Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تنميط المركبات المتطايرة في فاكهة الكشمش الأسود باستخدام الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62421
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Summary

يتم وصف منصة استخراج الغاز والكروماتوغرافيا ذات الطور الصلب في مساحة الرأس هنا لتحديد وقياس كمية متطايرة سريعة وموثوقة وشبه آلية في ثمار الكشمش الأسود الناضجة. يمكن استخدام هذه التقنية لزيادة المعرفة حول رائحة الفاكهة واختيار الأصناف ذات النكهة المحسنة لغرض التربية.

Abstract

هناك اهتمام متزايد بقياس المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) المنبعثة من الثمار الناضجة لغرض تربية الأصناف أو الأصناف ذات الخصائص الحسية المحسنة وبالتالي زيادة قبول المستهلك. تم مؤخرا تطوير منصات استقلابية عالية الإنتاجية لتحديد مجموعة واسعة من المستقلبات في الأنسجة النباتية المختلفة ، بما في ذلك المركبات الرئيسية المسؤولة عن طعم الفاكهة وجودة الرائحة (volatilomics). يتم وصف طريقة تستخدم الاستخراج المجهري للطور الصلب (HS-SPME) إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي (GC-MS) هنا لتحديد وقياس كمية المركبات العضوية المتطايرة المنبعثة من ثمار الكشمش الأسود الناضجة ، وهو توت يحظى بتقدير كبير لنكهته وفوائده الصحية.

تم حصاد الثمار الناضجة لنباتات الكشمش الأسود (Ribes nigrum) وتجميدها مباشرة في النيتروجين السائل. بعد تجانس الأنسجة لإنتاج مسحوق ناعم ، تم إذابة العينات وخلطها على الفور بمحلول كلوريد الصوديوم. بعد الطرد المركزي ، تم نقل المادة الفائقة إلى قارورة زجاجية في مساحة الرأس تحتوي على كلوريد الصوديوم. ثم تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة باستخدام ألياف الاستخراج المجهري للطور الصلب (SPME) وكروماتوغراف الغاز إلى جانب مطياف كتلة مصيدة الأيونات. تم إجراء القياس الكمي المتطاير على الكروماتوجرامات الأيونية الناتجة عن طريق دمج منطقة الذروة ، باستخدام أيون m / z محدد لكل VOC. تم تأكيد التعليق التوضيحي الصحيح للمركبات العضوية المتطايرة من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ وأطياف الكتلة للمعايير التجارية البحتة التي تعمل في ظل نفس ظروف العينات. تم تحديد أكثر من 60 مركبات عضوية متطايرة في ثمار الكشمش الأسود الناضجة المزروعة في مواقع أوروبية متناقضة. من بين المركبات العضوية المتطايرة المحددة ، يمكن استخدام مركبات الرائحة الرئيسية ، مثل التربينويدات والمتطايرة C6 ، كمؤشرات حيوية لجودة فاكهة الكشمش الأسود. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة مزايا وعيوب الطريقة ، بما في ذلك التحسينات المحتملة. وعلاوة على ذلك، تم التشديد على استخدام الضوابط لتصحيح الدفعات والتقليل إلى أدنى حد من شدة الانجراف.

Introduction

النكهة هي سمة جودة أساسية لأي فاكهة ، مما يؤثر على قبول المستهلك وبالتالي يؤثر بشكل كبير على قابلية التسويق. يتضمن إدراك النكهة مزيجا من أنظمة الذوق والشم ويعتمد كيميائيا على وجود وتركيز مجموعة واسعة من المركبات التي تتراكم في أجزاء نباتية صالحة للأكل ، أو في حالة المركبات العضوية المتطايرة ، تنبعث من الفاكهة الناضجة1,2. في حين ركزت التربية التقليدية على الصفات الزراعية مثل الغلة ومقاومة الآفات، فإن تحسين سمات جودة الفاكهة، بما في ذلك النكهة، قد أهمل منذ فترة طويلة بسبب التعقيد الوراثي وصعوبة النمط الظاهري الصحيح لهذه الخصائص، مما أدى إلى استياء المستهلك3،4. نجحت التطورات الحديثة في منصات الأيض في تحديد وقياس المركبات الرئيسية المسؤولة عن طعم الفاكهة ورائحتها5،6،7،8. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين التنميط الأيضي والأدوات الجينومية أو النسخية يسمح بتوضيح علم الوراثة الكامن وراء نكهة الفاكهة، والتي بدورها ستساعد برامج التربية على تطوير أصناف جديدة ذات خصائص حسية محسنة2،4،9،10،11،12،13،14.

يحظى توت الكشمش الأسود (Ribes nigrum) بتقدير كبير لنكهته وخصائصه الغذائية ، حيث يتم زراعته على نطاق واسع في المناطق المعتدلة في أوروبا وآسيا ونيوزيلندا15. تتم معالجة معظم الإنتاج للمنتجات الغذائية والمشروبات ، والتي تحظى بشعبية كبيرة في بلدان الشمال الأوروبي ، ويرجع ذلك أساسا إلى الخصائص الحسية للتوت. اللون والنكهة المكثفة للفاكهة هي نتيجة لمزيج من الأنثوسيانين والسكريات والأحماض والمركبات العضوية المتطايرة الموجودة في الثمار الناضجة16،17،18. يعود تحليل المواد المتطايرة من الكشمش الأسود إلى 1960s19,20,21. في الآونة الأخيرة ، ركزت العديد من الدراسات على المركبات العضوية المتطايرة الكشمش الأسود ، وتحديد المركبات المهمة لإدراك رائحة الفاكهة وتقييم تأثير النمط الوراثي أو البيئة أو ظروف التخزين والمعالجة على محتوى المركبات العضوية المتطايرة 5،17،18،22،23.

نظرا لمزاياها العديدة ، فإن التقنية المفضلة للتنميط المتطاير عالي الإنتاجية هي HS-SPME / GC-MS24,25. يتم تركيب ألياف السيليكا ، المغلفة بمرحلة بوليمرية ، على جهاز حقنة ، مما يسمح بامتصاص المواد المتطايرة في الألياف حتى يتم الوصول إلى مرحلة التوازن. يحمي استخراج مساحة الرأس الألياف من المركبات غير المتطايرة الموجودة في المصفوفة24. ويمكن ل SPME أن تعزل بنجاح عددا كبيرا من المركبات العضوية المتطايرة الموجودة بتركيزات شديدة التباين (أجزاء في المليار إلى أجزاء في المليون)25. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تقنية خالية من المذيبات تتطلب معالجة عينات محدودة. المزايا الأخرى ل HS-SPME هي سهولة التشغيل الآلي وتكلفته المنخفضة نسبيا.

ومع ذلك ، يمكن أن يكون نجاحها محدودا ، اعتمادا على الطبيعة الكيميائية للمركبات العضوية المتطايرة ، وبروتوكول الاستخراج (بما في ذلك الوقت ودرجة الحرارة وتركيز الملح) ، واستقرار العينة ، وتوافر أنسجة الفاكهة الكافية26,27. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للمركبات العضوية المتطايرة ذات الكشمش الأسود المعزولة بواسطة HS-SPME وتحليلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب مطياف كتلة مصيدة الأيونات. تم تحقيق توازن بين كمية المواد النباتية وثبات العينة ومدة الاستخراج والكروماتوغرافيا لتكون قادرة على معالجة أعداد كبيرة من عينات الكشمش الأسود ، بعضها عرض في هذه الدراسة. وعلى وجه الخصوص، سيتم عرض ومناقشة ملامح المركبات العضوية المتطايرة و/أو كروماتوغرامات خمسة أصناف ("أنديغا" و"بن ترون" و"بن غيرن" و"بن تيران" و"تيهوب") كمثال على البيانات. علاوة على ذلك ، تم تطبيق نفس البروتوكول بنجاح لقياس المركبات العضوية المتطايرة في أنواع أخرى من توت الفاكهة مثل الفراولة (Fragaria x ananassa) ، والتوت (Rubusidaeus) ، والتوت الأزرق (Vaccinium spp).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. حصاد الفاكهة

  1. تنمو ما بين 4 إلى 6 نباتات لكل نمط وراثي و / أو علاج لضمان ما يكفي من مواد الفاكهة والتباين.
  2. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بحصاد العينات في نفس التاريخ ؛ إذا لم يكن هناك ما يكفي من مواد الفاكهة ، فقم بتجميع العينات التي تم حصادها في تواريخ مختلفة.
    ملاحظة: يوصى بأن يظل وقت الحصاد (الصباح والظهيرة وبعد الظهر) متطابقا تقريبا حيث تتأثر ملفات تعريف المركبات العضوية المتطايرة بإيقاع النهار / الساعة البيولوجية 28,29,30,31.
  3. تقييم مرحلة نضج الثمار عن طريق الملاحظة البصرية32. تجمع الثمار من نفس مرحلة النضج ، حيث تؤثر حالة النضج بقوة على انبعاثات المركبات العضوية المتطايرة. تخلص من أي ثمار تالفة أو مصابة بمسببات الأمراض.
    ملاحظة: لتقييم نضج الفاكهة بشكل أفضل، يمكن إجراء تحليل الملمس33. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام العد بعد أيام من الإزهار لضمان أن الثمار المجمعة تنتمي إلى مرحلة نضج مماثلة.
  4. قم بتضمين ما لا يقل عن 10-15 فاكهة لكل نسخة بيولوجية (3 إلى 5) لتحليل المركبات العضوية المتطايرة.
    ملاحظة: هنا ، تم حصاد ثلاث برك منفصلة من 13-20 فاكهة (نسخ بيولوجية) من أصناف "Andega" و "Ben Tron" و "Ben Gairn" و "Ben Tirran" و "Tihope" في موقعين (بولندا واسكتلندا) في صيف عام 2018 وتجميدها مباشرة في النيتروجين السائل. ثم أرسلت العينات إلى المختبر وجرى تجهيزها على النحو المبين أدناه.
  5. بمجرد حصادها ، قم بتجميد جميع الثمار على الفور في النيتروجين السائل ، ثم قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا ، يمكن معالجة الثمار مباشرة بعد الحصاد. في هذه الحالة ، يمكن تجانس الفواكه الطازجة في الخلاط ووزنها وتحليلها مباشرة (الخطوة 3.1 فصاعدا). ومع ذلك ، لمنع الثمار من المزيد من عمليات التحلل بعد الحصاد ، يجب تخزين المواد الطازجة في مبرد (4 درجات مئوية) ومعالجتها في أسرع وقت ممكن. إذا لم يتم التعامل معها بشكل صحيح ، يمكن أن ينتج عن النيتروجين السائل حروق باردة ويمكن أن يسبب الاختناق في الأماكن سيئة التهوية.

2. عينة الفاكهة وإعداد كاشف

  1. طحن الثمار إلى مسحوق ناعم ، مع الحرص على إبقائها مجمدة دائما بمساعدة النيتروجين السائل. استخدم مطحنة مبردة أو مطحنة خرز أو هاون ومدقة للتجانس. Precool الجرار طحن الفولاذ المقاوم للصدأ أو الملاط والمدقة مع النيتروجين السائل لتجنب ذوبان العينة.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تجانس العينات إلى مسحوق ناعم لضمان استخراج المركبات العضوية المتطايرة بشكل صحيح.
  2. وزن 1 غرام من المواد المجمدة (من الخطوة 2.1)) في أنبوب سعة 5 مل تم تبريده مسبقا في النيتروجين السائل، ولاحظ الوزن الدقيق. احتفظ بالمادة عند -80 درجة مئوية حتى خطوة المعالجة 3.1.
  3. قم بتضمين عينات "مرجعية" أو "تحكم" في التحليل للتحقق من التباين الفني ، بما في ذلك استخراج المركبات العضوية المتطايرة وأداء HS-SPME / GC-MS. لهذا الغرض ، قم بتجميع مزيج من عينات الفاكهة المختارة عشوائيا ، وقم بتضمين عينة تحكم واحدة على الأقل يوميا لتحليل المركبات العضوية المتطايرة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم معيارا داخليا ، كما هو موضح في الخطوة 2.5. ، لتقليل تأثير انحراف الكثافة.
  4. قم بإعداد محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 20٪ (ث / v) في ماء كروماتوغرافيا سائل عالي الأداء (HPLC) (يشار إليه فيما يلي باسم محلول كلوريد الصوديوم). تذوب كلوريد الصوديوم بمساعدة التقليب المغناطيسي. ضمان توافر 1 مل من المحلول لكل عينة.
  5. قم بإعداد محلول 1 جزء في المليون في الميثانول من درجة HPLC من N-pentadecane (D32 ، 98٪) من المعيار التجاري الخالص (المشار إليه فيما يلي باسم المعيار الداخلي).
    ملاحظة: سيتم استخدام N-pentadecane-d32 كمعيار داخلي ، وستكون هناك حاجة إلى 5 ميكرولتر لكل عينة. يجب التلاعب بالميثانول تحت غطاء الدخان.
  6. قم بإعداد حلول 1 جزء في المليون في الميثانول من درجة HPLC للمعايير التجارية النقية لتحديد المركبات العضوية المتطايرة (انظر الجدول 1 للحصول على قائمة المعايير التجارية المستخدمة في هذه الدراسة).
  7. قم بإعداد قوارير مساحة رأس ذات غطاء لولبي سعة 10 مل عن طريق إضافة 0.5 جم من كلوريد الصوديوم في كل قارورة مطلوبة. تأكد من أن الأغطية اللولبية تتضمن حاجزا يتكون من مادة ناعمة ، أي السيليكون ، مع فيلم رقيق من البولي تترافلورو إيثيلين على الجانب الداخلي ، لتجنب التلوث.

3. إعداد عينة

  1. أضف 1 مل من محلول كلوريد الصوديوم إلى أنبوب 5 مل الذي يحتوي على العينة المجمدة الموزونة. هز الأنبوب حتى تذوب العينة تماما وتتجانسها.
  2. جهاز طرد مركزي عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. انقل المادة الفائقة بطرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر إلى قارورة مساحة الرأس المحتوية على كلوريد الصوديوم. قطع نهاية الطرف لتسهيل هذه العملية.
  4. أضف 5 ميكرولتر من المعيار الداخلي إلى كل قارورة مساحة رأس تحتوي على عينة.

4. الحصول على بيانات HS-SPME/GC-MS

  1. ضع قارورة مساحة الرأس المغلقة في جهاز أخذ العينات التلقائي GC-MS في درجة حرارة الغرفة، لتشغيل HS-SPME/GC-MS التلقائي، الموضح في القسم 4. لا تضع النسخ المتماثلة البيولوجية في مواضع متتالية في جهاز أخذ العينات التلقائي ؛ بدلا من ذلك ، قم بتوزيعها عشوائيا لتقليل تأثير انجراف الكثافة.
    ملاحظة: يمكن وضع ما يقرب من 10-12 قارورة في وقت واحد في جهاز أخذ العينات التلقائي، دون التأثير على استقرار العينة.
  2. قم بتكبيب قوارير مساحة الرأس مسبقا لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية مع الإثارة عند 17 × جم.
  3. أدخل جهاز SPME في القارورة لتعريض الألياف إلى مساحة الرأس لاستخراج المركبات العضوية المتطايرة لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية مع الإثارة عند 17 × جم.
  4. أدخل الألياف في منفذ الحقن لمدة 1 دقيقة عند 250 درجة مئوية في وضع عدم الانقسام للامتزاز المتطاير.
  5. نظف الألياف في محطة تنظيف SPME بالنيتروجين (1 بار N2 ، ≥ نقي 99.8٪) لمدة 5 دقائق عند 250 درجة مئوية. أعد استخدام الألياف حوالي 100 مرة.
  6. تحليل المركبات العضوية المتطايرة باستخدام كروماتوغراف الغاز المقترن بمطياف كتلة مصيدة الأيونات (انظر جدول المواد) ، وإجراء الكروماتوغرافيا تحت تدفق مستمر من الهيليوم (≥ نقاء 99.9999٪) من 1 مل / دقيقة ، مع عمود له أبعاد 60 م × 0.25 مم × 1 ميكرومتر. استخدم برنامج درجة حرارة الفرن متساوي الحرارة عند 40 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، يليه منحدر 8 درجات مئوية / دقيقة إلى 250 درجة مئوية والاحتفاظ به عند 250 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بالنسبة لقياس الطيف الكتلي، اضبط درجة حرارة خط النقل ومصدر الأيونات على 260 درجة مئوية و230 درجة مئوية على التوالي. اضبط طاقة التأين على 70 eV ونطاق الكتلة المسجل على m/z 35-220 بمعدل 6 عمليات مسح لكل ثانية.
  7. استخراج وتحليل حلول 1 جزء في المليون من المعايير التجارية كما هو موضح أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتشغيل خليط يحتوي على جميع المعايير التجارية المخففة الممزوجة بمحلول كلوريد الصوديوم 300 ميكرولتر وماء HPLC من الدرجة 900 ميكرولتر قبل الحصول على بيانات العينة للتحقق من المعايرة الصحيحة للمعدات. علاوة على ذلك ، قم بتضمين عينة فارغة تحتوي على محلول كلوريد الصوديوم وحده في كل دفعة.

5. تحليل كروماتوجرامات ملف تعريف GC-MS: تحديد المركبات العضوية المتطايرة وشبه الكمية

  1. افتح ملفات ملف GC-MS الخام باستخدام البرنامج الذي توفره الشركة المصنعة. لتحديد المركبات، قارن أوقات استبقائها وأطياف الكتلة ومؤشرات الاحتفاظ الخطية Kovats المحددة من كروماتوجرامات العينات مع مؤشرات الاستبقاء التي تم الحصول عليها من المعايير الأصيلة. لكل معيار تجاري، ضع تعليقا توضيحيا على وقت الاحتفاظ وأيونات m/z الأكثر وفرة. ثم حدد أيون m/z محدد لكل مركبات عضوية متطايرة (الجدول 1).
  2. يمكنك دمج قمم المركبات العضوية المتطايرة تلقائيا استنادا إلى أوقات الاحتفاظ القياسية وأيونات m/z المختارة لملفات GC-MS الخام المحددة. لهذا ، قم بتوفير قائمة لكل VOC مع وقت الاحتفاظ وأيون m / z المحدد. على الرغم من أن البرنامج يدمج تلقائيا منطقة الذروة المقابلة لنفس وقت الاحتفاظ وأيون m/z كما هو موضح في إعداد التسلسل، تحقق من التكامل الصحيح لكل قمة وقم بتصحيحه يدويا إذا لزم الأمر.
  3. احسب مساحة الذروة لكل مركبات عضوية متطايرة بالنسبة إلى مساحة المعيار الداخلي لتقليل التباين الفعال وانجراف الكثافة.
    ملاحظة: عند تحليل الفاكهة من أنماط وراثية مختلفة أو ظروف النمو والتخزين ، يوصى بشدة بتحديد محتوى المركبات العضوية المتطايرة بالنسبة لمحتوى الوزن الجاف للفاكهة لاستبعاد تأثيرات التخفيف بسبب الاختلافات في محتوى الماء.
  4. لتصحيح تأثير الدفعة، قم بتطبيع منطقة ذروة المركبات العضوية المتطايرة لكل عينة إلى منطقة الذروة المقابلة في عينة التحكم التي تم تحليلها في نفس التشغيل.
    ملاحظة: يتم الحصول على تقدير كمي نسبي للمركبات العضوية المتطايرة؛ ومع ذلك ، لغرض التجربة ، يمكن بعد ذلك تحديد محتوى المركبات العضوية المتطايرة بالنسبة لأي عينة (على سبيل المثال ، الفواكه غير المعالجة لمقارنة تأثير التخزين على مستويات المركبات العضوية المتطايرة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يعد التنميط عالي الإنتاجية للمركبات العضوية المتطايرة في مجموعة كبيرة من محاصيل الفاكهة المزروعة في ظل ظروف أو مواقع مختلفة أو تنتمي إلى أنماط وراثية متميزة أمرا ضروريا للتنميط الظاهري العطري الدقيق. هنا ، يتم تقديم منصة HS-SPME / GC-MS سريعة وشبه آلية للقياس الكمي النسبي للمركبات العضوية المتطايرة في أصناف الكشمش الأسود. واستند الكشف عن المركبات العضوية المتطايرة وتحديد هويتها إلى مكتبة وضعت لتحديد ملامح أنواع ثمار التوت (الجدول 1). ويبين الشكل 1 ألف صورة نموذجية متطايرة لفاكهة الكشمش الأسود الناضجة (كروماتوغرام أيون كلي) تم الحصول عليها بواسطة HS-SPME/GC-MS في الظروف المذكورة أعلاه. وفي المجموع، تم تحديد 63 مركبة عضوية متطايرة تنتمي إلى عدة فئات كيميائية، معظمها من الإسترات (27)، والألدهيدات (12)، والكحوليات (8)، والكيتونات (7)، والتربينات (5)، والفيورانات (3) (الجدول 1).

تم وصف مركبات التربينويد والإسترات ومركبات C6 بأنها تهيمن على فولاتيلوم الكشمش الأسود وأنها مهمة لرائحة الفاكهة الطازجة5,17. وبالاتفاق مع هذه الدراسات السابقة، فإن بعض القمم الأكثر وفرة التي لوحظت في الشكل 1 ألف تتوافق مع اثنين من أحاديات التربين (لينالول وتيربينيول) ومركبين من C6 ((E)-2-سداسي و (Z)-3-سداسي). وتبين أمثلة على أطياف الكتلة التي تم الحصول عليها من ملامح الكشمش الأسود ومقارنتها بأطياف المعايير التجارية البحتة بالنسبة للمعيارين (E)-2-hexenal و terpineol في الشكل 1B والشكل 1C، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1: كروماتوغرام تمثيلي من فاكهة الكشمش الأسود الناضجة التي تم الحصول عليها بواسطة HS-SPME/GC-MS (من صنف "أنديغا"). (Z)-3-hexenal (وقت الاحتفاظ 14.33 دقيقة) ، (E) -2-سداسي (15.86 دقيقة) ، لينالول (21.65 دقيقة) ، وتيربينيول (24.01 دقيقة) يشار إلى القمم بالأرقام 1 و 2 و 3 و 4 ، على التوالي. (ب) الطيف الكتلي المقابل للذروة السداسية (E)-2 من شكل الكشمش الأسود ومقارنته بمعيار تجاري خالص. (ج) الطيف الكتلي المقابل لذروة التيربينول من شكل الكشمش الأسود ومقارنته بمعيار تجاري خالص. اختصار: HS-SPME/GC-MS = الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في حين تم تصوير التربينات على أنها مؤشرات على نضارة فاكهة الكشمش الأسود، تعرف مركبات C6 باسم "المواد المتطايرة للأوراق الخضراء"، مما يضفي ملاحظات "خضراء" على رائحة الفاكهة والخضروات34. وبالتالي ، فإن القياس شبه الكمي لهذه المركبات العضوية المتطايرة المنبعثة من الثمار الناضجة من أنواع مختلفة من الكشمش الأسود يمكن أن يكون الخطوة الأولى في تحسين السمات المرتبطة بالنكهة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن ظروف البيئة ونمو النبات تؤثر بشدة على محتوى المركبات العضوية المتطايرة للفاكهة ، وهو أحد العيوب الرئيسية لتربية الروائح ، كان أحد أهداف هذه الدراسة هو التحقق من صحة الفرضية القائلة بأن القياس شبه الكمي للمركبات العضوية المتطايرة المحددة في نفس الأصناف ("Ben Tron" و "Ben Gairn" و "Ben Tirran" و "Tihope") كان قابلا للتكرار في المواقع الأوروبية المتعارضة تماما مثل بولندا واسكتلندا. وكما هو متوقع، أظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لملامح المركبات العضوية المتطايرة لأربعة أصناف مختلفة من الكشمش الأسود أن البيئة تؤثر بقوة على المحتوى المتطاير، حيث يفصل المكون الرئيسي (PC) 1 العينات بناء على موقعها (الشكل 2). ومع ذلك ، يمكن ملاحظة تأثير النمط الوراثي مع PC2 ، حيث يتم فصل "Ben Tirran" بوضوح عن الأصناف المتبقية (الشكل 2).

يوضح الشكل 3 المحتوى النسبي للينالول و (E) -2-hexenal في أصناف الكشمش الأسود الأربعة التي تم تقييمها. وبالنسبة لكلا الموقعين، تم تطبيع محتوى المركبات العضوية المتطايرة إلى نفس عينة التحكم، التي أكد فيها شبه القياس الكمي أن محتوى لينالول كان أعلى عموما في بولندا منه في اسكتلندا، في حين أن (E)-2-hexenal يظهر الاتجاه المعاكس (الشكل 3). توضح هذه النتيجة التأثير البيئي على محتوى المركبات العضوية المتطايرة في ثمار الكشمش الأسود ، على الرغم من أن نسبة المتطايرين الموجودين في الأصناف الأربعة التي تم تقييمها كانت ثابتة ، حيث أظهرت أصناف "Ben Tirran" و "Ben Tron" أعلى كميات من linalool و (E) -2-hexenal ، على التوالي (الشكل 3). وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الطريقة المقترحة صالحة لمحتوى النمط الظاهري للمركبات العضوية المتطايرة، ويمكن استخدامها مع النهج الجينية لغرض تربية جودة الفاكهة.

Figure 2
الشكل 2: تقييم التباين بين ملامح المركبات العضوية المتطايرة في أصناف الكشمش الأسود الأربعة المزروعة في بولندا واسكتلندا. PC1 (البيئة) يفسر 46.2٪ من التباين ، في حين يساهم PC2 (النمط الوراثي) بنسبة 24.8٪ من التباين في مجموعة البيانات. الاختصارات: PCA = تحليل المكون الرئيسي; PC1 = المكون الرئيسي الأول؛ PC2 = المكون الرئيسي الثاني؛ المركبات العضوية المتطايرة = مركب عضوي متطاير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: المحتوى النسبي لاثنين من المركبات العضوية المتطايرة التمثيلية في ملامح رائحة الكشمش الأسود - لينالول و (E) -2-سداسي ، التي يتم حصادها في اسكتلندا وبولندا. تم تقييم أربعة أصناف مختلفة من الكشمش الأسود ("بن غيرن" و "بن تيران" و "بن ترون" و "تيهوب"). تمثل الأشرطة القيم المتوسطة لنسختين متماثلتين بيولوجيتين ، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم إجراء مقارنات إحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار توكي اللاحق لتحديد الاختلافات الكبيرة في محتوى المركبات العضوية المتطايرة بين الأصناف والبلدان. بالنسبة لمحتويات المركبات العضوية المتطايرة التي تحتوي على نفس الأحرف الصغيرة (a ، ab ، b) ، لم تلاحظ أي اختلافات كبيرة عند P < 0.05. الاختصارات: المركبات العضوية المتطايرة = المركبات العضوية المتطايرة. ANOVA = تحليل التباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: قائمة بالمركبات العضوية المتطايرة التي حددتها HS-SPME/GC-MS في ثمار الكشمش الأسود. يشار إلى وقت الاحتفاظ (دقيقة) ، أيون m / z المحدد لتحديد المركبات العضوية المتطايرة وشبه الكمية ، وصف الرائحة ، الفئة الكيميائية والصيغة ، ورقم CAS. الاختصارات: HS-SPME/GC-MS = الاستخراج المجهري للطور الصلب في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي؛ المركبات العضوية المتطايرة = المركبات العضوية المتطايرة; KRI = مؤشر الاحتفاظ ب Kovats ؛ رقم سجل المستخلصات الكيميائية = رقم سجل خدمة المستخلصات الكيميائية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لطالما أعيقت تربية رائحة الفاكهة بسبب الوراثة المعقدة والكيمياء الحيوية الكامنة وراء تخليق المركبات المتطايرة ونقص التقنيات اللازمة للتنميط الظاهري الصحيح. ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة في منصات الأيض، جنبا إلى جنب مع الأدوات الجينومية، تسمح أخيرا بتحديد المستقلبات المسؤولة عن تفضيلات المستهلك وتربية المحاصيل ذات النكهة المحسنة3. في حين تم إحراز معظم التقدم في الفاكهة النموذجية ، الطماطم 9،10 ، يمكن تحقيق نتائج مماثلة في أنواع المحاصيل الأخرى ذات الصلة اقتصاديا مثل الفراولة أو التفاح أو التوت الأزرق 2،12،35،36.

تقدم هذه الورقة منصة سريعة وقابلة للتكرار تستند إلى HS-SPME / GC-MS تم استخدامها بنجاح لقياس محتوى المركبات العضوية المتطايرة في أنواع التوت المختلفة ، بما في ذلك الكشمش الأسود ، وهي فاكهة تحظى بتقدير كبير لنكهتها الحساسة وقيمتها الغذائية الرائعة. بالمقارنة مع الطرق المنشورة سابقا ، تم تحقيق التحسن الرئيسي عن طريق تقليل إجمالي وقت التشغيل الكروماتوغرافي. في الواقع ، كان من الممكن زيادة منحدر درجة الحرارة من 5 درجات مئوية / دقيقة إلى 8 درجات مئوية / دقيقة بدقة كافية ، مما يقلل من الوقت الكروماتوغرافي من 50 دقيقة إلى 35 دقيقة (الشكل 1A)27. علاوة على ذلك، يبدو أن الكمية العالية من كلوريد الصوديوم المضافة إلى العينات (1 مل من محلول كلوريد الصوديوم 20٪ + 0.5 جم من كلوريد الصوديوم الصلب) تؤثر بشكل إيجابي على استقرار العينة بمرور الوقت. في الواقع ، كانت الملامح المتقلبة مستقرة بمرور الوقت ، وجنبا إلى جنب مع الكروماتوغرافيا الأسرع ، سمحت بقياس ما يصل إلى 20-22 عينة يوميا.

إن استخدام معيار داخلي ، مثل N-pentadecane-d32 ، إلى جانب التوزيع السليم للنسخ المتماثلة البيولوجية على طول الجري ، ضروري لمنع انجراف الكثافة37. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تشغيل عينات التحكم أو المرجع مرة واحدة على الأقل يوميا من التحليل لتصحيح الدفعات. تحدث الاختلافات بين الدفعات بشكل رئيسي بسبب التغيرات في حساسية الكاشف أو بسبب شيخوخة الألياف27. وفي حين مكن هذا البروتوكول من الكشف عن أكثر من 60 مركبة عضوية متطايرة موجودة في مساحة رأس ثمار الكشمش الأسود الناضجة، يجب على القراء أن يأخذوا في الاعتبار أنه يمكن زيادة هذا العدد بسهولة عن طريق إضافة معايير تجارية خالصة في المكتبة المقترحة (الجدول 1). على سبيل المثال ، كشفت الدراسات المنشورة عن عدد كبير من مركبات التربينويد التي لم يتم تضمينها في هذا التحليل5,17. وبهذا المعنى ، يمكن بسهولة تجميع مكتبة المركبات العضوية المتطايرة الخاصة برائحة الكشمش الأسود ، إذا لزم الأمر. ومع ذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو تكييف مكتبة تم إنشاؤها مسبقا27 لقياس المركبات العضوية المتطايرة في التوت المختلفة ، بما في ذلك التوت والفراولة وثمار الكشمش الأسود.

من الجدير بالذكر أن البروتوكول المقدم هنا له العديد من المزايا والعيوب ، مثل منصات HS-SPME / GC-MS الأخرى ، والتي تمت مناقشتها بالفعل في مكان آخر 25,26,38. في حين أنها توفر سهولة التشغيل الآلي ، مما يجعلها التقنية المفضلة عندما تكون هناك حاجة إلى تحليل عدد كبير من العينات ، فإن عيبها الرئيسي هو قابليتها لتأثيرات المصفوفة38. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء اختيار طلاء الألياف SPME ومع ظروف أخذ العينات اعتمادا على الطبيعة الكيميائية للمركبات العضوية المتطايرة المستهدفة25,27. في الختام ، يتم تقديم بروتوكول سريع وشبه آلي لتنميط المركبات العضوية المتطايرة في مساحة رأس فاكهة التوت هنا ويمكن تكييفه بسهولة للاستخدام مع زيادة حجم المكتبة ، إذا لزم الأمر. ومن المتوقع أن تتكيف هذه المنصة مع أنواع الفاكهة الأخرى، وعندما تقترن بالدراسات الجينومية و/أو لوحة التحليل الحسي ستساعد على تنميط رائحة المحاصيل وتحسينها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الخدمات المركزية في Apoyo a la Investigación من جامعة ملقة على قياسات HS-SPME/GC-MS. ونعرب عن تقديرنا للمساعدة التي قدمتها سارة فرنانديز - بالاسيوس كامبوس في القياس الكمي المتقلب. كما نشكر أعضاء كونسورتيوم GoodBerry على توفير مواد الفاكهة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL screw top headspace vials Thermo Scientific 10-HSV
18 mm screw cap Silicone/PTFE Thermo Scientific 18-MSC
5 mL Tube with HDPE screw cap VWR 216-0153
Centrifuge Thermo Scientific 75002415
Methanol for HPLC Merck 34860-1L-R
N-pentadecane (D32, 98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-1283-1
Sodium chloride Merck S9888
SPME fiber PDMS/DVB Merck 57345-U
Stainless grinding jars for TissueLyser Qiagen 69985
TissueLyser II Qiagen 85300 Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill
Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Triplus RSH autosampler with automated SPME device Thermo Scientific 1R77010-0450
Water for HPLC Merck 270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1 Thermo Scientific software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
  2. Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
  3. Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
  4. Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
  5. Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
  6. Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
  7. Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
  8. Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
  9. Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
  10. Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
  11. Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
  12. Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
  13. Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
  14. Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
  15. Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
  16. Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
  17. Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
  18. Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
  19. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
  20. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
  21. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
  22. Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
  23. Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
  24. Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
  25. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
  26. Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
  27. Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
  28. Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
  29. Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
  30. Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
  31. Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
  32. Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
  33. Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
  34. Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
  35. Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
  36. Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
  37. Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
  38. Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 172 ، Volatalomics ، المركبات العضوية المتطايرة ، الرائحة ، الفاكهة ، Ribes nigrum ، HS-SPME / GC-MS
تنميط المركبات المتطايرة في فاكهة الكشمش الأسود باستخدام الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pott, D. M., Vallarino, J. G.,… More

Pott, D. M., Vallarino, J. G., Osorio, S. Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62421, doi:10.3791/62421 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter