Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יצירת פרופילים של תרכובות נדיפות בפרי דומדמניות שחורות באמצעות מיקרו-קסטרה של שלב מוצק Headspace בשילוב ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62421
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Summary

פלטפורמת מיקרו-פרוצדורה-גז-כרומטוגרפיה של מרחב ראש-פאזה מוצקה מתוארת כאן לזיהוי וכימות מהירים, אמינים ואוטומטיים למחצה של נדיפים בפירות דומדמניות שחורות בשלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להגדיל את הידע על ארומה פירות ולבחור cultivars עם טעם משופר לצורך הרבייה.

Abstract

יש עניין גובר במדידת תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) הנפלטות מפירות בשלים לצורך גידול זנים או cultivars עם מאפיינים אורגנולפטיים משופרים ובכך, כדי להגביר את קבלת הצרכן. פלטפורמות מטבולומיות בעלות תפוקה גבוהה פותחו לאחרונה כדי לכמת מגוון רחב של מטבוליטים ברקמות צמחיות שונות, כולל תרכובות מפתח האחראיות על טעם הפירות ואיכות הארומה (volatilomics). שיטה המשתמשת במיקרו-קסטרה של שלב מוצק headspace (HS-SPME) יחד עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS) מתוארת כאן לזיהוי וכימות של VOCs הנפלטים מפירות דומדמניות שחורות בשלים, ברי מוערך מאוד על טעמו ועל היתרונות הבריאותיים שלו.

פירות בשלים של צמחי דומדמניות שחורות (ribes nigrum) נקצרו והוקפאו ישירות בחנקן נוזלי. לאחר הומוגניזציה רקמה כדי לייצר אבקה עדינה, דגימות הופשרו מיד מעורבב עם פתרון נתרן כלורי. לאחר צנטריפוגה, supernatant הועבר לתוך בקבוקון זכוכית headspace המכיל נתרן כלורי. VOCs חולצו לאחר מכן באמצעות סיבי מיקרו-מנטרלקציה (SPME) בשלב מוצק וכרוטוגרף גז בשילוב ספקטרומטר מסה מלכודת יונים. כימות נדיף בוצע על כרומטוגרמה היון המתקבלת על ידי שילוב אזור שיא, באמצעות יון m / z ספציפי עבור כל VOC. ביאור VOC נכון אושר על ידי השוואת זמני שמירה ספקטרום מסה של סטנדרטים מסחריים טהורים לרוץ באותם תנאים כמו הדגימות. יותר מ-60 VOCs זוהו בפירות דומדמניות שחורות בשלים הגדלים במקומות מנוגדים באירופה. בין VOCs המזוהים, תרכובות ארומה מפתח, כגון טרפנואידים ו נדיפים C6, יכול לשמש סמנים ביולוגיים לאיכות פירות דומדמניות שחורות. בנוסף, נדונים יתרונות וחסרונות של השיטה, כולל שיפורים פוטנציאליים. יתר על כן, הודגש השימוש בבקרות לתיקון אצווה ומזעור עוצמת הסחף.

Introduction

טעם הוא תכונה איכותית חיונית לכל פרי, המשפיעה על קבלת הצרכן ובכך משפיעה באופן משמעותי על סחירות. תפיסת הטעם כרוכה בשילוב של מערכות הטעם והריח ותלויה כימית בנוכחותם ובריכוזם של מגוון רחב של תרכובות המצטברות בחלקים צמחיים אכילים, או במקרה של VOCs, הנפלטים מהפרי הבשל 1,2. בעוד הרבייה המסורתית התמקדה בתכונות אגרונומיות כגון תשואה ועמידות למזיקים, שיפור איכות הפרי, כולל טעם, הוזנח זה מכבר בשל המורכבות הגנטית והקושי לפנוטיפ כראוי מאפיינים אלה, מה שמוביל לחוסר שביעות רצון הצרכן 3,4. ההתפתחויות האחרונות בפלטפורמות מטבולומיות הצליחו לזהות ולכמת תרכובות מפתח האחראיות על טעם פירות וארומה5,6,7,8. יתר על כן, השילוב של פרופיל מטבוליט עם כלים גנומיים או transcriptomic מאפשר את ההבהרה של הגנטיקה שבבסיס טעם פירות, אשר בתורו יסייע תוכניות הרבייה לפתח זנים חדשים עם מאפיינים organoleptic משופרים2,4,9,9,10,11,12,13,14.

פירות יער דומדמניות שחורות (Ribes nigrum) זוכים להערכה רבה בזכות טעמם ומאפייניהם התזונתיים, ומעובדים באופן נרחב באזורים הממוזגים של אירופה, אסיה וניו זילנד15. רוב הייצור מעובד עבור מוצרי מזון ומשקאות, אשר פופולריים מאוד במדינות הנורדיות, בעיקר בשל המאפיינים organoleptic של פירות יער. הצבע והטעם העזים של הפרי הם תוצאה של שילוב של אנתוציאנינים, סוכרים, חומצות ו- VOCs הנמצאים בפירות בשלים16,17,18. הניתוח של נדיפים דומדמניות שחורות חוזר לשנות ה-6019,20,21. לאחרונה, מספר מחקרים התמקדו VOCs דומדמניות שחורות, זיהוי תרכובות חשובות לתפיסת ארומה פירות והערכת ההשפעה של גנוטיפ, סביבה, או תנאי אחסון ועיבוד על תוכן VOC5,17,18,22,23.

בגלל היתרונות הרבים שלה, הטכניקה של בחירה עבור פרופיל נדיף תפוקה גבוהה היא HS-SPME / GC-MS24,25. סיבי סיליקה, מצופים בשלב פולימרי, מותקן על מכשיר מזרק, המאפשר את הספיחה של הנדיפים בסיבים עד שלב שיווי המשקל מגיע. מיצוי headspace מגן על הסיבים מפני תרכובות לא נדיפות הקיימות מטריצה24. SPME יכול לבודד בהצלחה מספר גבוה של VOCs הקיימים בריכוזים משתנים מאוד (חלקים למיליארד לחלקים למיליון)25. בנוסף, זוהי טכניקה ללא ממס הדורשת עיבוד מדגם מוגבל. יתרונות נוספים של HS-SPME הם קלות האוטומציה והעלות הנמוכה יחסית שלה.

עם זאת, ההצלחה שלה יכולה להיות מוגבלת, בהתאם לאופי הכימי של VOCs, פרוטוקול החילוץ (כולל זמן, טמפרטורה, וריכוז מלח), יציבות מדגם, ואת הזמינות של רקמת פירות מספיק26,27. מאמר זה מציג פרוטוקול עבור VOCs דומדמניות שחורות מבודד על ידי HS-SPME ונותח על ידי כרומטוגרפיה גז בשילוב עם ספקטרומטר מסה מלכודת יונים. איזון בין כמות החומר הצמחי, יציבות המדגם, ומשך החילוץ והכרומטוגרפיה הושג כדי להיות מסוגל לעבד מספרים גבוהים של דגימות דומדמניות שחורות, חלקן הוצגו במחקר זה. בפרט, פרופילי VOC ו/או כרומטוגרמה של חמישה cultivars ('אנדגה', 'בן טרון', 'בן גרון', 'בן טירן', ו'Tihope') יוצגו ויידונו כנתונים לדוגמה. יתר על כן, אותו פרוטוקול הוכנס בהצלחה ליישם למדידת VOC במינים אחרים של פירות יער כגון תות שדה (Fragaria x ananassa), פטל (Rubusidaeus) ואוכמניות (Vaccinium spp.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קצירת פירות

  1. לגדל בין 4 ל 6 צמחים לכל גנוטיפ ו /או טיפול כדי להבטיח מספיק חומר פירות ושונות.
  2. אם אפשר, לקצור את הדגימות באותו תאריך; אם אין מספיק חומר פירות, בריכה יחד דגימות שנקטפו בתאריכים שונים.
    הערה: מומלץ כי זמן הקציר (בוקר, צהריים, אחר הצהריים) נשאר זהה בערך כמו פרופילי VOC מושפעים על ידי שעון ביולוגי בשעות היום /היממה28,29,30,30,31.
  3. להעריך את שלב הבשלת פירות על ידי תצפית חזותית32. פירות בריכה מאותו שלב הבשלה, כמו מצב הבשלה משפיע מאוד על פליטת VOC. יש להשליך פירות פגומים או נגועים בפתוגן.
    הערה: כדי להעריך טוב יותר את בשלות הפרי, ניתן לבצע ניתוח מרקם33. בנוסף, ניתן להשתמש בספירת ימים לאחר הפריחה כדי להבטיח כי פירות מקובצים שייכים לשלב הבשלה דומה.
  4. כלול מינימום של 10-15 פירות לכל שכפול ביולוגי (3 עד 5) לניתוח VOC.
    הערה: כאן, שלוש בריכות נפרדות של 13-20 פירות (משכפלים ביולוגיים) של 'אנדגה', 'בן טרון', 'בן גרון', 'בן טירן', ו 'Tihope' cultivars נקצרים בשני מקומות (פולין וסקוטלנד) בקיץ 2018 והוקפאו ישירות בחנקן נוזלי. לאחר מכן נשלחו דגימות למעבדה ועובדו כמתואר להלן.
  5. לאחר שנקטפו, להקפיא את כל הפירות מיד חנקן נוזלי, ולאחר מכן לאחסן אותם ב -80 °C (80 °F) עד לעיבוד.
    הערה: במידת האפשר, ניתן לעבד פירות ישירות לאחר הקציר. במקרה זה, פירות טריים יכולים להיות הומוגניים במיקסר, נשקל, וניתוח ישירות (שלב 3.1 ואילך). עם זאת, כדי למנוע פירות מתהליכים משפילים נוספים לאחר ההשמדה, החומר הטרי צריך להיות מאוחסן בצידנית (4 מעלות צלזיוס) ומעובד במהירות האפשרית. אם לא מטופל כראוי, חנקן נוזלי יכול לייצר כוויות קרות והוא יכול לגרום לחנק בחללים מאווררים היטב.

2. דגימת פירות והכנת ריאגנט

  1. טוחנים את הפירות לאבקה עדינה, דואגים תמיד לשמור אותם קפואים בעזרת חנקן נוזלי. השתמש בטחנת קריוגנית, טחנת חרוזים, או מרגמה ועלי להומוגניזציה. צנצנות טחינת נירוסטה Precool או מרגמה ועלי עם חנקן נוזלי כדי למנוע הפשרת מדגם.
    הערה: זה קריטי הומוגניזציה דגימות לאבקה דקה כדי להבטיח מיצוי VOC תקין.
  2. שקול 1 גרם של חומר קפוא (משלב 2.1.) בצינור 5 מ"ל כי הוא מקורר בעבר חנקן נוזלי, ולשים לב למשקל המדויק. שמור את החומר על -80 °C (80 °F) עד עיבוד שלב 3.1.
  3. כלול דגימות 'הפניה' או 'בקרה' בניתוח כדי לבדוק וריאציה טכנית, כולל חילוץ VOC וביצועי HS-SPME/GC-MS. לשם כך, לאגד יחד תערובת של דגימות פירות שנבחרו באופן אקראי, ולכלול לפחות מדגם בקרה אחד ליום לניתוח VOC. בנוסף, השתמש בתקן פנימי, כמתואר בשלב 2.5., כדי למזער את ההשפעה של נדידת עוצמה.
  4. הכן פתרון נתרן כלורי בשיעור 20% (w/v) במים בדרגת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלי ביצועים גבוהים (להלן, המכונה פתרון NaCl). להמיס NaCl בעזרת מערבל מגנטי; להבטיח את הזמינות של 1 מ"ל של הפתרון לכל מדגם.
  5. הכן פתרון של 1 עמודים לדקה במתנול בדרגת HPLC של N-pentadecane (D32, 98%) מהתקן המסחרי הטהור (להלן, המכונה התקן הפנימי).
    הערה: N-pentadecane-d32 ישמש כסטנדרט פנימי, ויהיה צורך ב- 5 μL לכל דגימה. מתנול צריך להיות מניפולציה תחת ברדס אדים.
  6. הכן פתרונות של 1 עמודים לדקה במתנול באיכות HPLC של סטנדרטים מסחריים טהורים לזיהוי VOC (ראה טבלה 1 לרשימת הסטנדרטים המסחריים המשמשים במחקר זה).
  7. הכינו בקבוקוני ראש עם כובע בורג של 10 מ"ל על ידי הוספת 0.5 גרם NaCl בכל בקבוקון נחוץ. ודא כי כובעי בורג כוללים מחיצה המורכבת מחומר רך, כלומר, סיליקון, עם סרט פוליטרפלואורואתילן דק בצד הפנימי, כדי למנוע זיהום.

3. הכנה לדוגמה

  1. הוסף 1 מ"ל של פתרון NaCl לצינור 5 מ"ל המכיל את הדגימה הקפואה במשקל. לנער את הצינור עד המדגם מופשר לחלוטין הומוגני.
  2. צנטריפוגה ב 5000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מעבירים את הסופר-נרטיב עם קצה פיפטה 1000 μL לבקבוקון Headspace המכיל NaCl. לחתוך את סוף הקצה כדי להקל על תהליך זה.
  4. הוסף 5 μL של תקן פנימי לכל בקבוקון headspace המכיל מדגם.

4. רכישת נתונים HS-SPME/GC-MS

  1. מקם את בקבוקון מרחב הראש הסגור בדגימה אוטומטית של GC-MS בטמפרטורת החדר, לריצה אוטומטית של HS-SPME/GC-MS, המתוארת בסעיף 4. אין למקם שכפולים ביולוגיים בתנוחות עוקבות בדגימה האוטומטית; במקום זאת, להפיץ אותם באופן אקראי כדי למזער את ההשפעה של נדידת אינטנסיביות.
    הערה: כ 10-12 בקבוקונים ניתן להציב בבת אחת ב autosampler, מבלי להשפיע על יציבות המדגם.
  2. קדם-דגירה של בקבוקוני מרחב הראש 10 דקות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם תסיסה בטמפרטורה של 17 x גרם.
  3. הכנס התקן SPME לתוך הבקבוקון כדי לחשוף את הסיבים למרחב הראש עבור מיצוי VOC במשך 30 דקות ב 50 °C (50 °F) עם עצבנות ב 17 x g.
  4. הצג את הסיבים לתוך יציאת ההזרקה במשך 1 דקות ב 250 °C (50 °F) במצב ללא פיצול עבור desorption נדיף.
  5. נקו את הסיבים בתחנת ניקוי SPME עם חנקן (1 בר N2, ≥ 99.8% טהור) למשך 5 דקות ב-250 מעלות צלזיוס. השתמש שוב בסיבים כ 100x.
  6. לנתח VOCs עם כרומטוגרפיה גז בשילוב ספקטרומטר מסה מלכודת יון (ראה את טבלת החומרים), ולבצע כרומטוגרפיה תחת זרימה מתמדת של הליום (הוא ≥ 99.9999% טוהר) של 1 מ"ל / דקה, עם עמודה שיש לה מידות של 60 מ 'x 0.25 מ"מ x 1 עובי מיקרומטר. השתמש בתוכנית טמפרטורת תנור כי הוא איזותרמי ב 40 °C (40 °F) במשך 3 דקות, ואחריו 8 ° C / דקה רמפה ל 250 °C (60 °F) ומחזיק ב 250 °C (5 °F) במשך 5 דקות. עבור ספקטרומטריית מסה, הגדר את טמפרטורות קו ההעברה ומקור היונים ל-260 °C (60 °F) ו-230 °C (60 °F), בהתאמה. הגדר את אנרגיית היוניזציה ל- 70 eV ואת טווח המסה המתועדת ל - m/ z 35-220 ב- 6 סריקות לשנייה.
  7. חלץ וניתח פתרונות של 1 עמודים לדקה של סטנדרטים מסחריים כמתואר לעיל. בנוסף, הפעל תערובת המכילה את כל הסטנדרטים המסחריים המדוללים מעורבבים עם פתרון 300 μL NaCl ומים בדרגת HPLC של 900 μL לפני רכישת נתונים לדוגמה כדי לבדוק את הכיול הנכון של הציוד. יתר על כן, לכלול מדגם ריק המכיל פתרון NaCl לבד בכל אצווה.

5. ניתוח של כרומטוגרמה פרופיל GC-MS: זיהוי VOC וכימות למחצה

  1. פתח קבצי פרופיל GC-MS גולמיים עם התוכנה שסופקה על-ידי היצרן. כדי לזהות תרכובות, להשוות את זמני השמירה שלהם ספקטרום מסה ו Kovats מדדי שימור ליניארי שנקבעו מן הכרומטוגרמה של הדגימות עם מדדי שימור שהתקבלו מסטנדרטים אותנטיים. עבור כל תקן מסחרי, להוסיף ביאור זמן שימור ואת יוני m/z הנפוצים ביותר. לאחר מכן, בחר יון m/z ספציפי עבור כל VOC (טבלה 1).
  2. שלב באופן אוטומטי פסגות VOC בהתבסס על זמני שמירה סטנדרטיים ויוני m/z שנבחרו של הקבצים הגולמיים שנבחרו של GC-MS. לשם כך, ספק רשימה עבור כל VOC עם זמן שמירה ויון m/z שנבחר. למרות התוכנה משלבת באופן אוטומטי אזור שיא המתאים לאותו זמן שמירה ו m / z יון כפי שצוין בהגדרת הרצף, לבדוק את השילוב הנכון של כל שיא ולתקן אותו באופן ידני במידת הצורך.
  3. חשב את שטח השיא של כל VOC ביחס לזה של התקן הפנימי כדי למזער וריאציה אינסטרומנטלית וסחף בעוצמה.
    הערה: בעת ניתוח פירות מגנוטיפים שונים או תנאי צמיחה ואחסון שונים, מומלץ מאוד לקבוע את תוכן ה- VOC ביחס לתוכן המשקל היבש של הפירות כדי לשלול השפעות דילול עקב הבדלים בתכולת המים.
  4. עבור תיקון אפקט אצווה, נרמל את אזור השיא של VOC של כל דגימה לאזור השיא המתאים בדגימת הבקרה המנותחת באותה ריצה.
    הערה: מתקבל כימות VOC יחסי; עם זאת, לצורך הניסוי, תוכן VOC ניתן לקבוע לאחר מכן ביחס לכל מדגם (למשל, פירות לא מטופלים כדי להשוות את ההשפעה של אחסון על רמות VOC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרופיל VOC בעל תפוקה גבוהה בקבוצה גדולה של גידולי פירות הגדלים בתנאים או מיקומים שונים או שייכים לגנוטיפים שונים נחוצים עבור פנוטיפינג ארומה מדויק. כאן, מוצגת פלטפורמת HS-SPME/GC-MS מהירה ואוטומטית למחצה לכימות יחסי של VOC בכתות דומדמניות שחורות. איתור וזיהוי VOC התבססו על ספרייה שפותחה לפרופיל מיני פירות יער (טבלה 1). פרופיל נדיף אופייני של פירות דומדמניות שחורות בשלות (כרומטוגרמה כוללת של היונים) המתקבל על-ידי HS-SPME/GC-MS בתנאים הנ"ל מוצג באיור 1A. בסך הכל זוהו 63 VOCs, השייכים למספר מחלקות כימיות, רובם אסטרים (27), אלדהידים (12), אלכוהול (8), קטונים (7), טרפנים (5) ופראנים (3) (טבלה 1).

תרכובות טרפנואידיות, אסטרים ותרכובות C6 תוארו כדי לשלוט בתנודתיות הדומדמניות השחורות ולהיות חשובות לניחוח של הפרי הטרי5,17. בהסכמה עם מחקרים קודמים אלה, חלק מהפסגות הנפוצות ביותר שנצפו באיור 1A תואמות לשתי מונוטרפנים (לינאלול וטרפינול) ושתי תרכובות C6 ((E)-2-hexenal ו- (Z)-3-hexenal). ספקטרום מסה לדוגמה המתקבל מפרופילי דומדמניות שחורות והשוואתם לספקטרום של סטנדרטים מסחריים טהורים מוצגים עבור (E)-2-hexenal ו- terpineol באיור 1B ובאיור 1C, בהתאמה.

Figure 1
איור 1: כרומטוגרמה מייצגת מפירות דומדמניות שחורות בשלים המתקבלים על ידי HS-SPME/GC-MS (מתוך cultivar 'Andega'). (A) כרומטוגרמה יון כוללת. (Z)-3-hexenal (זמן שמירה 14.33 דקות), (E)-2-hexenal (15.86 דקות), linalool (21.65 דקות) ו terpineol (24.01 דקות) פסגות מסומנים עם המספרים 1, 2, 3, ו 4, בהתאמה. (B) ספקטרום מסה המתאים לשיא (E)-2-hexenal מפרופיל דומדמניות שחורות והשוואה לסטנדרט מסחרי טהור. (C) ספקטרום מסה המתאים לשיא טרפינול מפרופיל דומדמניות שחורות והשוואה לסטנדרט מסחרי טהור. קיצור: HS-SPME/GC-MS = מיקרו-מסטרקציה של שלב מוצק של מרחב הראש בשילוב עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעוד טרפנים תוארו כאינדיקטורים של טריות פירות דומדמניות שחורות, תרכובות C6 ידועות בשם 'נדיפים עלים ירוקים', המעניקים הערות 'ירוקות' לארומת פירות וירקות34. לכן, כימות למחצה של VOCs אלה הנפלטים מפירות בשלים של זנים שונים של דומדמניות שחורות יכול להיות הצעד הראשון בשיפור תכונות הקשורות לטעם. יתר על כן, כמו הסביבה ותנאי הצמיחה הצמחיים משפיעים מאוד על תוכן VOC פירות, שהוא אחד החסרונות העיקריים עבור גידול ארומה, אחד המטרות של מחקר זה היה לאמת את ההשערה כי כימות למחצה של VOCs מזוהים באותם cultivars ('בן טרון', 'בן גרון', 'בן גבירן', 'בן טירן' ו 'Tihope') היה לשחזור במקומות אירופיים מנוגדים לחלוטין כגון פולין וסקוטלנד. כצפוי, ניתוח רכיבים עיקרי (PCA) של פרופילי VOC של ארבעה פולחני דומדמניות שחורות שונות הראה כי הסביבה משפיעה מאוד על תוכן נדיף, שכן הרכיב העיקרי (PC) 1 מפריד דגימות בהתבסס על מיקומם (איור 2). עם זאת, ניתן לראות את ההשפעה של גנוטיפ עם PC2, שכן 'בן טיראן' מופרד בבירור מיתרי הכת (איור 2).

איור 3 מציג את התוכן היחסי של linalool ו-(E)-2-hexenal בארבעת הכתות הדומדמניות השחורות המוערכות. בשני המיקומים, תוכן VOC היה מנורמל לאותה דגימת בקרה, שעבורה המכשול למחצה אישר שתכולת linalool הייתה בדרך כלל גבוהה יותר בפולין מאשר בסקוטלנד, ואילו (E)-2-hexenal מראה את המגמה ההפוכה (איור 3). תוצאה זו ממחישה את ההשפעה הסביבתית על תוכן VOC בפירות דומדמניות שחורות, אם כי שיעורם של שני הנדיפים הקיימים בארבעת הכתות המוערכות היה קבוע, כאשר הכתות 'בן טיראן' ו'בן טרון' הראו את הכמויות הגבוהות ביותר של לינאלול ו- (E)-2-hexenal, בהתאמה (איור 3). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהשיטה המוצעת תקפה לתוכן פנוטיפ VOC, בשילוב עם גישות גנטיות, עשוי לשמש לצורך רבייה באיכות פירות.

Figure 2
איור 2: PCA כדי להעריך את השונות בין פרופילי VOC בארבעת הכתות של דומדמניות שחורות שגדלו בפולין ובסקוטלנד. PC1 (סביבה) מסביר 46.2% מהשונות, בעוד PC2 (גנוטיפ) תורם 24.8% מהשונות בערכת הנתונים. קיצורים: PCA = ניתוח רכיבים עיקרי; PC1 = הרכיב העיקרי הראשון; PC2 = רכיב עיקרי שני; VOC = תרכובת אורגנית נדיפה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוכן יחסי של שני VOCs מייצגים בפרופילי ארומה דומדמניות שחורות-לינאלול ו-(E)-2-hexenal, שנקטפו בסקוטלנד ובפולין. הוערכו ארבעה פולחני דומדמניות שחורות שונות ('בן גבירן', 'בן טיראן', 'בן טרון' ו'טיהופ'). מייצגי הפעילויות מייצגים את הערכים הממוצעים של שני שכפולים ביולוגיים, וקווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן. השוואות סטטיסטיות בוצעו על ידי ANOVA חד כיווני ואחריו הבדיקה שלאחר הוק של Tukey כדי לקבוע הבדלים משמעותיים בתוכן VOC בין cultivars ומדינות. עבור תוכן VOC עם אותן אותיות קטנות (a, ab, b), לא נצפו הבדלים משמעותיים ב- P < 0.05. קיצורים: VOCs = תרכובות אורגניות נדיפות; ANOVA = ניתוח של שונות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת VOCs שזוהו על-ידי HS-SPME/GC-MS בפירות דומדמניות שחורות. זמן שמירה (דקה), יון m/z שנבחר לזיהוי VOC וכימות למחצה, תיאור ארומה, מחלקה ונוסחה כימיות ומספר CAS מצוינים. קיצורים: HS-SPME/ GC-MS = מיקרו-מנטרלקציה של שלב מוצק של מרחב הראש בשילוב עם ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז; VOCs = תרכובות אורגניות נדיפות; KRI = מדד שימור קובאטס; מספר CAS = מספר רישום של שירות תקצירים כימיים. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הרבייה של ארומה פירות כבר זמן רב הפריע על ידי הגנטיקה המורכבת וביוכימיה שבבסיס הסינתזה של תרכובות נדיפות וחוסר טכנולוגיות עבור פנוטיפינג תקין. עם זאת, ההתקדמות האחרונה בפלטפורמות מטבולומיות, בשילוב עם כלים גנומיים, מאפשרים סוף סוף לזהות את המטבוליטים האחראים להעדפות הצרכנים ולהתרבות יבולים עם טעם משופר3. בעוד שרוב ההתקדמות הושגה במודל פירות, עגבניות 9,10, תוצאות דומות ניתן להשיג במינים אחרים רלוונטיים כלכלית יבול כגון תות, תפוח, או אוכמניות2,12,35,35,36.

מאמר זה מציג פלטפורמה מהירה הניתנת לשחזור המבוססת HS-SPME/GC-MS, אשר שימשה בהצלחה למדידת תוכן VOC במינים שונים של פירות יער, כולל דומדמניות שחורות, פרי המוערך מאוד בזכות טעמו העדין והערך התזונתי המדהים שלו. בהשוואה לשיטות שפורסמו בעבר, השיפור העיקרי הושג על ידי הפחתת זמן הריצה הכרומטוגרפי הכולל. ואכן, ניתן היה להגדיל את טמפרפת הטמפרטורה מ-5 °C /C/min ל-8 °C /C/min עם רזולוציה נאותה, ובכך להפחית את הזמן הכרומטוגרפי מ-50 דקות ל-35 דקות (איור 1A)27. יתר על כן, הכמות הגבוהה של NaCl הוסיף הדגימות (1 מ"ל של 20% פתרון NaCl + 0.5 גרם של NaCl מוצק) נראה להשפיע באופן חיובי על יציבות המדגם לאורך זמן. ואכן, פרופילים נדיפים היו יציבים לאורך זמן, בשילוב עם כרומטוגרפיה מהירה יותר, אפשרו מדידה של עד 20-22 דגימות ביום.

השימוש בתקן פנימי, כגון N-pentadecane-d32, יחד עם הפצה נכונה של המשכפלים הביולוגיים לאורך הריצה, נחוץ כדי למנוע עוצמה להיסחף37. בנוסף, יש להפעיל דוגמאות בקרה או הפניה לפחות פעם ביום של ניתוח עבור תיקון אצווה. וריאציות בין אצוות נגרמות בעיקר על ידי שינויים ברגישות לגלאי או על ידי הזדקנות סיבים27. בעוד פרוטוקול זה אפשר זיהוי של יותר מ 60 VOCs נוכח במרחב הראש של פירות דומדמניות שחורות בשלים, הקוראים חייבים לקחת בחשבון כי מספר זה ניתן להגדיל בקלות על ידי הוספת סטנדרטים מסחריים טהורים בספריה המוצעת (טבלה 1). לדוגמה, מחקרים שפורסמו זיהו מספר גבוה של תרכובות טרפנואידים שלא נכללו בניתוח זה5,17. במובן זה, ספריית VOC ספציפית יותר לדומדמניות שחורות-ארומה עשויה להיות מורכבת בקלות, במידת הצורך. עם זאת, מטרת המחקר הייתה להתאים ספרייה שהוקמה בעבר27 למדידת VOC בפירות יער שונים, כולל פטל, תות ופירות דומדמניות שחורות.

ראוי לציין כי הפרוטוקול המוצג כאן יש כמה יתרונות וחסרונות, כמו פלטפורמות HS-SPME / GC-MS אחרות, אשר כבר נדונו במקומות אחרים25,26,38. בעוד הוא מציע קלות של אוטומציה, מה שהופך אותו לטכניקה של בחירה כאשר מספר רב של דגימות נדרשים לניתוח, החיסרון העיקרי שלה הוא הרגישות שלה אפקטים מטריצה38. בנוסף, יש לנקוט זהירות מיוחדת במהלך בחירת ציפוי סיבים SPME ועם תנאי דגימה בהתאם לאופי הכימי של VOCs ממוקד25,27. לסיכום, פרוטוקול מהיר ואוטומטי למחצה ליצירת פרופיל VOC במרחב הראש של פירות יער מוצג כאן וניתן להתאים אותו בקלות לשימוש עם גודל ספריה מוגבר, במידת הצורך. צפוי כי פלטפורמה זו יכולה להיות מותאמת למינים אחרים של פירות וכאשר בשילוב עם מחקרים גנומיים ו / או פאנל ניתוח חושי יסייע פרופיל ארומה יבול ושיפור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים מודים לסרביציוס סנטרלס דה אפויו א-לה סיינטיגאסיון מאוניברסיטת מלאגה על מדידות HS-SPME/GC-MS. אנו מכירים בסיועה של שרה פרננדז-פלאסיוס קמפוס בכימות הפכפך. אנו מודים גם לחברי הקונסורציום של GoodBerry על אספקת חומר הפירות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL screw top headspace vials Thermo Scientific 10-HSV
18 mm screw cap Silicone/PTFE Thermo Scientific 18-MSC
5 mL Tube with HDPE screw cap VWR 216-0153
Centrifuge Thermo Scientific 75002415
Methanol for HPLC Merck 34860-1L-R
N-pentadecane (D32, 98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-1283-1
Sodium chloride Merck S9888
SPME fiber PDMS/DVB Merck 57345-U
Stainless grinding jars for TissueLyser Qiagen 69985
TissueLyser II Qiagen 85300 Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill
Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Triplus RSH autosampler with automated SPME device Thermo Scientific 1R77010-0450
Water for HPLC Merck 270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1 Thermo Scientific software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
  2. Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
  3. Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
  4. Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
  5. Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
  6. Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
  7. Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
  8. Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
  9. Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
  10. Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
  11. Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
  12. Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
  13. Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
  14. Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
  15. Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
  16. Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
  17. Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
  18. Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
  19. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
  20. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
  21. Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
  22. Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
  23. Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
  24. Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
  25. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
  26. Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
  27. Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
  28. Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
  29. Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
  30. Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
  31. Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
  32. Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
  33. Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
  34. Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
  35. Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
  36. Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
  37. Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
  38. Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 172 וולטלומיקה VOCs ארומה פירות נגרום ריב, HS-SPME/GC-MS
יצירת פרופילים של תרכובות נדיפות בפרי דומדמניות שחורות באמצעות מיקרו-קסטרה של שלב מוצק Headspace בשילוב ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pott, D. M., Vallarino, J. G.,… More

Pott, D. M., Vallarino, J. G., Osorio, S. Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62421, doi:10.3791/62421 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter