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Biochemistry

Headspace ठोस चरण Microextraction गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित का उपयोग कर Blackcurrant फल में प्रोफाइलिंग वाष्पशील यौगिकों

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62421
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Summary

एक हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन-गैस-क्रोमैटोग्राफी प्लेटफ़ॉर्म को यहां तेजी से, विश्वसनीय और अर्ध-स्वचालित वाष्पशील पहचान और पके हुए ब्लैककरेंट फलों में परिमाणीकरण के लिए वर्णित किया गया है। इस तकनीक का उपयोग फलों की सुगंध के बारे में ज्ञान बढ़ाने और प्रजनन के उद्देश्य से बढ़े हुए स्वाद के साथ cultivars का चयन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

वहाँ वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (VOCs) प्रजनन किस्मों या संवर्धित organoleptic विशेषताओं के साथ cultivars के उद्देश्य से पके फलों द्वारा उत्सर्जित को मापने में एक बढ़ती रुचि है और इस प्रकार, उपभोक्ता स्वीकृति बढ़ाने के लिए. उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलोमिक प्लेटफार्मों को हाल ही में विभिन्न पौधों के ऊतकों में चयापचयों की एक विस्तृत श्रृंखला को मापने के लिए विकसित किया गया है, जिसमें फलों के स्वाद और सुगंध की गुणवत्ता (वोलेटिलोमिक्स) के लिए जिम्मेदार प्रमुख यौगिक शामिल हैं। गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) के साथ मिलकर हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन (एचएस-एसपीएमई) का उपयोग करने वाली एक विधि को पके हुए ब्लैककरेंट फलों द्वारा उत्सर्जित वीओसी की पहचान और परिमाणीकरण के लिए यहां वर्णित किया गया है, एक बेरी को इसके स्वाद और स्वास्थ्य लाभों के लिए अत्यधिक सराहना की जाती है।

ब्लैककरेंट पौधों के पके फल (रिबेस निग्रम) को काटा गया था और सीधे तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे। एक ठीक पाउडर का उत्पादन करने के लिए ऊतक समरूपता के बाद, नमूनों को पिघलाया गया और तुरंत सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ मिलाया गया। centrifugation के बाद, supernatant एक headspace कांच की शीशी सोडियम क्लोराइड युक्त में स्थानांतरित किया गया था। VOCs को तब एक ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैक्शन (SPME) फाइबर और एक आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित एक गैस क्रोमैटोग्राफ का उपयोग करके निकाला गया था। प्रत्येक VOC के लिए एक विशिष्ट m/z आयन का उपयोग करके, शिखर क्षेत्र को एकीकृत करके परिणामी आयन क्रोमैटोग्राम पर वाष्पशील परिमाणीकरण किया गया था। सही VOC एनोटेशन की पुष्टि नमूनों के समान परिस्थितियों में चलने वाले शुद्ध वाणिज्यिक मानकों के प्रतिधारण समय और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की तुलना करके की गई थी। विपरीत यूरोपीय स्थानों में उगाए गए पके हुए ब्लैककरेंट फलों में 60 से अधिक वीओसी की पहचान की गई थी। पहचाने गए वीओसी में, प्रमुख सुगंध यौगिकों, जैसे कि टेरपेनोइड्स और सी 6 वाष्पशील, को ब्लैककरेंट फल की गुणवत्ता के लिए बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि के फायदे और नुकसान पर चर्चा की जाती है, जिसमें संभावित सुधार शामिल हैं। इसके अलावा, बैच सुधार और बहाव तीव्रता को कम करने के लिए नियंत्रण के उपयोग पर जोर दिया गया है।

Introduction

स्वाद किसी भी फल के लिए एक आवश्यक गुणवत्ता विशेषता है, जो उपभोक्ता स्वीकृति को प्रभावित करता है और इस प्रकार विपणन क्षमता को काफी प्रभावित करता है। स्वाद धारणा में स्वाद और घ्राण प्रणालियों का एक संयोजन शामिल है और रासायनिक रूप से यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला की उपस्थिति और एकाग्रता पर निर्भर करता है जो खाद्य पौधों के हिस्सों में जमा होते हैं, या वीओसी के मामले में, पके हुए फल 1,2 द्वारा उत्सर्जित होते हैं। जबकि पारंपरिक प्रजनन ने उपज और कीट प्रतिरोध जैसे कृषि लक्षणों पर ध्यान केंद्रित किया है, स्वाद सहित फलों की गुणवत्ता में सुधार, आनुवंशिक जटिलता और इन विशेषताओं को ठीक से फेनोटाइप करने में कठिनाई के कारण लंबे समय से उपेक्षित किया गया है, जिससे उपभोक्ता असंतोष 3,4 हो गया है। मेटाबोलोमिक प्लेटफार्मों में हाल की प्रगति फलों के स्वाद और सुगंध 5,6,7,8 के लिए जिम्मेदार प्रमुख यौगिकों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने में सफल रही है। इसके अलावा, जीनोमिक या ट्रांसक्रिप्टोमिक उपकरणों के साथ मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग का संयोजन फलों के स्वाद के अंतर्निहित आनुवांशिकी के स्पष्टीकरण की अनुमति देता है, जो बदले में प्रजनन कार्यक्रमों को बढ़ी हुई ऑर्गेनोलेप्टिक विशेषताओं के साथ नई किस्मों को विकसित करने में मदद करेगा2,4,9,10,11,12,13,14।

Blackcurrant (Ribes nigrum) जामुन उनके स्वाद और पोषण गुणों के लिए अत्यधिक सराहना की जाती है, जो यूरोप, एशिया और न्यूजीलैंड के समशीतोष्ण क्षेत्रों में व्यापक रूप से खेती की जाती है। अधिकांश उत्पादन खाद्य उत्पादों और पेय पदार्थों के लिए संसाधित किया जाता है, जो नॉर्डिक देशों में बहुत लोकप्रिय हैं, मुख्य रूप से जामुन के ऑर्गेनोलेप्टिक गुणों के कारण। फल का तीव्र रंग और स्वाद एंथोसायनिन, शर्करा, एसिड और पके हुए फलों में मौजूद वीओसी के संयोजन का परिणाम है16,17,18। Blackcurrant volatiles का विश्लेषण 1960 के दशक 19,20,21 पर वापस चला जाता है। हाल ही में, कई अध्ययनों ने ब्लैककरेंट वीओसी पर ध्यान केंद्रित किया है, फल सुगंध धारणा के लिए महत्वपूर्ण यौगिकों की पहचान की है और वीओसी सामग्री पर जीनोटाइप, पर्यावरण, या भंडारण और प्रसंस्करण स्थितियों के प्रभाव का आकलन किया है5,17,18,22,23।

इसके कई फायदों के कारण, उच्च-थ्रूपुट वाष्पशील प्रोफाइलिंग के लिए पसंद की तकनीक एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस 24,25 है। एक सिलिका फाइबर, एक बहुलक चरण के साथ लेपित, एक सिरिंज डिवाइस पर घुड़सवार है, एक संतुलन चरण तक पहुँचने तक फाइबर में volatiles के सोखना की अनुमति देता है। हेडस्पेस निष्कर्षण मैट्रिक्स 24 में मौजूद गैर-वाष्पशील यौगिकों से फाइबर की रक्षा करता है। एसपीएमई अत्यधिक परिवर्तनीय सांद्रता में मौजूद वीओसी की एक उच्च संख्या को सफलतापूर्वक अलग कर सकता है (भागों प्रति अरब भागों प्रति मिलियन) 25। इसके अलावा, यह एक विलायक-मुक्त तकनीक है जिसके लिए सीमित नमूना प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। एचएस-एसपीएमई के अन्य फायदे स्वचालन में आसानी और इसकी अपेक्षाकृत कम लागत हैं।

हालांकि, इसकी सफलता सीमित हो सकती है, वीओसी की रासायनिक प्रकृति, निष्कर्षण प्रोटोकॉल (समय, तापमान और नमक एकाग्रता सहित), नमूना स्थिरता, और पर्याप्त फल ऊतक 26,27 की उपलब्धता के आधार पर। यह पेपर एचएस-एसपीएमई द्वारा अलग किए गए ब्लैककरेंट वीओसी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और एक आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया जाता है। पौधे की सामग्री की मात्रा, नमूना स्थिरता, और निष्कर्षण और क्रोमैटोग्राफी की अवधि के बीच एक संतुलन को ब्लैककरेंट नमूनों की उच्च संख्या को संसाधित करने में सक्षम होने के लिए प्राप्त किया गया था, उनमें से कुछ इस अध्ययन में प्रस्तुत किए गए थे। विशेष रूप से, वीओसी प्रोफाइल और / या पांच किस्मों ('एंडेगा', 'बेन ट्रॉन', 'बेन गैरन', 'बेन गैर्न', 'बेन तिरन', और 'टिहोप') के क्रोमैटोग्राम को उदाहरण डेटा के रूप में प्रस्तुत और चर्चा की जाएगी। इसके अलावा, एक ही प्रोटोकॉल को अन्य फल बेरी प्रजातियों जैसे स्ट्रॉबेरी (Fragaria x ananassa), रास्पबेरी (Rubusidaeus), और ब्लूबेरी (Vaccinium spp.) में वीओसी माप के लिए सफलतापूर्वक अभ्यास में रखा गया है।

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Protocol

1. फलों की कटाई

  1. पर्याप्त फल सामग्री और परिवर्तनशीलता सुनिश्चित करने के लिए जीनोटाइप और / या उपचार प्रति 4 से 6 पौधों के बीच बढ़ें।
  2. यदि संभव हो, तो एक ही तारीख को नमूनों की कटाई करें; यदि पर्याप्त फल सामग्री नहीं है, तो विभिन्न तिथियों पर काटे गए नमूनों को एक साथ पूल करें।
    नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि फसल का समय (सुबह, दोपहर, दोपहर) लगभग समान रहता है क्योंकि वीओसी प्रोफाइल दिन / सर्कैडियन लय 28,29,30,31 से प्रभावित होते हैं।
  3. दृश्य अवलोकन 32 द्वारा फल पकने के चरण का आकलन करें। एक ही पकने के चरण से पूल फल, पकने की स्थिति के रूप में दृढ़ता से वीओसी उत्सर्जन को प्रभावित करता है। किसी भी क्षतिग्रस्त या रोगज़नक़-संक्रमित फलों को छोड़ दें।
    नोट: फल परिपक्वता का बेहतर आकलन करने के लिए, बनावट विश्लेषण किया जा सकता है33. इसके अलावा, फूलों के बाद के दिनों की गिनती का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि पूल किए गए फल एक समान पकने के चरण से संबंधित हैं।
  4. वीओसी विश्लेषण के लिए प्रति जैविक प्रतिकृति (3 से 5) कम से कम 10-15 फल शामिल करें।
    नोट: यहां, 'एंडेगा', 'बेन ट्रॉन', 'बेन गैरन', 'बेन तिरन', और 'टिहोप' किस्मों के 13-20 फलों (जैविक प्रतिकृति) के तीन अलग-अलग पूल 2018 की गर्मियों में दो स्थानों (पोलैंड और स्कॉटलैंड) में काटे गए थे और सीधे तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे। नमूनों को तब प्रयोगशाला में भेजा गया था और नीचे वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था।
  5. एक बार कटाई के बाद, सभी फलों को तरल नाइट्रोजन में तुरंत फ्रीज करें, और बाद में प्रसंस्करण तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि संभव हो, तो फसल के बाद फलों को सीधे संसाधित किया जा सकता है। इस मामले में, ताजे फलों को मिक्सर में homogenized किया जा सकता है, वजन किया जा सकता है, और सीधे विश्लेषण किया जा सकता है (चरण 3.1 आगे)। हालांकि, फलों को आगे पोस्टहार्वेस्ट डिग्रेडेटिव प्रक्रियाओं से रोकने के लिए, ताजा सामग्री को कूलर (4 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहीत किया जाना चाहिए और जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाना चाहिए। यदि ठीक से संभाला नहीं जाता है, तो तरल नाइट्रोजन ठंडे जलने का उत्पादन कर सकता है और खराब हवादार स्थानों में श्वासावरोध का कारण बन सकता है।

2. फलों का नमूना और अभिकर्मक तैयारी

  1. फलों को एक महीन पाउडर में पीसें, ध्यान रखें कि उन्हें हमेशा तरल नाइट्रोजन की मदद से जमे हुए रखें। एक क्रायोजेनिक मिल, मनका मिल, या एक मोर्टार और homogenization के लिए pestle का उपयोग करें। प्रीकूल स्टेनलेस पीस जार या मोर्टार और तरल नाइट्रोजन के साथ pestle नमूना thawing से बचने के लिए.
    नोट: उचित वीओसी निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए एक ठीक पाउडर के लिए नमूनों को homogenize करने के लिए यह महत्वपूर्ण है।
  2. एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में जमे हुए सामग्री के 1 ग्राम (चरण 2.1 से) का वजन करें जिसे पहले तरल नाइट्रोजन में ठंडा किया गया था, और सटीक वजन पर ध्यान दें। चरण 3.1 संसाधित करने तक सामग्री को -80 °C पर रखें।
  3. वीओसी निष्कर्षण और एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस प्रदर्शन सहित तकनीकी भिन्नता की जांच करने के लिए विश्लेषण में 'संदर्भ' या 'नियंत्रण' नमूने शामिल करें। इस उद्देश्य के लिए, बेतरतीब ढंग से चुने गए फलों के नमूनों के मिश्रण को एक साथ पूल करें, और वीओसी विश्लेषण के लिए प्रति दिन कम से कम एक नियंत्रण नमूना शामिल करें। इसके अलावा, तीव्रता बहाव के प्रभाव को कम करने के लिए चरण 2.5 में वर्णित एक आंतरिक मानक का उपयोग करें।
  4. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड पानी में 20% (w / v) सोडियम क्लोराइड समाधान तैयार करें (इसके बाद, NaCl समाधान के रूप में जाना जाता है)। एक चुंबकीय हलचल की मदद से NaCl भंग; प्रति नमूना समाधान के 1 मिलीलीटर की उपलब्धता सुनिश्चित करें।
  5. शुद्ध वाणिज्यिक मानक (इसके बाद, आंतरिक मानक के रूप में संदर्भित) से एन-पेंटाडेकेन (डी 32, 98%) के एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल में 1 पीपीएम समाधान तैयार करें।
    नोट: N-pentadecane-d32 का उपयोग आंतरिक मानक के रूप में किया जाएगा, और प्रति नमूना 5 μL की आवश्यकता होगी। मेथनॉल को एक धुएं के हुड के तहत हेरफेर किया जाना चाहिए।
  6. वीओसी पहचान के लिए शुद्ध वाणिज्यिक मानकों के एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल में 1 पीपीएम समाधान तैयार करें (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक मानकों की सूची के लिए तालिका 1 देखें)।
  7. प्रत्येक आवश्यक शीशी में 0.5 ग्राम NaCl जोड़कर 10 mL स्क्रू-कैप हेडस्पेस शीशियों को तैयार करें। सुनिश्चित करें कि स्क्रू कैप्स में संदूषण से बचने के लिए आंतरिक पक्ष पर एक पतली पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन फिल्म के साथ एक नरम सामग्री से बना एक सेप्टम शामिल है, यानी, सिलिकॉन।

3. नमूना तैयारी

  1. वजन जमे हुए नमूने युक्त 5 mL ट्यूब के लिए NaCl समाधान के 1 mL जोड़ें। ट्यूब को हिलाएं जब तक कि नमूना पूरी तरह से पिघला हुआ और homogenized न हो जाए।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 5000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. एक 1000 μL पिपेट टिप के साथ supernatant NaCl युक्त headspace शीशी के लिए स्थानांतरण. इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए टिप के अंत को काटें।
  4. प्रत्येक नमूना युक्त हेडस्पेस शीशी के लिए आंतरिक मानक के 5 μL जोड़ें।

4. HS-SPME/

  1. एक स्वचालित HS-SPME / GC-MS रन के लिए कमरे के तापमान पर एक GC-MS autosampler में बंद headspace शीशी रखें, जिसे अनुभाग 4 में वर्णित किया गया है। Autosampler में क्रमिक पदों में जैविक प्रतिकृति जगह नहीं है; इसके बजाय, तीव्रता बहाव के प्रभाव को कम करने के लिए बेतरतीब ढंग से उन्हें वितरित करें।
    नोट: लगभग 10-12 शीशियों को नमूना स्थिरता को प्रभावित किए बिना ऑटोसैम्पलर में एक बार में रखा जा सकता है।
  2. 17 x g पर आंदोलन के साथ 50 °C पर 10 मिनट हेडस्पेस शीशियों को प्रीइंक्यूबेट करें।
  3. 17 x g पर आंदोलन के साथ 50 °C पर 30 मिनट के लिए वीओसी निष्कर्षण के लिए हेडस्पेस के लिए फाइबर को उजागर करने के लिए शीशी में एक SPME डिवाइस डालें।
  4. वाष्पशील desorption के लिए splitless मोड में 250 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए इंजेक्शन बंदरगाह में फाइबर का परिचय.
  5. नाइट्रोजन के साथ एक SPME सफाई स्टेशन में फाइबर को साफ करें (1 बार N2, ≥ 99.8% शुद्ध) 250 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए। लगभग 100x फाइबर का पुन: उपयोग करें।
  6. एक आयन जाल द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए युग्मित एक गैस क्रोमैटोग्राफ के साथ VOCs का विश्लेषण करें, और 1 mL / मिनट के हीलियम (वह 99.9999% शुद्धता ≥) के निरंतर प्रवाह के तहत क्रोमैटोग्राफी का प्रदर्शन करें, एक कॉलम के साथ जिसमें 60 मीटर x 0.25 मिमी x 1 μm मोटाई के आयाम हैं। एक ओवन तापमान कार्यक्रम का उपयोग करें जो 3 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर समतापीय है, इसके बाद 250 डिग्री सेल्सियस के लिए 8 डिग्री सेल्सियस / मिनट रैंप और 5 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए, स्थानांतरण रेखा और आयन स्रोत तापमान को क्रमशः 260 डिग्री सेल्सियस और 230 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। आयनीकरण ऊर्जा को 70 ईवी पर सेट करें और दर्ज की गई द्रव्यमान सीमा को एम / जेड 35-220 पर 6 स्कैन प्रति सेकंड पर सेट करें।
  7. निकालें और ऊपर वर्णित के रूप में वाणिज्यिक मानकों के 1 पीपीएम समाधान का विश्लेषण करें। इसके अलावा, उपकरण के सही अंशांकन की जांच करने के लिए नमूना डेटा अधिग्रहण से पहले 300 μL NaCl समाधान और 900 μL HPLC ग्रेड पानी के साथ मिश्रित सभी पतले वाणिज्यिक मानकों वाले मिश्रण को चलाएं। इसके अलावा, प्रत्येक बैच में अकेले NaCl समाधान युक्त एक खाली नमूना शामिल करें।

5. जीसी-एमएस प्रोफ़ाइल क्रोमैटोग्राम का विश्लेषण: वीओसी पहचान और अर्ध-परिमाणीकरण

  1. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ कच्ची GC-MS प्रोफ़ाइल फ़ाइलें खोलें. यौगिकों की पहचान करने के लिए, प्रामाणिक मानकों से प्राप्त प्रतिधारण सूचकांकों के साथ नमूनों के क्रोमैटोग्राम से निर्धारित उनके प्रतिधारण समय और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा और कोवाट्स रैखिक प्रतिधारण सूचकांकों की तुलना करें। प्रत्येक वाणिज्यिक मानक के लिए, प्रतिधारण समय और सबसे प्रचुर मात्रा में एम / जेड आयनों को एनोटेट करें। फिर, प्रत्येक VOC (तालिका 1) के लिए एक विशिष्ट m/z आयन का चयन करें।
  2. मानक प्रतिधारण समय के आधार पर वीओसी चोटियों को स्वचालित रूप से एकीकृत करें और चयनित जीसी-एमएस कच्ची फ़ाइलों के चुने गए एम / जेड आयनों को चुना। इसके लिए, प्रतिधारण समय और चयनित m/z आयन के साथ प्रत्येक VOC के लिए एक सूची प्रदान करें। यद्यपि सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से अनुक्रम सेटअप में प्रदान किए गए समान प्रतिधारण समय और m / z आयन के अनुरूप शिखर क्षेत्र को एकीकृत करता है, प्रत्येक चोटी के सही एकीकरण की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो इसे मैन्युअल रूप से सही करें।
  3. वाद्य भिन्नता और तीव्रता बहाव को कम करने के लिए आंतरिक मानक के सापेक्ष प्रत्येक वीओसी के चरम क्षेत्र की गणना करें।
    नोट: विभिन्न जीनोटाइप या विकास और भंडारण स्थितियों से फलों का विश्लेषण करते समय, पानी की सामग्री में अंतर के कारण कमजोर पड़ने के प्रभावों को दूर करने के लिए फलों के सूखे वजन की सामग्री के सापेक्ष वीओसी सामग्री निर्धारित करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
  4. बैच प्रभाव सुधार के लिए, एक ही रन में विश्लेषण किए गए नियंत्रण नमूने में संबंधित शिखर क्षेत्र के लिए प्रत्येक नमूने के वीओसी पीक क्षेत्र को सामान्य करें।
    नोट: एक सापेक्ष वीओसी परिमाणीकरण प्राप्त किया जाता है; हालांकि, प्रयोग के उद्देश्य के लिए, वीओसी सामग्री को तब किसी भी नमूने के सापेक्ष निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वीओसी स्तरों पर भंडारण के प्रभाव की तुलना करने के लिए अनुपचारित फल)।

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Representative Results

विभिन्न परिस्थितियों या स्थानों के तहत उगाई जाने वाली फल फसलों के एक बड़े सेट में उच्च-थ्रूपुट वीओसी प्रोफाइलिंग या अलग-अलग जीनोटाइप से संबंधित सटीक सुगंध फेनोटाइपिंग के लिए आवश्यक है। यहां, ब्लैककरंट किस्मों में सापेक्ष वीओसी परिमाणीकरण के लिए एक तेज और अर्ध-स्वचालित एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस प्लेटफ़ॉर्म प्रस्तुत किया गया है। वीओसी का पता लगाना और पहचान एक पुस्तकालय पर आधारित थी जिसे बेरी फल प्रजातियों को प्रोफ़ाइल करने के लिए विकसित किया गया था (तालिका 1)। उपरोक्त स्थितियों में एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस द्वारा प्राप्त एक विशिष्ट पके हुए ब्लैककरेंट फल वाष्पशील प्रोफ़ाइल (कुल आयन क्रोमैटोग्राम) को चित्र 1 ए में दिखाया गया है। कुल मिलाकर, 63 वीओसी की पहचान की गई थी, जो कई रासायनिक वर्गों से संबंधित थे, जिनमें से अधिकांश एस्टर (27), एल्डिहाइड (12), अल्कोहल (8), कीटोन्स (7), टेरपेन्स (5), और फुरान (3) (तालिका 1) थे।

Terpenoid यौगिकों, एस्टर, और C6 यौगिकों को blackcurrant volatilome पर हावी होने और ताजा फल 5,17 की सुगंध के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए वर्णित किया गया है। इन पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में, चित्रा 1A में देखी गई सबसे प्रचुर मात्रा में चोटियों में से कुछ दो मोनोटेरपेन्स (लिनालूल और टेर्पिनोल) और दो सी 6 यौगिकों ((ई) -2-हेक्सेनल और (जेड) -3-हेक्सेनल) के अनुरूप हैं। उदाहरण ब्लैककरेंट प्रोफाइल से प्राप्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा और शुद्ध वाणिज्यिक मानकों के स्पेक्ट्रा के साथ उनकी तुलना क्रमशः (ई) -2-हेक्सेनल और टेर्पिनोल के लिए चित्रा 1 बी और चित्रा 1 सी में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: HS-SPME/ GC-MS ('Andega' cultivar से) द्वारा प्राप्त पके हुए ब्लैककरेंट फल से प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम। (A) कुल आयन क्रोमैटोग्राम। (Z)-3-hexenal (अवधारण समय 14.33 मिनट), (E)-2-hexenal (15.86 मिनट), लिनालूल (21.65 मिनट), और terpineol (24.01 मिनट) चोटियों को क्रमशः 1, 2, 3, और 4 की संख्याओं के साथ इंगित किया गया है। (बी) एक ब्लैककरेंट प्रोफाइल से (ई) -2-हेक्सेनल पीक के अनुरूप मास स्पेक्ट्रम और एक शुद्ध वाणिज्यिक मानक के साथ तुलना। (सी) एक ब्लैककरेंट प्रोफाइल से टेर्पिनोल पीक के अनुरूप मास स्पेक्ट्रम और एक शुद्ध वाणिज्यिक मानक के साथ तुलना। संक्षिप्त नाम: HS-SPME / GC-MS = गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जबकि टेरपेन्स को ब्लैककरेंट फल ताजगी के संकेतकों के रूप में दर्शाया गया है, सी 6 यौगिकों को 'हरी पत्ती वाष्पशील' के रूप में जाना जाता है, जो फल और सब्जी सुगंध 34 को 'हरे' नोट प्रदान करता है। इस प्रकार, विभिन्न ब्लैककरेंट किस्मों के पके फलों द्वारा उत्सर्जित इन वीओसी का अर्ध-परिमाणीकरण स्वाद से संबंधित लक्षणों में सुधार करने में पहला कदम हो सकता है। इसके अलावा, जैसा कि पर्यावरण और पौधों की वृद्धि की स्थिति फल वीओसी सामग्री को दृढ़ता से प्रभावित करती है, जो सुगंध प्रजनन के लिए मुख्य कमियों में से एक है, इस अध्ययन के उद्देश्यों में से एक इस परिकल्पना को मान्य करना था कि एक ही किस्म में पहचाने गए वीओसी का अर्ध-परिमाणीकरण ('बेन ट्रॉन', 'बेन गैरन', 'बेन तिरेन', और 'टिहोप') पोलैंड और स्कॉटलैंड जैसे यूरोपीय स्थानों में पुन: प्रस्तुत करने योग्य था। जैसा कि अपेक्षित था, चार अलग-अलग ब्लैककरेंट किस्मों के वीओसी प्रोफाइल के प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) से पता चला है कि पर्यावरण वाष्पशील सामग्री को दृढ़ता से प्रभावित करता है, क्योंकि प्रमुख घटक (पीसी) 1 उनके स्थान के आधार पर नमूनों को अलग करता है (चित्रा 2)। हालांकि, जीनोटाइप का प्रभाव पीसी 2 के साथ देखा जा सकता है, क्योंकि 'बेन तिरन' स्पष्ट रूप से शेष किस्मों (चित्रा 2) से अलग है।

चित्रा 3 लिनालूल और (ई) -2-हेक्सेनल की सापेक्ष सामग्री को चार मूल्यांकन किए गए ब्लैककरेंट किस्मों में दिखाता है। दोनों स्थानों के लिए, वीओसी सामग्री को एक ही नियंत्रण नमूने के लिए सामान्यीकृत किया गया था, जिसके लिए अर्ध-परिमाणीकरण ने पुष्टि की कि लिनालूल सामग्री आमतौर पर स्कॉटलैंड की तुलना में पोलैंड में अधिक थी, जबकि (ई) -2-हेक्सेनल विपरीत प्रवृत्ति दिखाता है (चित्रा 3)। यह परिणाम ब्लैककरेंट फलों में वीओसी सामग्री पर पर्यावरणीय प्रभाव को दर्शाता है, हालांकि चार मूल्यांकन किए गए किस्मों में मौजूद दो वाष्पशीलों का अनुपात स्थिर था, जिसमें 'बेन तिरन' और 'बेन ट्रॉन' किस्में क्रमशः लिनालूल और (ई) -2-हेक्सेनल की उच्चतम मात्रा में दिखाई देती हैं (चित्रा 3)। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रस्तावित विधि फेनोटाइप वीओसी सामग्री के लिए मान्य है, और आनुवंशिक दृष्टिकोण के साथ संयुक्त, फल गुणवत्ता प्रजनन के उद्देश्य के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीए पोलैंड और स्कॉटलैंड में उगाए गए चार ब्लैककरेंट किस्मों में वीओसी प्रोफाइल के बीच विचरण का आकलन करने के लिए। PC1 (पर्यावरण) परिवर्तनशीलता का 46.2% बताता है, जबकि PC2 (जीनोटाइप) डेटासेट में विचरण का 24.8% योगदान देता है। संक्षेप: पीसीए = प्रमुख घटक विश्लेषण; PC1 = पहला प्रमुख घटक; PC2 = दूसरा प्रमुख घटक; VOC = वाष्पशील कार्बनिक यौगिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ब्लैककरेंट सुगंध प्रोफाइल-लिनालूल और (ई) -2-हेक्सेनल में दो प्रतिनिधि वीओसी की सापेक्ष सामग्री, स्कॉटलैंड और पोलैंड में काटी गई। चार अलग-अलग ब्लैककरेंट किस्मों का मूल्यांकन किया गया था ('बेन गैरन', 'बेन तिरान', 'बेन ट्रॉन', और 'टिहोप')। सलाखों दो जैविक प्रतिकृतियों के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय तुलना एक तरफा एनोवा द्वारा की गई थी, जिसके बाद टकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद cultivars और देशों के बीच VOC सामग्री में महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए किया गया था। एक ही लोअरकेस अक्षरों (ए, एबी, बी) के साथ वीओसी सामग्री के लिए, पी < 0.05 पर कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। संक्षेप: VOCs = वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों; एनोवा = विचरण का विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: ब्लैककरेंट फलों में एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस द्वारा पहचाने गए वीओसी की सूची। प्रतिधारण समय (न्यूनतम), वीओसी पहचान और अर्ध-परिमाणीकरण, सुगंध विवरण, रासायनिक वर्ग और सूत्र, और कैस संख्या के लिए चयनित एम / जेड आयन इंगित किए जाते हैं। संक्षेप: HS-SPME / GC-MS = गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन; VOCs = वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों; KRI = Kovats प्रतिधारण सूचकांक; CAS संख्या = रासायनिक Abstracts सेवा रजिस्ट्री संख्या। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फलों की सुगंध के लिए प्रजनन लंबे समय से जटिल आनुवांशिकी और जैव रसायन द्वारा अस्थिर यौगिकों के संश्लेषण और उचित फेनोटाइपिंग के लिए प्रौद्योगिकियों की कमी के अंतर्निहित द्वारा बाधित किया गया है। हालांकि, मेटाबोलोमिक प्लेटफार्मों में हाल की प्रगति, जीनोमिक उपकरणों के साथ संयुक्त, अंततः उपभोक्ता प्राथमिकताओं के लिए जिम्मेदार चयापचयों की पहचान और बेहतर स्वाद के साथ फसलों को प्रजनन करने की अनुमति दे रही है3। जबकि अधिकांश प्रगति मॉडल फल, टमाटर 9,10 में हासिल की गई है, इसी तरह के परिणाम अन्य आर्थिक रूप से प्रासंगिक फसल प्रजातियों जैसे स्ट्रॉबेरी, सेब, या ब्लूबेरी 2,12,35,36 में प्राप्त किए जा सकते हैं।

यह पेपर एक तेज और पुन: प्रस्तुत करने योग्य एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस-आधारित मंच प्रस्तुत करता है जिसका उपयोग विभिन्न बेरी प्रजातियों में वीओसी सामग्री को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, जिसमें ब्लैककरेंट भी शामिल है, एक फल जो इसके नाजुक स्वाद और उल्लेखनीय पोषण मूल्य के लिए अत्यधिक सराहना की जाती है। पहले प्रकाशित विधियों की तुलना में, मुख्य सुधार कुल क्रोमैटोग्राफिक रन टाइम को कम करके हासिल किया गया था। दरअसल, पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन के साथ तापमान रैंप को 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट से 8 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक बढ़ाना संभव था, जिससे क्रोमैटोग्राफिक समय को 50 मिनट से 35 मिनट (चित्रा 1 ए) 27 तक कम किया जा सकता था। इसके अलावा, NaCl की उच्च मात्रा नमूनों में जोड़ा गया (20% NaCl समाधान के 1 mL + ठोस NaCl के 0.5 ग्राम) समय के साथ नमूना स्थिरता को सकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए लगता है। दरअसल, अस्थिर प्रोफाइल समय के साथ स्थिर थे, और तेजी से क्रोमैटोग्राफी के साथ संयुक्त, प्रति दिन 20-22 नमूनों तक के माप की अनुमति दी।

एक आंतरिक मानक का उपयोग, जैसे कि एन-पेंटाडेकेन-डी 32, रन के साथ जैविक प्रतिकृतियों के उचित वितरण के साथ, तीव्रता ड्रिफ्ट 37 को रोकने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, नियंत्रण या संदर्भ नमूनों को बैच सुधार के लिए विश्लेषण के प्रति दिन कम से कम एक बार चलाया जाना चाहिए। बैचों के बीच भिन्नताएं मुख्य रूप से डिटेक्टर संवेदनशीलता में परिवर्तन या फाइबर उम्र बढ़ने के कारण होती हैं27। जबकि इस प्रोटोकॉल ने पके हुए ब्लैककरेंट फलों के हेडस्पेस में मौजूद 60 से अधिक वीओसी का पता लगाने में सक्षम बनाया, पाठकों को यह ध्यान में रखना चाहिए कि प्रस्तावित पुस्तकालय (तालिका 1) में शुद्ध वाणिज्यिक मानकों को जोड़कर इस संख्या को आसानी से बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रकाशित अध्ययनों ने टेरपेनोइड यौगिकों की एक उच्च संख्या का पता लगाया जो इस विश्लेषण में शामिल नहीं थे5,17। इस अर्थ में, यदि आवश्यक हो, तो एक अधिक ब्लैककरंट-सुगंध-विशिष्ट वीओसी लाइब्रेरी को आसानी से एक साथ रखा जा सकता है। हालांकि, इस अध्ययन का लक्ष्य रास्पबेरी, स्ट्रॉबेरी और ब्लैककरेंट फलों सहित विभिन्न जामुनों में वीओसी माप के लिए पहले से स्थापित पुस्तकालय 27 को अनुकूलित करना था।

यह उल्लेखनीय है कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कई फायदे और नुकसान हैं, जैसे कि अन्य एचएस-एसपीएमई / जीसी-एमएस प्लेटफॉर्म, जिन पर पहले से ही कहीं और चर्चा की जा चुकी है25,26,38। हालांकि यह स्वचालन में आसानी प्रदान करता है, जिससे यह पसंद की तकनीक बन जाता है जब बड़ी संख्या में नमूनों का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है, तो इसका मुख्य दोष मैट्रिक्स प्रभाव 38 के लिए इसकी संवेदनशीलता है। इसके अलावा, एसपीएमई फाइबर-कोटिंग चयन के दौरान और लक्षित VOCs25,27 की रासायनिक प्रकृति के आधार पर नमूना स्थितियों के साथ विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। निष्कर्ष निकालने के लिए, बेरी फल हेडस्पेस में वीओसी प्रोफाइलिंग के लिए एक तेजी से और अर्ध-स्वचालित प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है और यदि आवश्यक हो तो बढ़े हुए पुस्तकालय के आकार के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। यह उम्मीद की जाती है कि इस मंच को अन्य फल प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और जब जीनोमिक अध्ययन और / या संवेदी विश्लेषण पैनल के साथ जोड़ा जाता है तो फसल सुगंध प्रोफाइलिंग और सुधार में मदद मिलेगी।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकों Servicios Centrales de Apoyo HS-SPME / GC-MS माप के लिए Malaga विश्वविद्यालय से एक ला Investigación धन्यवाद. हम वाष्पशील परिमाणीकरण में सारा फर्नांडेज़-पलासिओस कैम्पोस की सहायता को स्वीकार करते हैं। हम फल सामग्री प्रदान करने के लिए गुडबेरी के कंसोर्टियम के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL screw top headspace vials Thermo Scientific 10-HSV
18 mm screw cap Silicone/PTFE Thermo Scientific 18-MSC
5 mL Tube with HDPE screw cap VWR 216-0153
Centrifuge Thermo Scientific 75002415
Methanol for HPLC Merck 34860-1L-R
N-pentadecane (D32, 98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-1283-1
Sodium chloride Merck S9888
SPME fiber PDMS/DVB Merck 57345-U
Stainless grinding jars for TissueLyser Qiagen 69985
TissueLyser II Qiagen 85300 Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill
Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Triplus RSH autosampler with automated SPME device Thermo Scientific 1R77010-0450
Water for HPLC Merck 270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1 Thermo Scientific software

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References

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जैव रसायन अंक 172 Volatalomics VOCs सुगंध फल पसलियों nigrum HS-SPME /
Headspace ठोस चरण Microextraction गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित का उपयोग कर Blackcurrant फल में प्रोफाइलिंग वाष्पशील यौगिकों
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Pott, D. M., Vallarino, J. G.,… More

Pott, D. M., Vallarino, J. G., Osorio, S. Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62421, doi:10.3791/62421 (2021).

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