ3.1以降)。しかし、さらなる収穫後分解プロセスから果物を防ぐために、新鮮な材料は、クーラー(4°C)に保存し、できるだけ迅速に処理する必要があります。適切に処理しないと、液体窒素が冷やや傷を引き起こし、換気の悪い空間で窒息を引き起こす可能性があります。
2. フルーツサンプルおよび試薬の調製
- 果物を細かい粉末に粉砕し、液体窒素の助けを借りて常に冷凍しておいてください。均質化には、極低温ミル、ビーズミル、モルタルと害虫を使用してください。サンプルの解凍を避けるために液体窒素とステンレス粉砕瓶やモルタルと害虫を事前に冷却します。
注: 適切な VOC 抽出を確実にするために、サンプルを微粉末に均質化することが重要です。 - 液体窒素で以前に冷却された5 mLチューブ内の凍結材料の1g(ステップ2.1から)を秤量し、正確な重量に注意してください。材料は、処理ステップ3.1まで-80°Cに保ちます。
- VOC 抽出や HS-SPME/GC-MS のパフォーマンスなど、技術的な変動を確認するために、分析に「参照」または「制御」サンプルを含めます。この目的のために、ランダムに選ばれたフルーツサンプルの混合物を一緒にプールし、VOC分析のために1日に少なくとも1つの制御サンプルを含める。さらに、ステップ2.5で説明したように、内部標準を使用して、強度ドリフトの影響を最小限に抑えます。
- 20%(w/v)の塩化ナトリウム溶液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)グレードの水(以下、NaCl溶液と呼びます)で調製します。磁気攪拌機の助けを借りてNaClを溶解します。1 サンプル当たり 1 mL の溶液の可用性を確保してください。
- 純粋な市販標準から N-ペンタデカンのHPLCグレードメタノール(D32、98%)で1ppm溶液を調製(以下、内部標準と称する)。
注: N-ペンタデカン-d32は内部標準として使用され、サンプルあたり5 μLが必要になります。メタノールはヒュームフードの下で操作する必要があります。 - VOCの識別のための純粋な商業標準のHPLC等級メタノールの1 ppmの解決を準備する(本研究で使用される商業規格のリストについては 表1 を参照)。
- 必要なバイアルに0.5 gのNaClを加えて、10 mLスクリューキャップヘッドスペースバイアルを用意します。ねじキャップには、軟質材料、 すなわち、内側に薄いポリテトラフルオロエチレンフィルムを有するシリコーンからなる隔隔を含み、汚染を避けるようにしてください。
3. サンプル準備
- 計量した凍結サンプルを含む5mLチューブに1mLのNaCl溶液を加えます。サンプルが完全に解凍され、均質化されるまでチューブを振ります。
- 5000× g で遠心分離機を室温で5分間。
- 1000 μL ピペットチップを使用して上清をNaCl含有ヘッドスペースバイアルに移します。このプロセスを容易にするために、先端の端をカットします。
- サンプルを含むヘッドスペースバイアルに5μLの内部標準を追加します。
4. HS-SPME/GC-MS データ取得
- セクション 4 で説明されている HS-SPME/GC-MS の自動実行を行う場合は、閉じたヘッドスペースバイアルを GC-MS オートサンプラーに室温で配置します。オートサンプラーの連続した位置に生物学的複製を置かないでください。代わりに、強度ドリフトの影響を最小限に抑えるためにランダムに配布します。
注:約10〜12バイアルは、サンプルの安定性に影響を与えることなく、オートサンプラーに一度に配置することができます。 - 50°Cで10分間、17xgで攪拌してヘッドスペースバイアルを10分間プレインキュベートする。
- SPMEデバイスをバイアルに挿入し、17 x gで攪拌して50°Cで30分間VOC抽出のためにヘッドスペースにファイバーを露出 させます。
- 揮発性脱着用の無分着モードで250°Cで1分間、注入口に繊維を導入します。
- 250°Cで5分間、窒素(1バーN2、≥99.8%純粋)でSPMEクリーニングステーションで繊維を洗浄します。 約100倍の繊維を再利用してください。
- イオントラップ質量分析計( 材料表参照)に結合したガスクロマトグラフでVOCを分析し、ヘリウムの一定の流れ(99.9999%の純度を≥)でクロマトグラフィーを行い、60m x 0.25mm x 1 μmの寸法を持つカラムで1mL/minのカラムを使用します。40°Cで3分間等温のオーブン温度プログラムを使用し、続いて8°C/minランプを250°Cにし、250°Cで5分間保持します。質量分析の場合は、転送ラインとイオン源温度をそれぞれ260°Cと230°Cに設定します。イオン化エネルギーを70 eVに、記録された質量範囲を1s当たり6回のスキャンで m/z 35-220に設定します。
- 上記のように、市販規格の1ppm溶液を抽出して分析する。さらに、サンプルデータ取得前に300 μL NaCl溶液と900 μL HPLCグレードの水を混合した、希釈された商業規格をすべて含む混合物を実行し、装置の正しいキャリブレーションを確認します。さらに、各バッチにNaCl溶液を単独で含有するブランクサンプルを含む。
5. GC-MSプロファイルクロマトグラムの分析:VOC同定と半定量化
- 製造元が提供するソフトウェアで、生の GC-MS プロファイル ファイルを開きます。化合物を同定するには、サンプルのクロマトグラムから決定された保持時間と質量スペクトルとコヴァッツのリニア保持インデックスを、本物の標準から得られた保持インデックスと比較します。各商用規格について、保持時間と最も豊富な m/z イオンにアポイントニングします。次に、VOCごとに特定の m/z イオンを選択します(表 1)。
- 選択したGC-MS生ファイルの標準保存時間と選択した m/z イオンに基づいて、VOCピークを自動的に統合します。このためには、保持時間と選択した m/z イオンを持つ各 VOC のリストを提供します。ソフトウェアは、シーケンス設定で提供される同じ保持時間と m/z イオンに対応するピーク領域を自動的に統合しますが、各ピークの正しい統合を確認し、必要に応じて手動で修正します。
- インストゥルメンタル変動と強度ドリフトを最小限に抑えるために、内部標準のピーク領域を内部標準のピーク領域に対して計算します。
注:異なる遺伝子型または成長および貯蔵条件からの果物を分析するとき、それは非常に水分の相違による希釈効果を排除するために、果実乾燥重量含有量に対してVOC含有量を決定することを強くお勧めします。 - バッチ効果補正の場合、各サンプルのVOCピーク領域を、同じ実行で分析したコントロールサンプル内の対応するピーク領域に正規化します。
注: 相対的な VOC 定量が得られます。しかし、実験の目的のために、VOC含有量は、任意のサンプルに対して相対的に決定することができる(例えば、未処理の果実は、VOCレベルに対する貯蔵の影響を比較する)。
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Representative Results
異なる条件または場所で栽培された果物作物の大規模なセットで高スループットVOCプロファイリングが正確なアロマフェノタイピングのために必要です。ここでは、ブラックカラント品種における相対的なVOC定量化のための高速かつ半自動化されたHS-SPME/GC-MSプラットフォームを紹介します。VOC検出および同定は、ベリー果実種をプロファイリングするために開発されたライブラリに基づいた(表1)。HS-SPME/GC-MSにより得られた典型的な熟したブラックカラント果実揮発性プロファイル(全イオンクロマトグラム)を、上記の条件で示す図 1Aに示す。合計で、63のVOCが同定され、いくつかの化学クラスに属し、大部分はエステル(27)、アルデヒド(12)、アルコール(8)、ケトン(7)、テルペン(5)、およびフラン(3)である。。
テルペノイド化合物、エステル類、及びC6化合物は、ブラックカラント揮発を支配し、新鮮な果実の香りにとって重要であると記載されている5,17。これらの以前の研究と一致して、図1Aで観察された最も豊富なピークのいくつかは、2つのモノテルペン(リナロールおよびテルピネオール)および2つのC6化合物((E)-2-ヘキセナルおよび(Z)-3-ヘキセナラル)に対応している。例えばブラックカラントプロファイルから得られた質量スペクトルと、純粋な市販規格のスペクトルとの比較を図1Bおよび図1Cにそれぞれ(E)-2-hexenalおよびテルピネオールに対して示す。
図1:HS-SPME/GC-MS(アンデガ'品種から)により得られた熟したブラックカラント果実からの代表的なクロマトグラム(A)全イオンクロマトグラム。(Z)-3-ヘキセナル(保持時間14.33分)、(E)-2-ヘキセナル(15.86分)、リナロール(21.65分)、テルピネオール(24.01分)のピークがそれぞれ1、2、3、および4の数字で示されている。(B)ブラックカラントプロファイルから(E)-2-ヘキセナルピークに相当する質量スペクトルと純粋な商用標準との比較。(C)カシスプロファイルからテルピネオールピークに相当する質量スペクトルと純粋な商用規格との比較。略称: HS-SPME/GC-MS = ヘッドスペース固相マイクロ抽出とガスクロマトグラフィー-質量分析法この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
テルペンはカシスフルーツの鮮度の指標として描かれていますが、C6化合物は「緑の葉揮発性物質」として知られており、果物や野菜のアロマ34に「緑」のノートを与えています。したがって、異なるカシス品種の熟した果実によって放出されるこれらのVOCの半定量化は、風味関連の形質を改善する第一歩となり得る。さらに、環境と植物の成長条件がアロマ繁殖の主な欠点の1つである果物VOC含有量に強く影響を与えるため、この研究の目的の1つは、同じ品種('ベントロン'、ベン・ギラン'、ベン・ティラン'、および「ティホープ」)における同定されたVOCの半定量化がヨーロッパの反対の場所で再現可能であったという仮説を検証することであった。予想通り、4つの異なるブラックカラント品種のVOCプロファイルの主成分分析(PCA)は、環境が揮発性のコンテンツに強く影響することを示し、主成分(PC)1がその位置に基づいてサンプルを分離する(図2)。しかし、'ベン・ティラン'が残りの品種から明確に分離されるように、PC2では遺伝子型の効果が観察される(図2)。
図3は、4つの評価されたブラックカラント品種におけるリナロールおよび(E)-2-ヘキセナルの相対的な含有量を示す。両方の場所について、VOC含有量を同じ対照サンプルに正規化し、半定量化によりポーランドでは一般的にスコットランドよりもリナロール含有量が高いことが確認され、(E)-2-ヘキセナラルは反対の傾向を示している(図3)。この結果は、4つの評価された品種に存在する2つの揮発性物質の割合は一定であったが、それぞれリナロールと(E)-2-ヘキセナルの最高量を示す「ベン・ティラン」および「ベン・トロン」品種で、ブラックカラント果実におけるVOC含有量に対する環境への影響を示している(図3)。これらの結果をまとめて、提案された方法がVOC含有量の表現型に有効であり、遺伝的アプローチと組み合わせることで、果実品質の繁殖を目的として使用され得ることを示す。
図2:PCAは、ポーランドとスコットランドで栽培された4つのカシス品種におけるVOCプロファイル間の差異を評価する。 PC1(環境)は変動の46.2%を説明し、PC2(遺伝子型)はデータセットの分散の24.8%を占めています。略語: PCA = 主成分分析;PC1 = 最初の主成分。PC2 = 第 2 主成分VOC =揮発性有機化合物。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:スコットランドとポーランドで収穫されたブラックカラントアロマプロファイル-リナロールおよび(E)-2-ヘキセナルにおける2つの代表的なVOCの相対的な含有量。 4つの異なるカシス品種が評価されました(「ベン・ガアン」、「ベン・ティラン」、「ベン・トロン」、「ティホープ」)。バーは2つの生物学的反復の平均値を表し、誤差範囲は標準偏差を表します。統計比較は、一方向のANOVAとそれに続くTukeyの ポストホック テストによって行われ、品種と国の間のVOC含有量の有意な違いを決定しました。同じ小文字(a,ab,b)を持つVOC内容については、 P <0.05では有意差は認められなかった。略語: VOC = 揮発性有機化合物;分散分析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1: ブラックカラントフルーツでHS-SPME/GC-MSによって識別されるVOCのリスト。 保持時間(分)、VOC同定および半定量化用 のm/z イオンの選択、香りの説明、化学クラスおよび式、およびCAS数が示されている。略語: HS-SPME/GC-MS = ヘッドスペース固相微小抽出とガスクロマトグラフィー質量分析法VOC = 揮発性有機化合物;KRI = コヴァッツ保持指数;CAS番号 = 化学物質アブストラクトサービスレジストリ番号。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
果実の香りの繁殖は、揮発性化合物の合成と適切なフェノタイピングのための技術の欠如の根底にある複雑な遺伝学と生化学によって長い間妨げられてきた。しかし、最近のメタボロミックプラットフォームの進歩は、ゲノムツールと組み合わせることで、最終的に消費者の好みを担当する代謝産物の同定と改善されたフレーバー3で作物を繁殖させることを可能にしています。ほとんどの進歩は、モデルフルーツ、トマト9,10で達成されているが、同様の結果は、イチゴ、リンゴ、またはブルーベリー2、12、35、36などの他の経済的に関連する作物種で達成することができる。
この論文は、繊細な風味と顕著な栄養価で高く評価されているフルーツであるブラックカラントを含む、異なるベリー種のVOC含有量の測定に成功した高速で再現可能なHS-SPME/GC-MSベースのプラットフォームを提示します。以前に発表された方法と比較して、主な改善は、総クロマトグラフィーの実行時間を減少させることによって達成された。実際、温度ランプを5°C/minから8°C/minに十分な分解能で上げ、クロマトグラフィー時間を50分から35分(図1A)27に短縮することが可能でした。さらに、試料に添加するNaClの高量(1mLの20%NaCl溶液+0.5gの固体NaCl)は、経時的にサンプル安定性にプラスの影響を与えるようである。実際、揮発性プロファイルは時間の経過とともに安定しており、より速いクロマトグラフィーと組み合わせることで、1日あたり最大20〜22サンプルの測定が可能になりました。
N-ペンタデカンd32のような内部標準の使用は、実行に沿って生物学的複製物の適切な分布と共に、強度ドリフト37を防ぐために必要である。さらに、バッチ補正のために、制御サンプルまたは参照サンプルを 1 日 1 回以上実行する必要があります。バッチ間の変動は、主に検出器感度の変化または繊維aging27によって引き起こされます。このプロトコルは、熟したブラックカラント果実のヘッドスペースに存在する60以上のVOCの検出を可能にしましたが、読者は提案されたライブラリに純粋な商業規格を追加することによって、この数を簡単に増やすことができることを考慮する必要があります(表1)。例えば、公表された研究では、この分析に含まれていないテルペノイド化合物の数が多いことを検出した5,17。この意味で、よりブラックカラント・アロマ特異的なVOCライブラリは、必要に応じて容易にまとめることができる。しかし、この研究の目的は、ラズベリー、イチゴ、ブラックカラントフルーツを含む異なるベリーでVOC測定のために以前に確立されたライブラリ27を適応させることでした。
ここで紹介するプロトコルには、他の 25,26,38 で既に議論されている他の HS-SPME/GC-MS プラットフォームと同様に、いくつかの長所と短所があります。自動化が容易で、多数のサンプルを分析する必要がある場合に選択できる手法を提供しますが、その主な欠点は、マトリックス効果38に対するその感受性です。また、SPMEファイバーコーティングの選択時およびサンプリング条件は、対象となるVOCs25,27の化学的性質に応じて、特に注意が必要です。結論として、ベリーフルーツヘッドスペースにおけるVOCプロファイリングのための迅速かつ半自動化されたプロトコルがここに提示され、必要に応じてライブラリサイズを増やして簡単に使用できるように調整することができます。このプラットフォームは、他の果物種に適応することができ、ゲノム研究および/または感覚分析パネルと組み合わせると、作物のアロマプロファイリングと改善に役立つと期待されています。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、HS-SPME/GC-MS測定のためにマラガ大学の セルビシオ・インタレス・デ・アポヨ・ア・ラ・インベスティガシオンに 感謝する。我々は、揮発性定量化におけるサラ・フェルナンデス・パラシオス・カンポスの支援を認める。また、グッドベリーのコンソーシアムメンバーにフルーツ素材を提供してくれたこともお礼を申し上げています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
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