Summary
Aquí se describe una plataforma de microextracción-gas-cromatografía de gases en fase sólida para una identificación y cuantificación volátil rápida, confiable y semiautomatizada en frutas maduras de grosella negra. Esta técnica se puede utilizar para aumentar el conocimiento sobre el aroma de la fruta y para seleccionar cultivares con sabor mejorado con el propósito de la cría.
Abstract
Existe un creciente interés en medir los compuestos orgánicos volátiles (COV) emitidos por las frutas maduras con el fin de mejorar variedades o cultivares con características organolépticas mejoradas y, por lo tanto, aumentar la aceptación del consumidor. Recientemente se han desarrollado plataformas metabolómicas de alto rendimiento para cuantificar una amplia gama de metabolitos en diferentes tejidos vegetales, incluidos los compuestos clave responsables del sabor y la calidad del aroma de la fruta (volatilomics). Aquí se describe un método que utiliza la microextracción de fase sólida del espacio de cabeza (HS-SPME) junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para la identificación y cuantificación de los COV emitidos por las frutas maduras de grosella negra, una baya muy apreciada por su sabor y beneficios para la salud.
Los frutos maduros de las plantas de grosella negra (Ribes nigrum) se cosecharon y congelaron directamente en nitrógeno líquido. Después de la homogeneización del tejido para producir un polvo fino, las muestras se descongelaron e inmediatamente se mezclaron con una solución de cloruro de sodio. Después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un vial de vidrio con espacio para la cabeza que contenía cloruro de sodio. Los COV se extrajeron utilizando una fibra de microextracción en fase sólida (SPME) y un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de trampa de iones. La cuantificación volátil se realizó en los cromatogramas iónicos resultantes mediante la integración del área de pico, utilizando un ion m/z específico para cada COV. La anotación correcta de COV se confirmó comparando los tiempos de retención y los espectros de masas de los estándares comerciales puros que se ejecutan en las mismas condiciones que las muestras. Se identificaron más de 60 COV en frutas maduras de grosella negra cultivadas en lugares europeos contrastantes. Entre los COV identificados, los compuestos aromáticos clave, como los terpenoides y los volátiles C6, se pueden utilizar como biomarcadores para la calidad de la fruta de grosella negra. Además, se discuten las ventajas y desventajas del método, incluidas las posibles mejoras. Además, se ha hecho hincapié en el uso de controles para la corrección de lotes y la minimización de la intensidad de la deriva.
Introduction
El sabor es un rasgo de calidad esencial para cualquier fruta, lo que afecta la aceptación del consumidor y, por lo tanto, afecta significativamente la comercialización. La percepción del sabor implica una combinación de los sistemas gustativo y olfativo y depende químicamente de la presencia y concentración de una amplia gama de compuestos que se acumulan en partes de plantas comestibles, o en el caso de los COV, son emitidos por la fruta madura1,2. Mientras que la cría tradicional se ha centrado en rasgos agronómicos como el rendimiento y la resistencia a las plagas, la mejora de los rasgos de calidad de la fruta, incluido el sabor, se ha descuidado durante mucho tiempo debido a la complejidad genética y la dificultad para fenotipar adecuadamente estas características, lo que lleva al descontento del consumidor3,4. Los avances recientes en plataformas metabolómicas han tenido éxito en la identificación y cuantificación de compuestos clave responsables del sabor y aroma de la fruta5,6,7,8. Además, la combinación de perfiles de metabolitos con herramientas genómicas o transcriptómicas permite dilucidar la genética subyacente al sabor de la fruta, lo que a su vez ayudará a los programas de mejoramiento a desarrollar nuevas variedades con características organolépticas mejoradas2,4,9,10,11,12,13,14.
Las bayas de grosella negra (Ribes nigrum) son muy apreciadas por su sabor y propiedades nutricionales, siendo ampliamente cultivadas en las zonas templadas de Europa, Asia y Nueva Zelanda15. La mayor parte de la producción se procesa para productos alimenticios y bebidas, que son muy populares en los países nórdicos, principalmente debido a las propiedades organolépticas de las bayas. El intenso color y sabor de la fruta son el resultado de una combinación de antocianinas, azúcares, ácidos y COV presentes en las frutas maduras16,17,18. El análisis de los volátiles de la grosella negra se remonta a la década de 196019,20,21. Más recientemente, varios estudios se han centrado en los COV de grosella negra, identificando compuestos importantes para la percepción del aroma de la fruta y evaluando el impacto del genotipo, el medio ambiente o las condiciones de almacenamiento y procesamiento en el contenido de COV5,17,18,22,23.
Debido a sus numerosas ventajas, la técnica de elección para el perfilado volátil de alto rendimiento es HS-SPME/GC-MS24,25. Una fibra de sílice, recubierta con una fase polimérica, se monta en un dispositivo de jeringa, lo que permite la adsorción de los volátiles en la fibra hasta que se alcanza una fase de equilibrio. La extracción del espacio de cabeza protege la fibra de los compuestos no volátiles presentes en la matriz24. SPME puede aislar con éxito un alto número de COV presentes en concentraciones muy variables (partes por billón a partes por millón)25. Además, es una técnica libre de disolventes que requiere un procesamiento de muestras limitado. Otras ventajas de HS-SPME son la facilidad de automatización y su costo relativamente bajo.
Sin embargo, su éxito puede ser limitado, dependiendo de la naturaleza química de los COV, el protocolo de extracción (incluyendo el tiempo, la temperatura y la concentración de sal), la estabilidad de la muestra y la disponibilidad de suficiente tejido frutícola26,27. Este artículo presenta un protocolo para COV de grosella negra aislados por HS-SPME y analizados por cromatografía de gases junto con un espectrómetro de masas de trampa de iones. Se logró un equilibrio entre la cantidad de material vegetal, la estabilidad de la muestra y la duración de la extracción y la cromatografía para poder procesar un alto número de muestras de grosella negra, algunas de ellas presentadas en este estudio. En particular, los perfiles de COV y/o cromatogramas de cinco cultivares ('Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' y 'Tihope') se presentarán y discutirán como datos de ejemplo. Además, el mismo protocolo se ha puesto en práctica con éxito para la medición de COV en otras especies de bayas de frutas como la fresa (Fragaria x ananassa), la frambuesa (Rubusidaeus) y el arándano (Vaccinium spp.).
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Protocol
1. Cosecha de frutas
- Cultivar entre 4 a 6 plantas por genotipo y/o tratamiento para asegurar suficiente material frutal y variabilidad.
- Si es posible, cosechar las muestras en la misma fecha; si no hay suficiente material frutal, reúna las muestras cosechadas en diferentes fechas.
NOTA: Se recomienda que el tiempo de cosecha (mañana, mediodía, tarde) permanezca aproximadamente idéntico ya que los perfiles de COV se ven afectados por el ritmo diurno/circadiano28,29,30,31. - Evaluar la etapa de maduración del fruto mediante observación visual32. Pool frutas de la misma etapa de maduración, ya que el estado de maduración afecta fuertemente la emisión de COV. Deseche cualquier fruta dañada o infectada por patógenos.
NOTA: Para evaluar mejor la madurez de la fruta, se puede realizar un análisis de textura33. Además, contar los días después de la floración se puede utilizar para garantizar que los frutos agrupados pertenezcan a una etapa de maduración similar. - Incluya un mínimo de 10-15 frutas por réplica biológica (3 a 5) para el análisis de COV.
NOTA: Aquí, tres grupos separados de 13-20 frutas (réplicas biológicas) de los cultivares 'Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' y 'Tihope' se cosecharon en dos lugares (Polonia y Escocia) en el verano de 2018 y se congelaron directamente en nitrógeno líquido. Las muestras se enviaron al laboratorio y se procesaron como se describe a continuación. - Una vez cosechadas, congelar todas las frutas inmediatamente en nitrógeno líquido, y posteriormente almacenarlas a -80 °C hasta su procesamiento.
NOTA: Si es posible, las frutas se pueden procesar directamente después de la cosecha. En este caso, las frutas frescas pueden homogeneizarse en una batidora, pesarse y analizarse directamente (paso 3.1 en adelante). Sin embargo, para evitar que las frutas se sometan a nuevos procesos degradativos posteriores a la cosecha, el material fresco debe almacenarse en un refrigerador (4 ° C) y procesarse lo más rápido posible. Si no se maneja adecuadamente, el nitrógeno líquido puede producir quemaduras por frío y puede causar asfixia en espacios mal ventilados.
2. Preparación de muestras de frutas y reactivos
- Moler los frutos en un polvo fino, teniendo cuidado de mantenerlos siempre congelados con la ayuda de nitrógeno líquido. Use un molino criogénico, un molino de cuentas o un mortero y mortero para la homogeneización. Preenfriar frascos de molienda de acero inoxidable o mortero y mortero con nitrógeno líquido para evitar la descongelación de la muestra.
NOTA: Es fundamental homogeneizar las muestras a un polvo fino para garantizar una extracción adecuada de COV. - Pesar 1 g de material congelado (a partir del paso 2.1.) en un tubo de 5 ml que se enfríe previamente en nitrógeno líquido, y anote el peso exacto. Mantenga el material a -80 °C hasta la etapa de procesamiento 3.1.
- Incluir muestras de "referencia" o "control" en el análisis para verificar la variación técnica, incluida la extracción de COV y el rendimiento de HS-SPME / GC-MS. Para este propósito, reúna una mezcla de muestras de frutas elegidas al azar e incluya al menos una muestra de control por día para el análisis de COV. Además, utilice un estándar interno, como se describe en el paso 2.5., para minimizar el impacto de la deriva de intensidad.
- Preparar una solución de cloruro de sodio al 20% (p/v) en agua de grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (en adelante, denominada solución de NaCl). Disolver NaCl con la ayuda de un agitador magnético; asegurar la disponibilidad de 1 ml de la solución por muestra.
- Preparar una solución de 1 ppm en metanol de grado HPLC de N-pentadecano (D32, 98%) a partir de un estándar comercial puro (en adelante, el estándar interno).
NOTA: N-pentadecano-d32 se utilizará como estándar interno, y se necesitarán 5 μL por muestra. El metanol debe manipularse bajo una campana de humos. - Preparar soluciones de 1 ppm en metanol de grado HPLC de estándares comerciales puros para la identificación de COV (ver Tabla 1 para la lista de estándares comerciales utilizados en este estudio).
- Prepare viales de 10 ml de espacio de cabeza de tapón de rosca agregando 0,5 g de NaCl en cada vial necesario. Asegúrese de que los tapones de rosca incluyan un tabique compuesto de un material blando, es decir, silicona, con una película delgada de politetrafluoroetileno en el lado interno, para evitar la contaminación.
3. Preparación de la muestra
- Añadir 1 ml de solución de NaCl al tubo de 5 ml que contiene la muestra congelada pesada. Agite el tubo hasta que la muestra esté completamente descongelada y homogeneizada.
- Centrifugar a 5000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Transfiera el sobrenadante con una punta de pipeta de 1000 μL al vial de espacio de cabeza que contiene NaCl. Cortar el extremo de la punta para facilitar este proceso.
- Añadir 5 μL de patrón interno a cada vial de espacio de cabeza que contenga la muestra.
4. Adquisición de datos HS-SPME/GC-MS
- Coloque el vial de espacio de cabeza cerrado en un muestreador automático GC-MS a temperatura ambiente, para una ejecución automatizada de HS-SPME/GC-MS, que se describe en la sección 4. No coloque réplicas biológicas en posiciones sucesivas en el muestreador automático; en su lugar, distribúyalos aleatoriamente para minimizar el impacto de la deriva de intensidad.
NOTA: Se pueden colocar aproximadamente 10-12 viales a la vez en el muestreador automático, sin afectar la estabilidad de la muestra. - Preincubar los viales de espacio de cabeza 10 min a 50 °C con agitación a 17 x g.
- Inserte un dispositivo SPME en el vial para exponer la fibra al espacio de cabeza para la extracción de COV durante 30 min a 50 °C con agitación a 17 x g.
- Introduzca la fibra en el puerto de inyección durante 1 minuto a 250 °C en modo splitless para la desorción volátil.
- Limpie la fibra en una estación de limpieza SPME con nitrógeno (1 bar N2, ≥ 99.8% puro) durante 5 min a 250 °C. Reutiliza la fibra aproximadamente 100x.
- Analizar COV con un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de trampa iónica (ver la Tabla de Materiales), y realizar cromatografía bajo un flujo constante de helio (he ≥ 99,9999% de pureza) de 1 mL/min, con una columna que tiene unas dimensiones de 60 m x 0,25 mm x 1 μm de espesor. Utilice un programa de temperatura del horno que sea isotérmico a 40 °C durante 3 min, seguido de una rampa de 8 °C/min a 250 °C y que se mantenga a 250 °C durante 5 min. Para la espectrometría de masas, ajuste las temperaturas de la línea de transferencia y de la fuente de iones a 260 °C y 230 °C, respectivamente. Ajuste la energía de ionización a 70 eV y el rango de masa registrado a m/z 35-220 a 6 escaneos por s.
- Extraiga y analice soluciones de 1 ppm de estándares comerciales como se describió anteriormente. Además, ejecute una mezcla que contenga todos los estándares comerciales diluidos mezclados con una solución de NaCl de 300 μL y agua de grado HPLC de 900 μL antes de la adquisición de datos de muestra para verificar la calibración correcta del equipo. Además, incluya una muestra en blanco que contenga solución de NaCl sola en cada lote.
5. Análisis de cromatogramas de perfiles GC-MS: identificación y semicuantificación de COV
- Abra los archivos de perfil GC-MS sin procesar con el software proporcionado por el fabricante. Para identificar compuestos, comparar sus tiempos de retención y espectros de masas e índices de retención lineal de Kovats determinados a partir de los cromatogramas de las muestras con los índices de retención obtenidos a partir de estándares auténticos. Para cada estándar comercial, anote el tiempo de retención y los iones m/z más abundantes. A continuación, seleccione un ion m/z específico para cada COV (Tabla 1).
- Integre automáticamente los picos de COV en función de los tiempos de retención estándar y los iones m/z elegidos de los archivos RAW GC-MS seleccionados. Para esto, proporcione una lista para cada COV con tiempo de retención e ion m/z seleccionado. Aunque el software integra automáticamente el área de pico correspondiente al mismo tiempo de retención e ion m / z que se proporciona en la configuración de la secuencia, verifique la integración correcta de cada pico y corríjalo manualmente si es necesario.
- Calcule el área de pico de cada COV en relación con la del estándar interno para minimizar la variación instrumental y la deriva de intensidad.
NOTA: Al analizar frutas de diferentes genotipos o condiciones de crecimiento y almacenamiento, se recomienda encarecidamente determinar el contenido de COV en relación con el contenido de peso seco de la fruta para descartar efectos de dilución debido a diferencias en el contenido de agua. - Para la corrección del efecto por lotes, normalice el área de pico de COV de cada muestra al área de pico correspondiente en la muestra de control analizada en la misma ejecución.
NOTA: Se obtiene una cuantificación relativa de COV; sin embargo, para el propósito del experimento, el contenido de COV se puede determinar en relación con cualquier muestra (por ejemplo, frutas no tratadas para comparar el efecto del almacenamiento sobre los niveles de COV).
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Representative Results
El perfil de COV de alto rendimiento en un gran conjunto de cultivos frutales cultivados en diferentes condiciones o ubicaciones o que pertenecen a genotipos distintos es necesario para un fenotipado aromático preciso. Aquí, se presenta una plataforma HS-SPME/GC-MS rápida y semiautomatizada para la cuantificación relativa de COV en cultivares de grosella negra. La detección e identificación de COV se basó en una biblioteca que se desarrolló para perfilar las especies de frutos de bayas (Tabla 1). En la Figura 1A se muestra un perfil volátil típico de fruta de grosella negra madura (cromatograma iónico total) obtenido por HS-SPME/GC-MS en las condiciones antes mencionadas. En total, se identificaron 63 COV, pertenecientes a varias clases químicas, la mayoría de los cuales son ésteres (27), aldehídos (12), alcoholes (8), cetonas (7), terpenos (5) y furanos (3) (Tabla 1).
Se ha descrito que los compuestos terpenoides, ésteres y compuestos C6 dominan la volutlima de grosella negra y son importantes para el aroma de la fruta fresca5,17. De acuerdo con estos estudios previos, algunos de los picos más abundantes observados en la Figura 1A corresponden a dos monoterpenos (linalool y terpineol) y dos compuestos C6 ((E)-2-hexenal y (Z)-3-hexenal). Los espectros de masas de ejemplo obtenidos a partir de perfiles de grosella negra y su comparación con espectros de estándares comerciales puros se muestran para (E)-2-hexenal y terpineol en la Figura 1B y la Figura 1C, respectivamente.
Figura 1: Cromatogramas representativos de fruta madura de grosella negra obtenidos por HS-SPME/GC-MS (del cultivar 'Andega'). (A) Cromatograma iónico total. Los picos (Z)-3-hexenal (tiempo de retención 14.33 min), (E)-2-hexenal (15.86 min), linalool (21.65 min) y terpineol (24.01 min) se indican con los números 1, 2, 3 y 4, respectivamente. (B) Espectro de masas correspondiente al pico (E)-2-hexenal de un perfil de grosella negra y comparación con un estándar comercial puro. (C) Espectro de masas correspondiente al pico de terpineol de un perfil de grosella negra y comparación con un estándar comercial puro. Abreviatura: HS-SPME/GC-MS = microextracción en fase sólida del espacio de cabeza junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Mientras que los terpenos se han descrito como indicadores de la frescura de la fruta de grosella negra, los compuestos C6 se conocen como "volátiles de hojas verdes", impartiendo notas "verdes" al aroma de frutas y verduras34. Por lo tanto, la semicuantificación de estos COV emitidos por frutas maduras de diferentes variedades de grosella negra puede ser el primer paso para mejorar los rasgos relacionados con el sabor. Además, dado que el medio ambiente y las condiciones de crecimiento de las plantas afectan fuertemente al contenido de COV de la fruta, que es uno de los principales inconvenientes para el mejoramiento del aroma, uno de los objetivos de este estudio fue validar la hipótesis de que la semicuantificación de los COV identificados en los mismos cultivares ('Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' y 'Tihope') era reproducible en lugares europeos diametralmente opuestos como Polonia y Escocia. Como era de esperar, el análisis del componente principal (PCA) de los perfiles de COV de cuatro cultivares diferentes de grosella negra mostró que el medio ambiente afecta fuertemente el contenido volátil, ya que el componente principal (PC) 1 separa las muestras en función de su ubicación (Figura 2). Sin embargo, el efecto del genotipo se puede observar con PC2, ya que 'Ben Tirran' está claramente separado de los cultivares restantes (Figura 2).
La Figura 3 muestra el contenido relativo de linalool y (E)-2-hexenal en los cuatro cultivares de grosella negra evaluados. Para ambas ubicaciones, el contenido de COV se normalizó a la misma muestra de control, para la cual la semicuantificación confirmó que el contenido de linalool era generalmente más alto en Polonia que en Escocia, mientras que (E)-2-hexenal muestra la tendencia opuesta (Figura 3). Este resultado demuestra el impacto ambiental en el contenido de COV en las frutas de grosella negra, aunque la proporción de los dos volátiles presentes en los cuatro cultivares evaluados fue constante, con los cultivares 'Ben Tirran' y 'Ben Tron' mostrando las mayores cantidades de linalool y (E)-2-hexenal, respectivamente (Figura 3). Tomados en conjunto, estos resultados indican que el método propuesto es válido para el fenotipo de contenido de COV, y combinado con enfoques genéticos, puede utilizarse con el propósito de la mejora de la calidad de la fruta.
Figura 2: PCA para evaluar la varianza entre los perfiles de COV en los cuatro cultivares de grosella negra cultivados en Polonia y Escocia. PC1 (entorno) explica el 46,2% de la variabilidad, mientras que PC2 (genotipo) aporta el 24,8% de la varianza en el conjunto de datos. Abreviaturas: PCA = análisis de componentes principales; PC1 = primer componente principal; PC2 = segundo componente principal; COV = compuesto orgánico volátil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Contenido relativo de dos COV representativos en perfiles de aroma de grosella negra: linalool y (E)-2-hexenal, cosechados en Escocia y Polonia. Se evaluaron cuatro cultivares diferentes de grosella negra ('Ben Gairn', 'Ben Tirran', 'Ben Tron' y 'Tihope'). Las barras representan los valores medios de dos réplicas biológicas, y las barras de error representan la desviación estándar. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey para determinar diferencias significativas en el contenido de COV entre cultivares y países. Para los contenidos de COV con las mismas letras minúsculas (a, ab, b), no se observaron diferencias significativas en P < 0,05. Abreviaturas: COV = compuestos orgánicos volátiles; ANOVA = análisis de varianza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Lista de COV identificados por HS-SPME/GC-MS en frutos de grosella negra. Se indica el tiempo de retención (min), el ion m/z seleccionado para la identificación y semicuantificación de COV, la descripción del aroma, la clase química y la fórmula, y el número CAS. Abreviaturas: HS-SPME/GC-MS = microextracción en fase sólida del espacio de cabeza junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas; COV = compuestos orgánicos volátiles; KRI = índice de retención de Kovats; Número CAS = Número de registro del Servicio de Resúmenes Químicos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
La cría para el aroma de la fruta se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por la compleja genética y bioquímica que subyace a la síntesis de compuestos volátiles y la falta de tecnologías para el fenotipado adecuado. Sin embargo, los recientes avances en plataformas metabolómicas, combinados con herramientas genómicas, están permitiendo finalmente la identificación de los metabolitos responsables de las preferencias de los consumidores y de criar cultivos con sabor mejorado3. Si bien se ha logrado la mayor parte del progreso en la fruta modelo, el tomate9,10, se podrían lograr resultados similares en otras especies de cultivos económicamente relevantes como la fresa, la manzana o el arándano2,12,35,36.
Este artículo presenta una plataforma rápida y reproducible basada en HS-SPME / GC-MS que se ha utilizado con éxito para medir el contenido de COV en diferentes especies de bayas, incluida la grosella negra, una fruta muy apreciada por su delicado sabor y notable valor nutricional. En comparación con los métodos publicados anteriormente, la principal mejora se logró al disminuir el tiempo total de ejecución cromatográfica. De hecho, fue posible aumentar la rampa de temperatura de 5 °C/min a 8 °C/min con una resolución adecuada, reduciendo el tiempo cromatográfico de 50 min a 35 min (Figura 1A)27. Además, la alta cantidad de NaCl añadida a las muestras (1 ml de solución de NaCl al 20% + 0,5 g de NaCl sólido) parece tener un impacto positivo en la estabilidad de la muestra a lo largo del tiempo. De hecho, los perfiles volátiles fueron estables en el tiempo, y combinados con una cromatografía más rápida, permitieron la medición de hasta 20-22 muestras por día.
El uso de un estándar interno, como el N-pentadecano-d32, junto con una distribución adecuada de las réplicas biológicas a lo largo de la carrera, es necesario para evitar la deriva de intensidad37. Además, las muestras de control o de referencia deben ejecutarse al menos una vez al día de análisis para la corrección de lotes. Las variaciones entre lotes son causadas principalmente por cambios en la sensibilidad del detector o por el envejecimiento de la fibra27. Si bien este protocolo permitió la detección de más de 60 COV presentes en el espacio de cabeza de frutas maduras de grosella negra, los lectores deben tener en cuenta que este número se puede aumentar fácilmente agregando estándares comerciales puros en la biblioteca propuesta (Tabla 1). Por ejemplo, estudios publicados detectaron un elevado número de compuestos terpenoides que no fueron incluidos en este análisis5,17. En este sentido, una biblioteca de COV más específica de grosella negra se puede armar fácilmente, si es necesario. Sin embargo, el objetivo de este estudio fue adaptar una biblioteca previamente establecida27 para la medición de COV en diferentes bayas, incluyendo frutas de frambuesa, fresa y grosella negra.
Cabe destacar que el protocolo aquí presentado tiene varias ventajas y desventajas, al igual que otras plataformas HS-SPME/GC-MS, que ya han sido discutidas en otra parte25,26,38. Si bien ofrece facilidad de automatización, convirtiéndola en la técnica de elección cuando se requiere analizar un gran número de muestras, su principal inconveniente es su susceptibilidad a los efectos de la matriz38. Además, se debe tener especial precaución durante la selección del recubrimiento de fibra SPME y con las condiciones de muestreo dependiendo de la naturaleza química de los COV objetivo25,27. Para concluir, aquí se presenta un protocolo rápido y semiautomatizado para el perfil de COV en el espacio de cabeza de la fruta de bayas y podría adaptarse fácilmente para su uso con un mayor tamaño de biblioteca, si es necesario. Se espera que esta plataforma se pueda adaptar a otras especies frutales y cuando se combine con estudios genómicos y / o paneles de análisis sensorial ayudará a la elaboración de perfiles y mejoras del aroma del cultivo.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Málaga las mediciones de HS-SPME/GC-MS. Agradecemos la asistencia de Sara Fernández-Palacios Campos en la cuantificación volátil. También agradecemos a los miembros del consorcio de GoodBerry por proporcionar el material de fruta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
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