Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Headspace Katı Faz Mikroextraction Kullanarak Frenk Üzümü Meyvesinde Uçucu Bileşiklerin Profillemesi

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62421
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Summary

Olgun frenk üzümü meyvelerinde hızlı, güvenilir ve yarı otomatik uçucu tanımlama ve niceleme için burada bir headspace katı faz mikroextraction-gaz kromatografi platformu açıklanmıştır. Bu teknik, meyve aroması hakkındaki bilgileri artırmak ve üreme amacıyla gelişmiş lezzete sahip kültivarları seçmek için kullanılabilir.

Abstract

Gelişmiş organoleptik özelliklere sahip çeşitlerin veya kültivarların yetiştirilmesi amacıyla olgun meyvelerin yaydığı uçucu organik bileşiklerin (VOC' ler) ölçülmesine ve böylece tüketici kabulünün artırılmasına yönelik artan bir ilgi vardır. Yüksek verimli metabolomik platformlar, meyve tadı ve aroma kalitesinden (volatilomics) sorumlu temel bileşikler de dahil olmak üzere farklı bitki dokularında çok çeşitli metabolitleri ölçmek için geliştirilmiştir. Tat ve sağlık yararları ile çok takdir edilen olgun frenk üzümü meyveleri tarafından yayılan VOC'lerin tanımlanması ve ölçülmesi için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile birlikte headspace katı faz mikroextraction (HS-SPME) kullanan bir yöntem burada açıklanmıştır.

Frenk üzümü bitkilerinin olgun meyveleri (Ribes nigrum) hasat edildi ve doğrudan sıvı nitrojende donduruldu. İnce bir toz üretmek için doku homojenizasyonu yapıldıktan sonra, numuneler çözüldü ve hemen sodyum klorür çözeltisi ile karıştırıldı. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant sodyum klorür içeren bir kafa boşluğu cam şişesine aktarıldı. VOC'ler daha sonra bir katı fazlı mikroextraction (SPME) fiberi ve bir iyon kapan kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı kullanılarak çıkarıldı. Elde edilen iyon kromatogramlarında uçucu niceleme, her VOC için belirli bir m/z iyon kullanılarak, tepe alanını entegre ederek gerçekleştirildi. Doğru VOC ek açıklaması, numunelerle aynı koşullar altında çalışan saf ticari standartların tutma süreleri ve kütle spektrumları karşılaştırılarak doğrulandı. Avrupa'nın zıt yerlerinde yetişen olgun frenk üzümü meyvelerinde 60'tan fazla VOC tespit edildi. Tanımlanan VOC'ler arasında terpenoidler ve C6 uçucuları gibi temel aroma bileşikleri, frenk üzümü meyve kalitesi için biyobelirteç olarak kullanılabilir. Ek olarak, olası iyileştirmeler de dahil olmak üzere yöntemin avantajları ve dezavantajları tartışılmaktadır. Ayrıca, toplu düzeltme ve sürüklenme yoğunluğunun en aza indirilmesi için kontrollerin kullanımı vurgulanmıştır.

Introduction

Lezzet, herhangi bir meyve için temel bir kalite özelliğidir, tüketici kabullerini etkiler ve böylece pazarlanabilirliği önemli ölçüde etkiler. Lezzet algısı, tat ve koku alma sistemlerinin bir kombinasyonunu içerir ve kimyasal olarak yenilebilir bitki parçalarında biriken veya VOC'ler durumunda olgun meyve tarafından yayılan çok çeşitli bileşiklerin varlığına ve konsantrasyonuna bağlıdır1,2. Geleneksel ıslah verim ve haşere direnci gibi agronomik özelliklere odaklanırken, lezzet de dahil olmak üzere meyve kalitesi özelliği iyileştirmesi, genetik karmaşıklık ve bu özellikleri düzgün bir şekilde fenotipleme zorluğu nedeniyle uzun zamandır ihmal edilmiş ve tüketici hoşnutsuzluğuna yol almıştır3,4. Metabolomik platformlardaki son gelişmeler, meyve tadı ve aromadan sorumlu temel bileşikleri belirleme ve ölçmede başarılı olmuştur5,6,7,8. Ayrıca, metabolit profillemenin genomik veya transkriptomik araçlarla kombinasyonu, üreme programlarının gelişmiş organoleptik özelliklere sahip yeni çeşitler geliştirmesine yardımcı olacak temel meyve lezzetinin alaşım edilmesine izin verir2,4,9,10,11,12,13,14.

Frenk üzümü (Ribes nigrum) meyveleri, Avrupa, Asya ve Yeni Zelanda'nın ılıman bölgelerinde yaygın olarak yetiştirilen lezzet ve besin özellikleri ile çok takdir edilmektedir15. Üretimin çoğu, esas olarak meyvelerin organoleptik özellikleri nedeniyle İskandinav ülkelerinde çok popüler olan gıda ürünleri ve içecekler için işlenir. Meyvenin yoğun rengi ve lezzeti, olgun meyvelerde bulunan antosiyaninler, şekerler, asitler ve VOC'lerin bir kombinasyonunun sonucudur16,17,18. Frenk üzümü uçucularının analizi 1960'lı yıllara kadar uzanıyor19,20,21. Daha yakın zamanlarda, çeşitli çalışmalar siyah frenk üzümü VOC'lerine odaklanmış, meyve aroması algısı için önemli bileşikleri tanımlamış ve genotip, çevre veya depolama ve işleme koşullarının VOC içeriği üzerindeki etkisini değerlendirmektedir5,17,18,22,23.

Çok sayıda avantajı nedeniyle, yüksek verimli geçici profil oluşturma için tercih tekniği HS-SPME/GC-MS24,25'tir. Polimerik faz ile kaplanmış bir silika elyaf, bir şırıngam cihazına monte edilir ve bir denge aşamasına ulaşılana kadar lifdeki uçucuların adsorpsiyonunun sağlanmasını sağlar. Headspace ekstraksiyonu, elyafı matriste bulunan kalıcı bileşiklerden korur24. SPME, yüksek değişken konsantrasyonlarda (milyarda bir parça ile milyonda bir parça) bulunan yüksek sayıda VOC'yi başarıyla izole edebilir 25. Ek olarak, sınırlı numune işleme gerektiren solvent içermeyen bir tekniktir. HS-SPME'nin diğer avantajları otomasyon kolaylığı ve nispeten düşük maliyetidir.

Bununla birlikte, VOC'lerin kimyasal doğasına, ekstraksiyon protokolüne (zaman, sıcaklık ve tuz konsantrasyonu dahil), numune stabilitesine ve yeterli meyve dokusunun mevcudiyetine bağlı olarak başarısı sınırlanabilir26,27. Bu makale, HS-SPME tarafından izole edilen ve bir iyon kapan kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ile analiz edilen siyah frenk üzümü VOC'leri için bir protokol sunun. Bazıları bu çalışmada sunulan yüksek sayıda frenk üzümü örneğini işleyebilmek için bitki materyali miktarı, numune stabilitesi ve ekstraksiyon süresi ile kromatografi arasında bir denge sağlanmıştır. Özellikle, beş kültivarın ('Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' ve 'Tihope') VOC profilleri ve/veya kromatogramları örnek veri olarak sunulacak ve tartışılacaktır. Ayrıca, çilek (Fragaria x ananassa), ahududu (Rubusidaeus) ve yaban mersini (Vaccinium spp.) gibi diğer meyveli meyve türlerinde VOC ölçümü için aynı protokol başarıyla uygulamaya konmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Meyve hasadı

  1. Yeterli meyve malzemesi ve değişkenlik sağlamak için genotip ve/veya arıtma başına 4 ila 6 bitki yetiştirin.
  2. Mümkünse, örnekleri aynı tarihte hasat edin; yeterli meyve malzemesi yoksa, farklı tarihlerde hasat edilen örnekleri bir araya toplayın.
    NOT: VOC profilleri gündüz/sirkadiyen ritimden etkilendiği için hasat zamanının (sabah, öğle, öğleden sonra) yaklaşık olarak aynı kalması önerilir28,29,30,31.
  3. Meyve olgunlaşma aşamasını görsel gözlem ile değerlendirin32. Olgunlaşma durumu VOC emisyonunu güçlü bir şekilde etkilediği için aynı olgunlaşma aşamasından itibaren meyveleri havuza edin. Hasarlı veya patojen bulaşmış meyveleri atın.
    NOT: Meyve olgunluğunu daha iyi değerlendirmek için doku analizi yapılabilir33. Ek olarak, çiçeklenmeden günler sonra saymak, havuzalanmış meyvelerin benzer bir olgunlaşma aşamasına ait olmasını sağlamak için kullanılabilir.
  4. VOC analizi için biyolojik çoğaltma başına en az 10-15 meyve (3 ila 5) ekleyin.
    NOT: Burada, 2018 yazında iki yerde (Polonya ve İskoçya) 13-20 meyveden (biyolojik çoğalmalar) oluşan üç ayrı havuz hasat edildi ve doğrudan sıvı nitrojen içinde donduruldu. Numuneler daha sonra laboratuvara gönderildi ve aşağıda açıklandığı gibi işlendi.
  5. Hasat edildikten sonra, tüm meyveleri sıvı nitrojende hemen dondurun ve daha sonra işlemeye kadar -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Mümkünse, meyveler hasat sonrası doğrudan işlenebilir. Bu durumda, taze meyveler bir karıştırıcıda homojenize edilebilir, tartılabilir ve doğrudan analiz edilebilir (adım 3.1'den itibaren). Bununla birlikte, meyvelerin daha fazla postharvest bozunma sürecini önlemek için, taze malzeme bir soğutucuda (4 °C) saklanmalı ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde işlenmelidir. Düzgün bir şekilde ele alınmazsa, sıvı azot soğuk yanıklar üretebilir ve kötü havalandırılan alanlarda boğulmaya neden olabilir.

2. Meyve örneği ve reaktif hazırlama

  1. Meyveleri ince bir toz haline getirin, sıvı azot yardımıyla her zaman donmuş tutmaya özen edin. Homojenizasyon için kriyojenik bir değirmen, boncuk değirmeni veya harç ve pestil kullanın. Numunenin çözülmesini önlemek için ön soğutma paslanmaz taşlama kavanozları veya sıvı azotlu harç ve pestle.
    NOT: Uygun VOC ekstraksiyonunu sağlamak için numuneleri ince bir toz haline getirmek önemlidir.
  2. Daha önce sıvı nitrojenle soğutulan 5 mL'lik bir tüpte 1 g dondurulmuş malzemeyi (adım 2.1.'den itibaren) tartın ve tam ağırlığı not edin. 3.1. adımı işleyene kadar malzemeyi -80 °C'de tutun.
  3. VOC ekstraksiyonu ve HS-SPME/GC-MS performansı da dahil olmak üzere teknik varyasyonu kontrol etmek için analize 'referans' veya 'kontrol' örnekleri ekleyin. Bu amaçla, rastgele seçilmiş meyve örneklerinin bir karışımını bir araya getirin ve VOC analizi için günde en az bir kontrol örneği ekleyin. Ayrıca, yoğunluk kaymasının etkisini en aza indirmek için adım 2.5.'de açıklandığı gibi bir iç standart kullanın.
  4. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı suda %20 (w/v) sodyum klorür çözeltisi hazırlayın (bundan böyle NaCl çözeltisi olarak anılacaktır). NaCl'yi manyetik bir karıştırıcı yardımıyla çözün; numune başına çözeltinin 1 mL kullanılabilirliğini sağlayın.
  5. Saf ticari standarttan (bundan böyle iç standart olarak anılacaktır) N-pentadecane (D32, %98) HPLC sınıfı metanolde 1 ppm'lik bir çözelti hazırlayın.
    NOT: N-pentadecane-d32 dahili standart olarak kullanılacak ve numune başına 5 μL'ye ihtiyaç duyulacaktır. Metanol duman kaputunun altında manipüle edilmelidir.
  6. VOC tanımlaması için saf ticari standartlarda HPLC sınıfı metanolde 1 ppm çözümleri hazırlayın (bu çalışmada kullanılan ticari standartların listesi için Tablo 1'e bakın).
  7. Gerekli her şişeye 0,5 g NaCl ekleyerek 10 mL vidalı kapak kafa boşluğu şişeleri hazırlayın. Vida kapaklarının kirlenmeyi önlemek için yumuşak bir malzemeden, yani silikondan oluşan, iç tarafında ince bir politetrafloroetilen film bulunan bir septum içerdiğinden emin olun.

3. Örnek hazırlama

  1. Tartılmış donmuş numuneyi içeren 5 mL'lik boruya 1 mL NaCl çözeltisi ekleyin. Numune tamamen çözülene ve homojenize olana kadar tüpü sallayın.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 × g'da santrifüj.
  3. 1000 μL pipet ucuna sahip süpernatantı NaCl içeren kafa boşluğu şişesine aktarın. Bu işlemi kolaylaştırmak için ucun ucunu kesin.
  4. Örnek içeren her kafa boşluğu şişesine 5 μL dahili standart ekleyin.

4. HS-SPME/GC-MS veri toplama

  1. Kapalı kafa boşluğu şişesini, bölüm 4'te açıklanan otomatik HS-SPME/GC-MS çalışması için oda sıcaklığında bir GC-MS otomatik örnekleyicisine yerleştirin. Biyolojik çoğalmaları otosamplerde ardışık pozisyonlara yerleştirmeyin; bunun yerine, yoğunluk kaymasının etkisini en aza indirmek için bunları rastgele dağıtın.
    NOT: Örnek stabilitesini etkilemeden otosampler içine aynı anda yaklaşık 10-12 şişe yerlenebilir.
  2. Kafa boşluğu şişelerini 50 °C'de 10 dakika önceden 17 x g'da ajitasyon ile ön kuluçkaya yatırın.
  3. Elyafı 50 °C'de 30 dakika boyunca VOC ekstraksiyonu için kafa boşluğuna 17 x g'da ajitasyon ile maruz bırakmak için şişeye bir SPME cihazı yerleştirin.
  4. Uçucu desorpsiyon için fiberi 250 °C'de 1 dakika boyunca bölmesiz modda enjeksiyon portuna sokun.
  5. Spme temizleme istasyonundaki elyafı 250 °C'de 5 dakika boyunca azot (1 bar N2, ≥ % 99,8 saf) ile temizleyin. Lifi yaklaşık 100x yeniden kullanın.
  6. VOC'leri bir iyon bindirme kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı ile analiz edin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 60 m x 0,25 mm x 1 μm kalınlığında bir sütunla 1 mL/dk'lık sabit bir helyum akışı (%99,9999 saflık ≥ta) altında kromatografi gerçekleştirin. 3 dakika boyunca 40 °C'de izotermal olan bir fırın sıcaklık programı kullanın, ardından 250 °C'ye 8 °C/dk rampa ve 5 dakika boyunca 250 °C'de tutun. Kütle spektrometresi için, transfer hattını ve iyon kaynağı sıcaklıklarını sırasıyla 260 °C ve 230 °C olarak ayarlayın. İyonlaşma enerjisini 70 eV'ye ve kaydedilen kütle aralığını 6 taramada m/z 35-220'ye ayarlayın.
  7. Yukarıda açıklandığı gibi ticari standartlarda 1 ppm çözümleri çıkarın ve analiz edin. Ek olarak, ekipmanın doğru kalibrasyonunu kontrol etmek için numune veri toplamadan önce 300 μL NaCl çözeltisi ve 900 μL HPLC sınıfı su ile karıştırılmış tüm seyreltilmiş ticari standartları içeren bir karışım çalıştırın. Ayrıca, her toplu işlemde tek başına NaCl çözümü içeren boş bir örnek ekleyin.

5. GC-MS profil kromatogramlarının analizi: VOC tanımlaması ve yarı nicelleştirme

  1. Ham GC-MS profil dosyalarını üretici tarafından sağlanan yazılımla açın. Bileşikleri tanımlamak için, örneklerin kromatogramlarından belirlenen tutma sürelerini ve kütle spektra ve Kovats doğrusal tutma endekslerini otantik standartlardan elde edilen tutma endeksleriyle karşılaştırın. Her ticari standart için, açıklama saklama süresi ve en bol m /z iyonları. Ardından, her VOC için belirli bir m/z iyon seçin (Tablo 1).
  2. Voc tepelerini standart saklama sürelerine ve seçilen GC-MS ham dosyalarının seçilen m/z iyonlarına göre otomatik olarak entegre edin. Bunun için, saklama süresi ve seçilen m/z iyon ile her VOC için bir liste sağlayın. Yazılım, sıra kurulumunda belirtildiği gibi aynı saklama süresine ve m/z iyona karşılık gelen tepe alanını otomatik olarak entegre etse de, her tepenin doğru entegrasyonunu kontrol edin ve gerekirse manuel olarak düzeltin.
  3. Enstrümantal varyasyonu ve yoğunluk kaymasını en aza indirmek için her VOC'nin en yüksek alanını iç standardınkine göre hesaplayın.
    NOT: Farklı genotiplerden veya büyüme ve depolama koşullarından meyve analiz edilirken, su içeriğindeki farklılıklar nedeniyle seyreltme etkilerini ekarte etmek için meyve kuru ağırlık içeriğine göre VOC içeriğinin belirlenmesi şiddetle tavsiye edilir.
  4. Toplu etki düzeltmesi için, her numunenin VOC tepe alanını, aynı çalıştırmada analiz edilen kontrol örneğindeki ilgili tepe alanına normalleştirin.
    NOT: Göreli bir VOC nicelleştirmesi elde edilir; ancak, denemenin amacı için, VOC içeriği daha sonra herhangi bir örneğe göre belirlenebilir (örneğin, depolamanın VOC seviyeleri üzerindeki etkisini karşılaştırmak için işlem edilmemiş meyveler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farklı koşullar veya konumlar altında yetiştirilen veya farklı genotiplere ait büyük bir meyve mahsulü kümesinde yüksek verimli VOC profilleme, doğru aroma fenotipleme için gereklidir. Burada, siyah frenk üzümü kültivarlarında göreli VOC nicelemesi için hızlı ve yarı otomatik bir HS-SPME/GC-MS platformu sunulmaktadır. VOC tespiti ve tanımlanması, meyve meyve türlerinin profilini çıkarmak için geliştirilen bir kütüphaneye dayanıyordu (Tablo 1). HS-SPME/GC-MS tarafından yukarıda belirtilen koşullarda elde edilen tipik olgun frenk üzümü meyve uçucu profili (toplam iyon kromatogramı) Şekil 1A'da gösterilmiştir. Toplamda, çoğunluğu ester (27), aldehitler (12), alkoller (8), ketonlar (7), terpenler (5) ve furanlar (3) olmak üzere çeşitli kimyasal sınıflara ait 63 VOC tespit edildi (Tablo 1).

Terpenoid bileşikleri, esterler ve C6 bileşiklerinin frenk üzümü volatilomlarına hakim olduğu ve taze meyvenin aroması için önemli olduğu tanımlanmıştır5,17. Bu önceki çalışmalarla uyumlu olarak, Şekil 1A'da gözlenen en bol zirvelerden bazıları iki monoterpen (linalool ve terpineol) ve iki C6 bileşiğine ((E)-2-altıgen ve (Z)-3-altıgen) karşılık gelir. Siyah frenk üzümü profillerinden elde edilen örnek kütle spektrumları ve bunların saf ticari standartların spektrumları ile karşılaştırılması sırasıyla Şekil 1B ve Şekil 1C'de (E)-2-hexenal ve terpineol için gösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: HS-SPME/GC-MS ('Andega' cultivar'dan) tarafından elde edilen olgun frenk üzümü meyvesinden temsili kromatogramlar). (A) Toplam iyon kromatogramı. (Z)-3-hexenal (Tutma süresi 14,33 dk), (E)-2 altıgen (15,86 dk), linalool (21,65 dk) ve terpineol (24,01 dk) zirveleri sırasıyla 1, 2, 3 ve 4 sayılarıyla belirtilir. (B) Siyah frenk üzümü profilinden (E)-2-hexenal tepeye karşılık gelen kütle spektrumu ve saf bir ticari standartla karşılaştırma. (C) Siyah frenk üzümü profilinden terpineol zirvesine karşılık gelen kütle spektrumu ve saf bir ticari standartla karşılaştırma. Kısaltma: HS-SPME/GC-MS = gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birlikte headspace katı fazlı mikroextraction. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Terpenler siyah frenk üzümü meyve tazeliğinin göstergeleri olarak tasvir edilirken, C6 bileşikleri meyve ve sebze aromasına 'yeşil' notalar vererek 'yeşil yaprak uçucuları' olarak bilinir34. Bu nedenle, farklı frenk üzümü çeşitlerinin olgun meyveleri tarafından yayılan bu VOC'lerin yarı nicelemesi, lezzetle ilgili özellikleri iyileştirmenin ilk adımı olabilir. Ayrıca, çevre ve bitki büyüme koşulları meyve VOC içeriğini güçlü bir şekilde etkilediğinden, aroma yetiştiriciliğinin ana dezavantajlarından biri olan bu çalışmanın amaçlarından biri, aynı kültivarlarda ('Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran', ve 'Tihope') tanımlanan VOC'lerin yarı nicelemesinin Polonya ve İskoçya gibi taban tabana zıt Avrupa konumlarında tekrarlanabilir olduğu hipotezini doğrulamaktı. Beklendiği gibi, dört farklı frenk üzümü kültivasyonunun VOC profillerinin ana bileşen analizi (PCA), ana bileşen (PC) 1'in örnekleri konumlarına göre ayırması nedeniyle ortamın uçucu içeriği güçlü bir şekilde etkilediğini göstermiştir (Şekil 2). Bununla birlikte, genotipin etkisi PC2 ile gözlenebilir, çünkü 'Ben Tirran' kalan kültivarlardan açıkça ayrılmıştır (Şekil 2).

Şekil 3, değerlendirilen dört frenk üzümü kültivüründe linalool ve (E)-2-hexenal'in göreli içeriğini göstermektedir. Her iki konum için de VOC içeriği aynı kontrol örneğinde normalleştirildi ve yarı niceleme, linalool içeriğinin Polonya'da genellikle İskoçya'dan daha yüksek olduğunu doğrularken, (E)-2-hexenal tam tersi bir eğilim göstermektedir (Şekil 3). Bu sonuç, değerlendirilen dört kültivarda bulunan iki uçucunun oranı sabit olmasına rağmen, 'Ben Tirran' ve 'Ben Tron' kültivarlarının sırasıyla en yüksek miktarda linalool ve (E)-2-altıgen göstermesine rağmen, siyah frenk üzümü meyvelerindeki VOC içeriği üzerindeki çevresel etkiyi göstermektedir (Şekil 3). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar önerilen yöntemin fenotip VOC içeriği için geçerli olduğunu ve genetik yaklaşımlarla birlikte meyve kalitesinde üreme amacıyla kullanılabileceğini göstermektedir.

Figure 2
Şekil 2: Polonya ve İskoçya'da yetişen dört frenk üzümü kültivatöründe VOC profilleri arasındaki farklılığı değerlendirmek için PCA. PC1 (ortam) değişkenliğin %46,2'sini açıklarken, PC2 (genotip) veri kümesindeki varyansların %24,8'ine katkıda bulunur. Kısaltmalar: PCA = ana bileşen analizi; PC1 = birinci ana bileşen; PC2 = ikinci ana bileşen; VOC = uçucu organik bileşik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İskoçya ve Polonya'da hasat edilen siyah frenk üzümü aroma profilleri-linalool ve (E)-2-altıgen iki temsili VOC'nin göreli içeriği. Dört farklı frenk üzümü kültivarı değerlendirildi ('Ben Gairn', 'Ben Tirran', 'Ben Tron', ve 'Tihope'). Çubuklar iki biyolojik yinelemenin ortalama değerlerini, hata çubukları ise standart sapmayı temsil eder. İstatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü ANOVA tarafından gerçekleştirildi ve ardından Tukey'in kültivarlar ve ülkeler arasındaki VOC içeriğindeki önemli farklılıkları belirlemek için geçici sonrası testi yapıldı. Aynı küçük harflere (a, ab, b) sahip VOC içerikleri için P < 0.05'te önemli bir fark gözlenmedi. Kısaltmalar: VOC'ler = uçucu organik bileşikler; ANOVA = varyans analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: HS-SPME/GC-MS tarafından frenk üzümü meyvelerinde tanımlanan VOC'lerin listesi. Tutma süresi (min), VOC tanımlaması ve yarı nicelleştirme için seçilen m/z iyon, aroma tanımı, kimyasal sınıf ve formül ve CAS numarası belirtilir. Kısaltmalar: HS-SPME/GC-MS = gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikroextraction; VOC'ler = uçucu organik bileşikler; KRI = Kovats saklama indeksi; CAS numarası = Chemical Abstracts Service kayıt numarası. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Meyve aroması için üreme, uçucu bileşiklerin sentezinin altında kalan karmaşık genetik ve biyokimya ve uygun fenotipleme için teknolojilerin eksikliği nedeniyle uzun zamandır engellenmiştir. Bununla birlikte, metabolomik platformlardaki son gelişmeler, genomik araçlarla birlikte, nihayet tüketici tercihlerinden sorumlu metabolitlerin tanımlanmasına ve gelişmiş lezzete sahip mahsullerin yetiştirilmesine izin vermektedir3. Model meyve, domates9,10'da en fazla ilerleme elde edilmiş olsa da, çilek, elma veya yaban mersini gibi ekonomik olarak ilgili diğer mahsul türlerinde de benzer sonuçlar elde edilebilir2,12,35,36.

Bu makale, narin lezzeti ve dikkat çekici besin değeri ile çok beğenilmiş bir meyve olan blackcurrant da dahil olmak üzere farklı meyve türlerinde VOC içeriğini ölçmek için başarıyla kullanılan hızlı ve tekrarlanabilir bir HS-SPME / GC-MS tabanlı platform sunun. Daha önce yayınlanan yöntemlerle karşılaştırıldığında, ana iyileşme toplam kromatografik çalışma süresinin azaltılmasıyla sağlanmıştır. Nitekim, sıcaklık rampasını yeterli çözünürlükle 5 °C/dk'dan 8 °C/dk'ya çıkarmak, kromatografik süreyi 50 dakikadan 35 dakikaya düşürmek mümkündü (Şekil 1A)27. Ayrıca, numunelere eklenen yüksek miktarda NaCl (1 mL% 20 NaCl çözeltisi + 0,5 g katı NaCl) zaman içinde numune kararlılığını olumlu yönde etkileyecek gibi görünmektedir. Gerçekten de, uçucu profiller zamanla kararlıydı ve daha hızlı kromatografi ile birlikte günde 20-22 numunenin ölçümüne izin verdi.

N-pentadecane-d32 gibi bir iç standardın kullanımı, koşu boyunca biyolojik çoğalımların uygun bir dağılımı ile birlikte, yoğunluk sürüklenmesini önlemek için gereklidir37. Ayrıca, toplu düzeltme için denetim veya başvuru örnekleri günde en az bir kez analiz çalıştırılmalıdır. Partiler arasındaki değişimler esas olarak dedektör hassasiyetindeki değişikliklerden veya fiber yaşlanmadan kaynaklanır27. Bu protokol, olgun frenk üzümü meyvelerinin kafa boşluğunda bulunan 60'tan fazla VOC'nin algılanmasını sağlarken, okuyucular önerilen kütüphaneye saf ticari standartlar eklenerek bu sayının kolayca artırılabileceğini dikkate almalıdır (Tablo 1). Örneğin, yayınlanan çalışmalarda bu analizde yer almamış çok sayıda terpenoid bileşik tespit edilmiştir5,17. Bu anlamda, gerekirse daha siyah frenk üzümü aromaya özgü bir VOC kütüphanesi kolayca bir araya getirilebilir. Bununla birlikte, bu çalışmanın amacı, ahududu, çilek ve frenk üzümü meyveleri de dahil olmak üzere farklı meyvelerde VOC ölçümü için daha önce kurulmuş bir kütüphane27'yi uyarlamaktı.

Burada sunulan protokolün, diğer HS-SPME / GC-MS platformları gibi, başka bir yerde tartışılan çeşitli avantajlara ve dezavantajlara sahip olması dikkat çekicidir25,26,38. Otomasyon kolaylığı sunarken, çok sayıda numunenin analiz edilmesi gerektiğinde tercih edilen teknik haline getirirken, ana dezavantajı matris etkilerine duyarlılığıdır38. Ayrıca SPME fiber kaplama seçimi sırasında ve hedeflenen VOC'lerin kimyasal niteliğine bağlı olarak örnekleme koşulları ile özel dikkat gösterilmelidir25,27. Sonuç olarak, meyve meyvesi kafa alanında VOC profilleme için hızlı ve yarı otomatik bir protokol burada sunulmaktadır ve gerekirse daha yüksek bir kütüphane boyutu ile kullanıma kolayca uyarlanabilir. Bu platformun diğer meyve türlerine uyarlanabilmesi ve genomik çalışmalar ve/veya duyusal analiz paneli ile birleştirildiğinde mahsul aroma profilleme ve iyileştirmesine yardımcı olması beklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Acknowledgments

Yazarlar, HS-SPME/GC-MS ölçümleri için Malaga Üniversitesi'nden Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación'a teşekkür ediyor. Sara Fernández-Palacios Campos'un uçucu nicelikteki yardımını kabul ediyoruz. GoodBerry'nin konsorsiyum üyelerine de meyve malzemesini sağladıkları için teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL screw top headspace vials Thermo Scientific 10-HSV
18 mm screw cap Silicone/PTFE Thermo Scientific 18-MSC
5 mL Tube with HDPE screw cap VWR 216-0153
Centrifuge Thermo Scientific 75002415
Methanol for HPLC Merck 34860-1L-R
N-pentadecane (D32, 98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-1283-1
Sodium chloride Merck S9888
SPME fiber PDMS/DVB Merck 57345-U
Stainless grinding jars for TissueLyser Qiagen 69985
TissueLyser II Qiagen 85300 Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill
Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Triplus RSH autosampler with automated SPME device Thermo Scientific 1R77010-0450
Water for HPLC Merck 270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1 Thermo Scientific software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
  2. Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
  3. Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
  4. Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
  5. Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
  6. Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
  7. Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
  8. Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
  9. Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
  10. Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
  11. Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
  12. Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
  13. Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
  14. Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
  15. Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
  16. Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
  17. Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
  18. Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
  19. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
  20. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
  21. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
  22. Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
  23. Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
  24. Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
  25. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
  26. Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
  27. Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
  28. Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
  29. Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
  30. Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
  31. Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
  32. Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
  33. Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
  34. Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
  35. Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
  36. Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
  37. Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
  38. Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).

Tags

Biyokimya Sayı 172 Volatalomics VOC'ler Aroma Meyve Ribes nigrum HS-SPME/GC-MS
Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Headspace Katı Faz Mikroextraction Kullanarak Frenk Üzümü Meyvesinde Uçucu Bileşiklerin Profillemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pott, D. M., Vallarino, J. G.,… More

Pott, D. M., Vallarino, J. G., Osorio, S. Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62421, doi:10.3791/62421 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter