Summary
Здесь описана платформа для твердофазной микроэкстракционно-газовой хроматографии для быстрой, надежной и полуавтоматизированной идентификации летучих веществ и количественной оценки в спелых плодах черной смородины. Этот метод может быть использован для увеличения знаний о фруктовом аромате и для отбора сортов с улучшенным вкусом с целью селекции.
Abstract
Растет интерес к измерению летучих органических соединений (ЛОС), выделяемых спелыми плодами, с целью селекции сортов или сортов с улучшенными органолептическими характеристиками и, таким образом, повышения потребительского признания. Недавно были разработаны высокопроизводительные метаболомные платформы для количественной оценки широкого спектра метаболитов в различных растительных тканях, включая ключевые соединения, ответственные за вкус и качество аромата фруктов (волатиломики). Метод, использующий твердофазную микроэкстракцию пространства над головой (HS-SPME) в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией (GC-MS), описан здесь для идентификации и количественной оценки ЛОС, испускаемых спелыми плодами черной смородины, ягодой, высоко оцененной за ее вкус и пользу для здоровья.
Спелые плоды растений черной смородины (Ribes nigrum) собирали и непосредственно замораживали в жидком азоте. После гомогенизации тканей для получения мелкодисперсного порошка образцы размораживали и сразу же смешивали с раствором хлорида натрия. После центрифугирования супернатант переносили в стеклянный флакон, содержащий хлорид натрия. Затем ЛОС экстрагировали с использованием твердофазного микроэкстракционного волокна (SPME) и газового хроматографа, соединенного с масс-спектрометром ионной ловушки. Летучую количественную оценку проводили на полученных ионных хроматограммах путем интеграции пиковой области с использованием определенного m/z иона для каждого ЛОС. Правильная аннотация ЛОС была подтверждена путем сравнения времени удержания и масс-спектров чистых коммерческих стандартов, работающих в тех же условиях, что и образцы. Более 60 ЛОС были идентифицированы в спелых плодах черной смородины, выращенных в контрастных европейских местах. Среди идентифицированных ЛОС ключевые ароматические соединения, такие как терпеноиды и летучие вещества C6, могут быть использованы в качестве биомаркеров качества плодов черной смородины. Кроме того, обсуждаются преимущества и недостатки метода, в том числе перспективные улучшения. Кроме того, было подчеркнуто использование средств контроля для коррекции партий и сведения к минимуму интенсивности дрейфа.
Introduction
Вкус является важной чертой качества для любого фрукта, влияя на принятие потребителями и, таким образом, значительно влияя на конкурентоспособность. Восприятие вкуса включает в себя сочетание вкусовой и обонятельной систем и химически зависит от наличия и концентрации широкого спектра соединений, которые накапливаются в съедобных частях растений или, в случае ЛОС, выделяются спелыми плодами1,2. В то время как традиционная селекция была сосредоточена на агрономических признаках, таких как урожайность и устойчивость к вредителям, улучшение качества фруктов, включая вкус, долгое время игнорировалось из-за генетической сложности и трудности правильного фенотипирования этих характеристик, что приводит к недовольству потребителей3,4. Последние достижения в области метаболомных платформ были успешными в выявлении и количественной оценке ключевых соединений, ответственных за вкус и аромат фруктов5,6,7,8. Кроме того, сочетание профилирования метаболитов с геномными или транскриптомными инструментами позволяет прояснить генетику, лежащую в основе фруктового аромата, что, в свою очередь, поможет селекционным программам разрабатывать новые сорта с улучшенными органолептическими характеристиками2,4,9,10,11,12,13,14.
Ягоды черной смородины (Ribes nigrum) высоко ценятся за их вкус и питательные свойства, широко культивируемые в умеренных зонах Европы, Азии и Новой Зеландии15. Большая часть продукции перерабатывается для пищевых продуктов и напитков, которые очень популярны в скандинавских странах, в основном из-за органолептических свойств ягод. Интенсивный цвет и вкус фруктов являются результатом сочетания антоцианов, сахаров, кислот и ЛОС, присутствующих в спелых плодах16,17,18. Анализ летучих веществ черной смородины восходит к 1960-м годам19,20,21. Совсем недавно несколько исследований были сосредоточены на ЛОС черной смородины, выявлении важных соединений для восприятия аромата фруктов и оценке влияния генотипа, окружающей среды или условий хранения и обработки на содержание ЛОС5,17,18,22,23.
Из-за своих многочисленных преимуществ методом выбора для высокопроизводительного летучего профилирования является HS-SPME/GC-MS24,25. Кремнеземное волокно, покрытое полимерной фазой, монтируется на шприцевом устройстве, что позволяет адсорбировать летучие вещества в волокне до достижения равновесной фазы. Экстракция из пространства над головой защищает волокно от энергонезависимых соединений, присутствующих в матрице24. SPME может успешно изолировать большое количество ЛОС, присутствующих в сильно варьирующихся концентрациях (от частей на миллиард до частей на миллион)25. Кроме того, это метод без растворителей, который требует ограниченной обработки образцов. Другими преимуществами HS-SPME являются простота автоматизации и ее относительно низкая стоимость.
Однако его успех может быть ограничен в зависимости от химической природы ЛОС, протокола экстракции (включая время, температуру и концентрацию соли), стабильности пробы и наличия достаточного количества плодовой ткани26,27. В данной статье представлен протокол для ЛОС черной смородины, выделенных HS-SPME и проанализированных газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометром ионной ловушки. Был достигнут баланс между количеством растительного материала, стабильностью образца и продолжительностью экстракции и хроматографии, чтобы иметь возможность обрабатывать большое количество образцов черной смородины, некоторые из которых представлены в этом исследовании. В частности, в качестве примеров данных будут представлены и обсуждены профили ЛОС и/или хроматограммы пяти сортов ("Андега", "Бен Трон", "Бен Гэрн", "Бен Тирран" и "Тихоуп"). Кроме того, этот же протокол был успешно внедрен в практику для измерения ЛОС у других видов фруктовых ягод, таких как клубника (Fragaria x ananassa), малина (Rubusidaeus) и черника (Vaccinium spp.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор фруктов
- Выращивайте от 4 до 6 растений на генотип и /или обработку, чтобы обеспечить достаточный плодовой материал и изменчивость.
- Если возможно, соберите образцы в тот же день; если фруктового материала недостаточно, объедините образцы, собранные в разные даты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы время сбора урожая (утро, полдень, вторая половина дня) оставалось примерно идентичным, поскольку на профили ЛОС влияет дневной/циркадный ритм28,29,30,31. - Оцените стадию созревания плодов путем визуального наблюдения32. Пул плодов из одной и той же стадии созревания, поскольку статус созревания сильно влияет на выбросы ЛОС. Выбросьте любые поврежденные или зараженные патогеном фрукты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей оценки спелости плодов можно выполнить анализ текстуры33. Кроме того, подсчет дней после цветения может быть использован для того, чтобы объединенные плоды принадлежали к аналогичной стадии созревания. - Включите минимум 10-15 плодов на биологическую реплику (от 3 до 5) для анализа ЛОС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь три отдельных бассейна из 13-20 плодов (биологических реплик) сортов 'Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' и 'Tihope' были собраны в двух местах (Польша и Шотландия) летом 2018 года и непосредственно заморожены в жидком азоте. Затем образцы были отправлены в лабораторию и обработаны, как описано ниже. - После сбора урожая заморозьте все плоды сразу в жидком азоте, а затем храните их при -80 °C до обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, плоды могут быть непосредственно обработаны после сбора урожая. В этом случае свежие фрукты могут быть гомогенизированы в миксере, взвешены и непосредственно проанализированы (шаг 3.1 и далее). Однако, чтобы предотвратить плоды от дальнейших послеуборочных деградационных процессов, свежий материал следует хранить в охладителе (4 °C) и обрабатывать как можно быстрее. При неправильном обращении жидкий азот может вызвать холодные ожоги и вызвать удушье в плохо проветриваемых помещениях.
2. Подготовка образцов фруктов и реагентов
- Измельчите плоды в мелкий порошок, заботясь о том, чтобы всегда держать их замороженными с помощью жидкого азота. Используйте криогенную мельницу, бисероплетение или ступку и пестик для гомогенизации. Предварительно холодные нержавеющие шлифовальные банки или ступка и пестик с жидким азотом, чтобы избежать размораживания образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно гомогенизировать образцы в мелкодисперсный порошок, чтобы обеспечить надлежащую экстракцию ЛОС. - Взвесьте 1 г замороженного материала (из стадии 2.1.) в пробирке объемом 5 мл, которая предварительно охлаждается в жидком азоте, и обратите внимание на точный вес. Держите материал при температуре -80 °C до этапа обработки 3.1.
- Включите в анализ «эталонные» или «контрольные» образцы для проверки технических вариаций, включая извлечение ЛОС и производительность HS-SPME/GC-MS. Для этого объедините смесь случайно выбранных образцов фруктов и включите по меньшей мере один контрольный образец в день для анализа ЛОС. Кроме того, используйте внутренний стандарт, как описано на этапе 2.5, для сведения к минимуму воздействия дрейфа интенсивности.
- Готовят 20% (мас./об.) раствор натрия хлорида в высокоэффективной воде класса жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (далее именуемой раствором NaCl). Растворяют NaCl с помощью магнитной мешалки; обеспечить наличие 1 мл раствора на образец.
- Готовят 1 ppm раствор в метаноле класса ВЭЖХ N-пентадекана (D32, 98%) из чисто коммерческого стандарта (далее именуемого внутренним стандартом).
ПРИМЕЧАНИЕ: N-пентадекан-d32 будет использоваться в качестве внутреннего стандарта, и потребуется 5 мкл на образец. Метанолом следует манипулировать под дымовым капотом. - Подготовка 1 ppm раствора в метаноле класса ВЭЖХ чистых коммерческих стандартов для идентификации ЛОС (см. Таблицу 1 для перечня коммерческих стандартов, используемых в настоящем исследовании).
- Приготовьте флаконы с завинчивающейся крышкой 10 мл, добавив 0,5 г NaCl в каждый необходимый флакон. Убедитесь, что винтовые колпачки включают перегородку, состоящую из мягкого материала, то есть силикона, с тонкой политетрафторэтиленовой пленкой на внутренней стороне, чтобы избежать загрязнения.
3. Пробоподготовка
- Добавьте 1 мл раствора NaCl в пробирку объемом 5 мл, содержащую взвешенный замороженный образец. Встряхните пробирку до тех пор, пока образец полностью не разморозится и не гомогенизируется.
- Центрифуга при 5000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Перенесите супернатант с наконечником пипетки объемом 1000 мкл во флакон с NaCl-содержащим пространство для головы. Вырежьте конец наконечника, чтобы облегчить этот процесс.
- Добавьте 5 мкл внутреннего стандарта к каждому флакону, содержащему образец.
4. Сбор данных HS-SPME/GC-MS
- Поместите флакон с закрытым пространством над головой в автопробоотборник GC-MS при комнатной температуре для автоматического запуска HS-SPME/GC-MS, который описан в разделе 4. Не размещайте биологические реплики в последовательных положениях в автопробоотборнике; вместо этого распределите их случайным образом, чтобы свести к минимуму влияние дрейфа интенсивности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 10-12 флаконов могут быть помещены одновременно в автопробоотборник, не влияя на стабильность образца. - Предварительно продублируйте флаконы с пространством над головой через 10 мин при 50 °C с перемешиванием при 17 х г.
- Вставьте устройство SPME во флакон, чтобы подвергнуть волокно наддуву для экстракции ЛОС в течение 30 мин при 50 °C с перемешиванием при 17 х г.
- Вводят волокно в порт впрыска в течение 1 мин при 250 °C в бесплитном режиме для летучей десорбции.
- Очистите волокно на станции очистки SPME азотом (1 бар N2, ≥ 99,8% чистоты) в течение 5 минут при 250 °C. Повторно используйте волокно примерно в 100 раз.
- Анализ ЛОС с помощью газового хроматографа, соединенного с масс-спектрометром ионной ловушки (см. Таблицу материалов), и выполнение хроматографии при постоянном потоке гелия (он ≥ чистотой 99,9999%) 1 мл/мин, с колонкой толщиной 60 м х 0,25 мм х 1 мкм. Используйте температурную программу духовки, которая является изотермической при 40 °C в течение 3 минут, затем рампа 8 °C / мин до 250 ° C и выдержка при 250 ° C в течение 5 минут. Для масс-спектрометрии установите температуру передаточной линии и источника ионов на уровне 260 °C и 230 °C соответственно. Установите энергию ионизации на 70 эВ и зарегистрированный диапазон масс на м/з 35-220 при 6 сканировании в с.
- Извлеките и проанализируйте 1 ppm раствора коммерческих стандартов, как описано выше. Кроме того, перед получением пробы запустите смесь, содержащую все разбавленные коммерческие стандарты, смешанные с раствором NaCl 300 мкл и водой класса ВЭЖХ 900 мкл, чтобы проверить правильную калибровку оборудования. Кроме того, включите в каждую партию пустой образец, содержащий только раствор NaCl.
5. Анализ хроматограмм профиля GC-MS: идентификация ЛОС и полукватинификация
- Откройте необработанные файлы профиля GC-MS с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем. Для идентификации соединений сравните время их удержания и масс-спектры и линейные показатели удержания Коваца, определенные по хроматограммам образцов, с показателями удержания, полученными из аутентичных эталонов. Для каждого коммерческого стандарта аннотируйте время удержания и наиболее распространенные ионы m/z . Затем выберите определенный m/z ион для каждого ЛОС (таблица 1).
- Автоматическая интеграция пиков ЛОС на основе стандартного времени удержания и выбранных m/z ионов выбранных необработанных файлов GC-MS. Для этого предоставьте список для каждого ЛОС со временем удержания и выбранным ионом m/z . Хотя программное обеспечение автоматически интегрирует пиковую область, соответствующую тому же времени удержания и иону м/з , как указано в настройке последовательности, проверьте правильную интеграцию каждого пика и при необходимости исправьте его вручную.
- Рассчитайте пиковую площадь каждого ЛОС относительно площади внутреннего стандарта, чтобы свести к минимуму инструментальные изменения и дрейф интенсивности.
ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе плодов различных генотипов или условий роста и хранения настоятельно рекомендуется определять содержание ЛОС по отношению к содержанию сухого веса плодов, чтобы исключить эффекты разбавления из-за различий в содержании воды. - Для коррекции пакетного эффекта нормализуйте пиковую область ЛОС каждого образца до соответствующей пиковой области в контрольном образце, проанализированном в том же прогоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получена относительная количественная оценка ЛОС; однако для целей эксперимента содержание ЛОС может быть затем определено относительно любого образца (например, необработанных плодов для сравнения влияния хранения на уровни ЛОС).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для точного аромафенотипирования необходимо высокопроизводительное профилирование ЛОС в большом наборе плодовых культур, выращенных в различных условиях или местах или принадлежащих к различным генотипам. Здесь представлена быстрая и полуавтоматизированная платформа HS-SPME/GC-MS для относительной количественной оценки ЛОС в сортах черной смородины. Обнаружение и идентификация ЛОС были основаны на библиотеке, которая была разработана для профилирования видов ягодных фруктов (таблица 1). Типичный спелый летучий профиль плодов черной смородины (общая ионная хроматограмма), полученный HS-SPME/GC-MS в вышеупомянутых условиях, показан на рисунке 1А. В общей сложности было идентифицировано 63 ЛОС, принадлежащих к нескольким химическим классам, большинство из которых являются эфирами (27), альдегидами (12), спиртами (8), кетонами (7), терпенами (5) и фуранами (3) (таблица 1).
Было описано, что терпеноидные соединения, сложные эфиры и соединения C6 доминируют в волатиломе черной смородины и важны для аромата свежих фруктов5,17. В соответствии с этими предыдущими исследованиями, некоторые из наиболее распространенных пиков, наблюдаемых на рисунке 1А, соответствуют двум монотерпенам (линалоол и терпинеол) и двум соединениям C6 ((E)-2-гексеналь и (Z)-3-гексеналь). Примеры масс-спектров, полученных из профилей черной смородины, и их сравнение со спектрами чистых коммерческих эталонов показаны для (Е)-2-гексенала и терпинеола на Фиг.1В и Фиг.1С соответственно.
Рисунок 1: Репрезентативные хроматограммы из спелых плодов черной смородины, полученные HS-SPME/GC-MS (из сорта 'Andega'). (A) Общая ионная хроматограмма. (Z)-3-гексенальный (время удержания 14,33 мин), (E)-2-гексенальный (15,86 мин), линалоол (21,65 мин) и терпинеол (24,01 мин) пики обозначаются числами 1, 2, 3 и 4 соответственно. (B) Масс-спектр, соответствующий (E)-2-гексенальному пику из профиля черной смородины и сравнение с чистым коммерческим стандартом. (C) Масс-спектр, соответствующий пику терпинеола из профиля черной смородины и сравнение с чистым коммерческим стандартом. Аббревиатура: HS-SPME/GC-MS = твердофазная микроэкстракция пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В то время как терпены были изображены как индикаторы свежести плодов черной смородины, соединения C6 известны как «летучие вещества зеленых листьев», придавая «зеленые» ноты фруктовому и овощному аромату34. Таким образом, полукватерификация этих ЛОС, выделяемых спелыми плодами различных сортов черной смородины, может стать первым шагом в улучшении вкусовых признаков. Кроме того, поскольку окружающая среда и условия роста растений сильно влияют на содержание лос в плодах, что является одним из основных недостатков для аромабридирования, одной из целей этого исследования было подтверждение гипотезы о том, что полукватерификация идентифицированных ЛОС в тех же сортах («Бен Трон», «Бен Гэрн», «Бен Тирран» и «Тихоуп») была воспроизводимой в диаметрально противоположных европейских местах, таких как Польша и Шотландия. Как и ожидалось, анализ главных компонентов (PCA) профилей ЛОС четырех различных сортов черной смородины показал, что окружающая среда сильно влияет на содержание летучих веществ, поскольку основной компонент (ПК) 1 разделяет образцы на основе их местоположения (рисунок 2). Тем не менее, эффект генотипа можно наблюдать с PC2, так как 'Ben Tirran' четко отделен от остальных сортов (рисунок 2).
На рисунке 3 показано относительное содержание линалоола и (Е)-2-гексенала в четырех оцененных сортах черной смородины. Для обоих мест содержание ЛОС было нормализовано до одного и того же контрольного образца, для которого полуквантовая оценка подтвердила, что содержание линалоола в Польше, как правило, выше, чем в Шотландии, тогда как (E)-2-гексеналь показывает противоположную тенденцию (рисунок 3). Этот результат демонстрирует воздействие на окружающую среду содержания ЛОС в плодах черной смородины, хотя доля двух летучих веществ, присутствующих в четырех оцененных сортах, была постоянной, причем сорта "Бен Тирран" и "Бен Трон" показали наибольшее количество линалоола и (Е)-2-гексенала, соответственно (рисунок 3). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что предложенный метод действителен к содержанию ФЕНОтипа ЛОС и в сочетании с генетическими подходами может быть использован с целью селекции качества плодов.
Рисунок 2: PCA для оценки дисперсии между профилями ЛОС в четырех сортах черной смородины, выращенных в Польше и Шотландии. PC1 (окружающая среда) объясняет 46,2% изменчивости, в то время как PC2 (генотип) вносит 24,8% дисперсии в набор данных. Сокращения: PCA = анализ главных компонентов; PC1 = первый основной компонент; PC2 = второй основной компонент; ЛОС = летучее органическое соединение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Относительное содержание двух репрезентативных ЛОС в аромапрофилях черной смородины - линалоол и (Е)-2-гексеналь, собранных в Шотландии и Польше. Были оценены четыре различных сорта черной смородины («Бен Гэрн», «Бен Тирран», «Бен Трон» и «Тихоуп»). Столбцы представляют средние значения двух биологических реплик, а полосы ошибок представляют стандартное отклонение. Статистические сравнения проводились с помощью одностороннего ANOVA, за которым последовал пост-специальный тест Туки для определения значительных различий в содержании ЛОС между сортами и странами. Для содержимого ЛОС с одинаковыми строчными буквами (a, ab, b) не наблюдалось существенных различий при P < 0,05. Сокращения: ЛОС = летучие органические соединения; ANOVA = дисперсионный анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Перечень ЛОС, идентифицированных HS-SPME/GC-MS в плодах черной смородины. Указывается время удержания (мин), выбранный м/з ион для идентификации и полуквафинификации ЛОС, описание аромата, химический класс и формула, а также номер CAS. Сокращения: HS-SPME/GC-MS = твердофазная микроэкстракция пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией; ЛОС = летучие органические соединения; КРИ = индекс удержания Коваца; Номер CAS = регистрационный номер службы рефератов по химическим веществам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Селекции фруктового аромата уже давно препятствуют сложная генетика и биохимия, лежащие в основе синтеза летучих соединений, и отсутствие технологий для правильного фенотипирования. Однако последние достижения в области метаболомных платформ в сочетании с геномными инструментами, наконец, позволяют идентифицировать метаболиты, ответственные за потребительские предпочтения, и разводить культуры с улучшенным вкусом3. В то время как наибольший прогресс был достигнут в модельных фруктах, помидорах9,10, аналогичные результаты могут быть достигнуты и в других экономически значимых видах сельскохозяйственных культур, таких как клубника, яблоко или черника2,12,35,36.
В этой статье представлена быстрая и воспроизводимая платформа на основе HS-SPME/GC-MS, которая успешно используется для измерения содержания ЛОС в различных видах ягод, включая черную смородину, фрукт, высоко ценимый за его тонкий вкус и замечательную питательную ценность. По сравнению с ранее опубликованными методами основное улучшение было достигнуто за счет уменьшения общего хроматографического времени выполнения. Действительно, удалось повысить температуру рампы с 5 °C/мин до 8 °C/мин с адекватным разрешением, сократив хроматографическое время с 50 мин до 35 мин (рисунок 1А)27. Кроме того, большое количество NaCl, добавленного в образцы (1 мл 20% раствора NaCl + 0,5 г твердого NaCl), по-видимому, положительно влияет на стабильность образца с течением времени. Действительно, летучие профили были стабильны с течением времени и в сочетании с более быстрой хроматографией позволяли измерять до 20-22 образцов в день.
Использование внутреннего стандарта, такого как N-пентадекан-d32, вместе с надлежащим распределением биологических реплик по ходу необходимо для предотвращения дрейфа интенсивности37. Кроме того, контрольные или эталонные образцы должны проводиться не реже одного раза в день анализа для периодической коррекции. Различия между партиями в основном вызваны изменениями чувствительности детектора или старением волокон27. Хотя этот протокол позволил обнаружить более 60 ЛОС, присутствующих в пространстве спелых плодов черной смородины, читатели должны учитывать, что это число может быть легко увеличено путем добавления чисто коммерческих стандартов в предлагаемую библиотеку (таблица 1). Например, опубликованные исследования выявили большое количество терпеноидных соединений, которые не были включены в этот анализ5,17. В этом смысле более специфическая для черной смородины библиотека ЛОС может быть легко собрана вместе, если это необходимо. Однако целью этого исследования была адаптация ранее созданной библиотеки27 для измерения ЛОС в различных ягодах, включая малину, клубнику и плоды черной смородины.
Примечательно, что представленный здесь протокол имеет ряд преимуществ и недостатков, как и другие платформы HS-SPME/GC-MS, которые уже обсуждались в другом месте25,26,38. Хотя он предлагает простоту автоматизации, что делает его методом выбора, когда требуется анализ большого количества образцов, его основным недостатком является его восприимчивость к матричным эффектам38. Кроме того, особую осторожность следует проявлять при выборе волоконного покрытия SPME и при соблюдении условий отбора проб в зависимости от химической природы целевых ЛОС25,27. В заключение следует отметить, что здесь представлен быстрый и полуавтоматизированный протокол для профилирования ЛОС в пространстве ягодных плодов, который при необходимости может быть легко адаптирован для использования с увеличенным размером библиотеки. Ожидается, что эта платформа может быть адаптирована к другим видам фруктов и в сочетании с геномными исследованиями и / или панелью сенсорного анализа поможет профилированию и улучшению ароматов сельскохозяйственных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación из Университета Малаги за измерения HS-SPME/GC-MS. Мы признаем помощь Сары Фернандес-Паласиос Кампос в количественной оценке волатильности. Мы также благодарим членов консорциума GoodBerry за предоставление фруктового материала.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A.
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J.
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
