Summary
En headspace solid-fase mikroextraction-gas-kromatografi platform er beskrevet her for hurtig, pålidelig og semi-automatiseret flygtig identifikation og kvantificering i modne solbær frugter. Denne teknik kan bruges til at øge viden om frugt aroma og til at vælge sorter med forbedret smag med henblik på avl.
Abstract
Der er en stigende interesse for at måle flygtige organiske forbindelser (VOC), der udledes af modne frugter med henblik på avl af sorter eller sorter med forbedrede organoleptiske egenskaber og dermed for at øge forbrugernes accept. Metabolomiske platforme med høj gennemløb er for nylig blevet udviklet til at kvantificere en bred vifte af metabolitter i forskellige plantevæv, herunder nøgleforbindelser, der er ansvarlige for frugtsmag og aromakvalitet (volatilomics). En metode ved hjælp af headspace solid-fase mikroextraction (HS-SPME) kombineret med gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er beskrevet her til identifikation og kvantificering af VOC'er, der udsendes af modne solbærfrugter, et bær, der er meget værdsat for dets smags- og sundhedsmæssige fordele.
Modne frugter af solbærplanter (Ribes nigrum) blev høstet og direkte frosset i flydende nitrogen. Efter vævs homogenisering for at producere et fint pulver blev prøverne optøet og straks blandet med natriumchloridopløsning. Efter centrifugering blev supernatanten overført til et headspace glasglasglasglas, der indeholdt natriumchlorid. VOC'er blev derefter udvundet ved hjælp af en solid-fase mikroextraction (SPME) fiber og en gaskromatograf koblet til en ion fælde massespektrometer. Flygtig kvantificering blev udført på de resulterende ionkromatogrammer ved at integrere spidsbelastningsområde ved hjælp af en bestemt m/z ion for hver VOC. Korrekt VOC-anmærkning blev bekræftet ved at sammenligne retentionstider og massespektre af rene kommercielle standarder, der kører under de samme betingelser som prøverne. Mere end 60 VOC'er blev identificeret i modne solbærfrugter dyrket i kontrasterende europæiske steder. Blandt de identificerede VOC'er kan vigtige aromaforbindelser, såsom terpenoider og C6-flygtige stoffer, bruges som biomarkører for solbærfrugtkvalitet. Derudover diskuteres fordele og ulemper ved metoden, herunder potentielle forbedringer. Desuden er brugen af kontroller til batchkorrektion og minimering af afdriftsintensitet blevet fremhævet.
Introduction
Smag er et væsentligt kvalitetstræk for enhver frugt, der påvirker forbrugernes accept og dermed væsentligt påvirker omsætteligheden. Smagsopfattelse indebærer en kombination af smags- og olfaktoriske systemer og afhænger kemisk af tilstedeværelsen og koncentrationen af en bred vifte af forbindelser, der akkumuleres i spiselige plantedele, eller i tilfælde af VOC'er, der udsendes af den modne frugt1,2. Mens traditionel avl har fokuseret på agronomiske træk såsom udbytte og skadedyrsresistens, frugt kvalitet træk forbedring, herunder smag, har længe været forsømt på grund af den genetiske kompleksitet og vanskeligheden ved korrekt fænotype disse egenskaber, hvilket fører til forbrugernes utilfredshed3,4. Nylige fremskridt inden for metabolomiske platforme har haft succes med at identificere og kvantificere nøgleforbindelser, der er ansvarlige for frugtsmag og aroma5,6,7,8. Desuden giver kombinationen af metabolitprofilering med genomiske eller transskriptomiske værktøjer mulighed for at belyse den genetik, der ligger til grund for frugtsmagen, hvilket igen vil hjælpe avlsprogrammer med at udvikle nye sorter med forbedrede organoleptiske egenskaber2,4,9,10,11,12,13,14.
Solbær (Ribes nigrum) bær er meget værdsat for deres smag og ernæringsmæssige egenskaber, der dyrkes bredt på tværs af de tempererede zoner i Europa, Asien og New Zealand15. Det meste af produktionen forarbejdes til fødevarer og drikkevarer, som er meget populære i De Nordiske Lande, primært på grund af bærenes organoleptiske egenskaber. Den intense farve og smag af frugten er resultatet af en kombination af anthocyaniner, sukkerarter, syrer og VOC'er til stede i de modne frugter16,17,18. Analysen af solbær flygtige går tilbage til 1960'erne19,20,21. For nylig har flere undersøgelser fokuseret på solbær VOC'er, identificere vigtige forbindelser til frugtaromaopfattelse og vurdering af virkningen af genotype, miljø eller opbevarings- og forarbejdningsforhold på VOC-indhold5,17,18,22,23.
På grund af dens mange fordele er den foretrukne teknik til højgennemsigtigt flygtig profilering HS-SPME/GC-MS24,25. En silica fiber, belagt med en polymer fase, er monteret på en sprøjte enhed, så adsorption af flygtige stoffer i fiberen, indtil en ligevægt fase er nået. Headspace ekstraktion beskytter fiberen mod nonvolatile forbindelser til stede i matrix24. SPME kan med succes isolere et stort antal VOC'er, der er til stede ved meget variable koncentrationer (dele pr. milliard til dele pr. million)25. Derudover er det en opløsningsmiddelfri teknik, der kræver begrænset prøvebehandling. Andre fordele ved HS-SPME er den lette automatisering og dens relativt lave omkostninger.
Dens succes kan dog begrænses, afhængigt af VOC'ernes kemiske karakter, ekstraktionsprotokollen (herunder tid, temperatur og saltkoncentration), prøvestabilitet og tilgængeligheden af tilstrækkeligt frugtvæv26,27. Dette papir præsenterer en protokol for solbær VOC'er isoleret af HS-SPME og analyseret af gaskromatografi kombineret med en ion fælde massespektrometer. Der blev opnået en balance mellem mængden af plantemateriale, prøvestabilitet og varigheden af ekstraktion og kromatografi for at kunne behandle et stort antal solbærprøver, hvoraf nogle blev præsenteret i denne undersøgelse. Navnlig vil VOC-profiler og/eller kromatrammer af fem sorter (»Andega«, »Ben Tron«, »Ben Gairn«, »Ben Tirran« og »Tihope« blive præsenteret og diskuteret som eksempeldata. Desuden er den samme protokol med succes blevet gennemført til VOC-måling hos andre frugtbærarter som jordbær (Fragaria x ananassa), hindbær (Rubusidaeus) og blåbær (Vaccinium spp.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Frugthøst
- Vokse mellem 4 til 6 planter pr genotype og / eller behandling for at sikre tilstrækkeligt frugtmateriale og variabilitet.
- Høst om muligt prøverne på samme dato hvis der ikke er nok frugtmateriale, samles prøver, der er høstet på forskellige datoer.
BEMÆRK: Det anbefales, at høsttiden (morgen, middag, eftermiddag) forbliver omtrent identisk, da VOC-profiler påvirkes af døgnrytmen28,29,30,31. - Vurder frugtmodning fase ved visuel observation32. Poolfrugter fra samme modningsfase, da modningsstatus i høj grad påvirker VOC-emissionen. Kassér eventuelle beskadigede eller patogeninficerede frugter.
BEMÆRK: For bedre at kunne vurdere frugtmodenhed kan teksturanalysen udføres33. Derudover kan optælling dage efter blomstring bruges til at sikre, at poolede frugter tilhører et lignende modningsfase. - Medtag mindst 10-15 frugter pr. biologisk oxid (3 til 5) til VOC-analyse.
BEMÆRK: Her blev tre separate puljer med 13-20 frugter (biologiske kopier) af 'Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' og 'Tihope'-sorter høstet to steder (Polen og Skotland) i sommeren 2018 og direkte frosset i flydende nitrogen. Prøverne blev derefter sendt til laboratoriet og behandlet som beskrevet nedenfor. - Når de er høstet, fryses alle frugter straks i flydende nitrogen, og opbevar dem derefter ved -80 °C indtil forarbejdning.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, kan frugter behandles direkte efter høst. I dette tilfælde kan friske frugter homogeniseres i en mixer, vejes og analyseres direkte (trin 3.1 og fremefter). For at forhindre, at frugter kan undgå yderligere nedbrydningsprocesser efter 1990,00%, bør det friske materiale dog opbevares i en køligere (4 °C) og forarbejdes så hurtigt som muligt. Hvis det ikke håndteres korrekt, kan flydende nitrogen producere kolde forbrændinger og forårsage kvælning i dårligt ventilerede rum.
2. Frugtprøve og reagenspræparat
- Slib frugterne i et fint pulver, idet du sørger for altid at holde dem frosne ved hjælp af flydende nitrogen. Brug en kryogen mølle, perlemølle eller en mørtel og støder til homogenisering. Forkøl rustfri slibeglas eller mørtel og støder med flydende nitrogen for at undgå prøve optøning.
BEMÆRK: Det er vigtigt at homogenisere prøver til et fint pulver for at sikre korrekt VOC-ekstraktion. - Der vejes 1 g frosset materiale (fra trin 2.1.) i et 5 mL rør, der tidligere er afkølet i flydende nitrogen, og bemærk den nøjagtige vægt. Materialet opbevares ved -80 °C, indtil det behandles trin 3.1.
- Medtag 'referenceprøver' eller 'kontrolprøver' i analysen for at kontrollere teknisk variation, herunder VOC-udvinding og HS-SPME/GC-MS-ydeevne. Til dette formål samles en blanding af tilfældigt udvalgte frugtprøver og omfatter mindst én kontrolprøve pr. dag til VOC-analyse. Derudover skal du bruge en intern standard, som beskrevet i trin 2.5., for at minimere virkningen af intensitetsdrift.
- Tilbered 20 % (w/v) natriumchloridopløsning i højtydende flydende kromatografi (HPLC) vand (i det følgende benævnt NaCl-opløsning). Opløs NaCl ved hjælp af en magnetisk omrører; sikre, at der er 1 mL af opløsningen pr. prøve.
- Forbered en 1 ppm-opløsning i HPLC-kvalitet methanol af N-pentadecane (D32, 98%) fra ren kommerciel standard (i det følgende benævnt den interne standard).
BEMÆRK: N-pentadecane-d32 vil blive brugt som intern standard, og der vil være behov for 5 μL pr. prøve. Methanol skal manipuleres under en røghætte. - Udarbejde 1 ppm-løsninger i HPLC-kvalitet metanol af rene kommercielle standarder for VOC-identifikation (se tabel 1 for listen over kommercielle standarder, der anvendes i denne undersøgelse).
- Forbered 10 mL skrue-cap headspace hætteglas ved at tilføje 0,5 g NaCl i hvert nødvendigt hætteglas. Sørg for, at skruelåg omfatter en septum bestående af et blødt materiale, dvs silikone, med en tynd polytetrafluoroethylen film på indersiden, for at undgå forurening.
3. Prøveforberedelse
- Der tilsættes 1 mL NaCl-opløsning til det 5 ML-rør, der indeholder den vejede frosne prøve. Ryst røret, indtil prøven er helt optøet og homogeniseret.
- Centrifuge ved 5000 × g i 5 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten overføres med en 1000 μL pipettespids til det NaCl-holdige headspace-hætteglas. Skær enden af spidsen for at lette denne proces.
- Der tilsættes 5 μL intern standard til hvert prøveholdigt headspace-hætteglas.
4. HS-SPME/GC-MS dataindsamling
- Placer det lukkede headspace-hætteglas i en GC-MS autosampler ved stuetemperatur til en automatiseret HS-SPME/GC-MS-kørsel, som er beskrevet i afsnit 4. Placer ikke biologiske kopier i på hinanden følgende positioner i autosampleren; I stedet tilfældigt distribuere dem for at minimere virkningen af intensitet drift.
BEMÆRK: Ca. 10-12 hætteglas kan placeres på én gang i autosamperen, uden at det påvirker prøvestabiliteten. - Forincubate headspace hætteglas 10 min ved 50 °C med agitation ved 17 x g.
- Sæt en SPME-enhed i hætteglasset for at udsætte fiberen for headspace til VOC-udsugning i 30 min ved 50 °C med omrøring ved 17 x g.
- Fiberen indføres i injektionsporten i 1 min ved 250 °C i splitless-tilstand for flygtig desorption.
- Rengør fiberen i en SPME-rengøringsstation med nitrogen (1 bar N2, ≥ 99,8% ren) i 5 min ved 250 °C. Genbrug fiberen ca. 100x.
- Analyser VOC'er med en gaskromatograf koblet til et ionfældemassespektrometer (se materialetabellen), og udfør kromatografi under en konstant strøm af helium (Han ≥ 99,9999% renhed) på 1 mL/min, med en kolonne, der har dimensioner på 60 m x 0,25 mm x 1 μm tykkelse. Brug et ovntemperaturprogram, der er et andet sted ved 40 °C i 3 min, efterfulgt af en 8 °C/min rampe til 250 °C og hold ved 250 °C i 5 min. For massespektrometri skal overførselslinjen og ionkildetemperaturerne indstilles til henholdsvis 260 °C og 230 °C. Indstil ioniseringsenergien til 70 eV og det registrerede masseområde til m/z 35-220 ved 6 scanninger pr. s.
- Uddrag og analysér 1 ppm løsninger af kommercielle standarder som beskrevet ovenfor. Derudover skal du køre en blanding, der indeholder alle de fortyndede kommercielle standarder blandet med 300 μL NaCl-opløsning og 900 μL HPLC-vand før erhvervelse af prøvedata, for at kontrollere den korrekte kalibrering af udstyret. Medtag desuden en tom prøve, der indeholder NaCl-opløsning alene i hvert parti.
5. Analyse af GC-MS profilkromamatrammer: VOC-identifikation og semikvantificering
- Åbn rå GC-MS-profilfiler med den software, der leveres af producenten. For at identificere forbindelser skal deres retentionstider og massespektre og Kovats lineære retentionsindeks bestemmes ud fra prøvernes kromatografier med retentionsindekser, der er opnået fra autentiske standarder. For hver kommerciel standard, anmærke opbevaringstid og de mest rigelige m / z ioner. Vælg derefter en bestemt m/z ion for hver VOC (tabel 1).
- Integrer automatisk VOC-toppe baseret på standardfastholdelsestider og valgte m/z ioner af de valgte GC-MS-raw-filer. Til dette skal du angive en liste for hver VOC med opbevaringstid og valgt m/z ion. Selvom softwaren automatisk integrerer spidsbelastningsområde svarende til den samme opbevaringstid og m/z ion som angivet i sekvensopsætningen, skal du kontrollere den korrekte integration af hver top og rette den manuelt, hvis det er nødvendigt.
- Beregn topområdet for hver VOC i forhold til den interne standard for at minimere instrumental variation og intensitetsdrift.
BEMÆRK: Ved analyse af frugt fra forskellige genotyper eller vækst- og opbevaringsforhold anbefales det stærkt at bestemme VOC-indholdet i forhold til indholdet af frugttørvægten for at udelukke fortyndingseffekter på grund af forskelle i vandindholdet. - Ved batcheffektkorrektion normaliseres VOC-spidsområdet for hver prøve til det tilsvarende spidsareal i den kontrolprøve, der analyseres i samme kørsel.
BEMÆRK: Der opnås en relativ VOC kvantificering; I forbindelse med forsøget kan VOC-indholdet dog bestemmes i forhold til enhver prøve (f.eks. ubehandlede frugter for at sammenligne lagringseffekten på VOC-niveauer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
High-throughput VOC profilering i et stort sæt af frugtafgrøder dyrket under forskellige forhold eller steder eller tilhører forskellige genotyper er nødvendig for præcis aroma phenotyping. Her præsenteres en hurtig og semi-automatiseret HS-SPME/GC-MS-platform til relativ VOC kvantificering i solbær sorter. VOC-påvisning og identifikation var baseret på et bibliotek, der blev udviklet til at profilere bærfrugtarter (tabel 1). En typisk moden solbærfrugt flygtig profil (total ionkromatogram) opnået ved HS-SPME/GC-MS i ovennævnte betingelser er vist i figur 1A. I alt blev der identificeret 63 VOC'er, der tilhørte flere kemiske klasser, hvoraf størstedelen var estere (27), aldehyder (12), alkoholer (8), ketoner (7), terpener (5) og furaner (3) (tabel 1).
Terpenoid forbindelser, estere, og C6 forbindelser er blevet beskrevet til at dominere solbær volatilome og at være vigtigt for aroma af den friske frugt5,17. Efter disse tidligere undersøgelser svarer nogle af de mest rigelige toppe observeret i figur 1A til to monoterpener (linalool og terpineol) og to C6-forbindelser ((E)-2-hexenal og (Z)-3-hexenal). Eksempel på massespektre fremstillet af solbærprofiler og deres sammenligning med spektre af rene kommercielle standarder er vist for (E)-2-hexenal og terpineol i henholdsvis figur 1B og figur 1C.
Figur 1: Repræsentative kromattogrammer af moden solbærfrugt fremstillet af HS-SPME/GC-MS (fra »Andega«-kultivar). (A) ionkromatogram i alt. (Z)-3-hexenal (Retentionstid 14,33 min), (E)-2-hexenal (15,86 min), linalool (21,65 min) og terpineol (24,01 min) toppe er angivet med tallene henholdsvis 1, 2, 3 og 4. (B) Massespektrum svarende til (E)-2-hexenal peak fra en solbærprofil og sammenligning med en ren kommerciel standard. (C) Massespektrum svarende til terpineol peak fra en solbærprofil og sammenligning med en ren kommerciel standard. Forkortelse: HS-SPME/GC-MS = headspace solid-phase mikroekstraktion kombineret med gaskromatografi-massespektrometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Mens terpener er blevet afbildet som indikatorer for solbær frugt friskhed, C6 forbindelser er kendt som 'grønne blade flygtige', bibringe 'grønne' noter til frugt og grøntsager aroma34. Således kan semi-kvantificeringen af disse VOC'er, der udsendes af modne frugter af forskellige solbærsorter, være det første skridt i at forbedre smagsrelaterede træk. Da miljø- og plantevækstbetingelserne i høj grad påvirker VOC-indholdet af frugt, som er en af de største ulemper ved aromaavl, var et af formålene med denne undersøgelse at validere hypotesen om, at semikvantificeringen af de identificerede VOC'er i de samme sorter (»Ben Tron«, »Ben Gairn«, »Ben Tirran« og »Tihope«) var reproducerbar i diametralt modsatte europæiske steder som Polen og Skotland. Som forventet viste hovedkomponentanalysen (PCA) af VOC-profilerne af fire forskellige solbærkulivaer, at miljøet i høj grad påvirker flygtigt indhold, da hovedkomponenten (PC) 1 adskiller prøver baseret på deres placering (figur 2). Virkningen af genotype kan dog observeres med PC2, da 'Ben Tirran' er klart adskilt fra de resterende sorter (figur 2).
Figur 3 viser linalools relative indhold og (E)-2-hexenal i de fire vurderede solbærsorter. For begge steder blev VOC-indholdet normaliseret til den samme kontrolprøve, for hvilken semikvantificeringen bekræftede, at linaloolindholdet generelt var højere i Polen end i Skotland, mens (E)-2-hexenal viser den modsatte tendens (figur 3). Dette resultat viser miljøpåvirkningen på VOC-indholdet i solbærfrugter, selv om andelen af de to flygtige stoffer, der var til stede i de fire vurderede sorter, var konstant, idet »Ben Tirran« og »Ben Tron«-sorter viste de højeste mængder linalool og (E)-2-hexenal) (figur 3). Samlet set viser disse resultater, at den foreslåede metode er gyldig for fænotype VOC-indhold og kombineret med genetiske tilgange kan anvendes til frugtkvalitetsavl.
Figur 2: PCA til vurdering af variansen blandt VOC-profiler i de fire solbærkultivarer, der dyrkes i Polen og Skotland. PC1 (miljø) forklarer 46,2% af variabiliteten, mens PC2 (genotype) bidrager med 24,8% af variansen i datasættet. Forkortelser: PCA = analyse af hovedkomponenter; PC1 = første hovedkomponent; PC2 = anden hovedkomponent; VOC = flygtig organisk forbindelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Det relative indhold af to repræsentative VOC'er i solbæraromaprofiler-linalool og (E)-2-hexenal, høstet i Skotland og Polen. Fire forskellige solbærkultivarer blev vurderet (»Ben Gairn«, »Ben Tirran«, »Ben Tron« og »Tihope«). Søjlerne repræsenterer middelværdierne for to biologiske replikater, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. Statistiske sammenligninger blev udført af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post-hoc-test for at bestemme betydelige forskelle i VOC-indhold mellem sorter og lande. For VOC-indhold med de samme små bogstaver (a, ab, b) blev der ikke observeret væsentlige forskelle ved P < 0,05. Forkortelser: VOC = flygtige organiske forbindelser; ANOVA = analyse af varians. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Liste over VOC'er, der er identificeret af HS-SPME/GC-MS i solbærfrugter. Retentionstid (min), udvalgt m/z ion til VOC-identifikation og semikvantificering, aromabeskrivelse, kemisk klasse og formel samt CAS-nummer er angivet. Forkortelser: HS-SPME/GC-MS = headspace solid-phase mikroekstraktion kombineret med gaskromatografi-massespektrometri; VOC = flygtige organiske forbindelser; KRI = Kovats fastholdelse indeks; CAS-nummer = Registreringsnummer for Kemiske Abstracts Service. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avl for frugt aroma har længe været hæmmet af den komplekse genetik og biokemi, der ligger til grund for syntesen af flygtige forbindelser og manglen på teknologier til korrekt phenotyping. Men de seneste fremskridt inden for metabolomiske platforme kombineret med genomiske værktøjer tillader endelig identifikation af de metabolitter, der er ansvarlige for forbrugernes præferencer og for at opdrætte afgrøder med forbedret smag3. Mens de fleste fremskridt er opnået i modellen frugt, tomat9,10, lignende resultater kunne opnås i andre økonomisk relevante afgrøde arter såsom jordbær, æble, eller blåbær2,12,35,36.
Dette papir præsenterer en hurtig og reproducerbar HS-SPME/GC-MS-baseret platform, der med succes er blevet brugt til måling af VOC-indhold i forskellige bærarter, herunder solbær, en frugt, der er meget værdsat for sin delikate smag og bemærkelsesværdige næringsværdi. Sammenlignet med tidligere offentliggjorte metoder blev den største forbedring opnået ved at reducere den samlede kromatografiske køretid. Det var faktisk muligt at øge temperaturrampen fra 5 °C/min til 8 °C/min med tilstrækkelig opløsning, hvilket reducerede kromatografiske tid fra 50 min til 35 min (figur 1A)27. Desuden synes den store mængde NaCl, der er tilsat prøverne (1 mL 20% NaCl-opløsning + 0,5 g solid NaCl), at påvirke prøvestabiliteten positivt over tid. Faktisk var flygtige profiler stabile over tid og kombineret med hurtigere kromatografi tillod måling af op til 20-22 prøver om dagen.
Brugen af en intern standard, såsom N-pentadecane-d32, sammen med en korrekt fordeling af de biologiske kopier langs kørslen, er nødvendig for at forhindre intensitet drift37. Desuden skal kontrol- eller referenceprøver køres mindst én gang om dagen for analyse for batchkorrektion. Variationer mellem partier er primært forårsaget af ændringer i detektor følsomhed eller af fiber aging27. Mens denne protokol gjorde det muligt at påektione mere end 60 VOC'er, der er til stede i hovedrummet af modne solbærfrugter, skal læserne tage højde for, at dette antal let kan øges ved at tilføje rene kommercielle standarder i det foreslåede bibliotek (tabel 1). For eksempel opdagede offentliggjorte undersøgelser et stort antal terpenoidforbindelser, der ikke var inkluderet i denne analyse5,17. I den forstand kan et mere solbær-aroma-specifikt VOC-bibliotek let sættes sammen, hvis det er nødvendigt. Målet med denne undersøgelse var imidlertid at tilpasse et tidligere etableret bibliotek27 til VOC-måling i forskellige bær, herunder hindbær, jordbær og solbærfrugter.
Det er bemærkelsesværdigt, at den protokol, der præsenteres her, har flere fordele og ulemper, som andre HS-SPME/ GC-MS-platforme, som allerede er blevet diskuteret andetsteds25,26,38. Mens det giver nem automatisering, hvilket gør det til den foretrukne teknik, når et stort antal prøver skal analyseres, er dens største ulempe dens modtagelighed for matrixeffekter38. Derudover bør der udvises særlig forsigtighed under valg af SPME-fiberbelægning og med prøveudtagningsforhold afhængigt af den kemiske karakter af de målrettede VOC25,27. Afslutningsvis præsenteres en hurtig og semi-automatiseret protokol til VOC-profilering i bærfrugthovedrum her og kan let tilpasses til brug med en øget biblioteksstørrelse, hvis det kræves. Det forventes, at denne platform kan tilpasses andre frugtarter, og når den kombineres med genomiske undersøgelser og/eller sensorisk analysepanel, vil det hjælpe med at beskære aromaprofilering og forbedring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación fra University of Malaga for HS-SPME/GC-MS målinger. Vi anerkender Sara Fernández-Palacios Campos' bistand i forbindelse med flygtig kvantificering. Vi takker også GoodBerry's konsortium medlemmer for at levere frugt materiale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A.
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J.
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
