Summary
Een headspace vaste fase micro-extractie-gas-chromatografie platform wordt hier beschreven voor snelle, betrouwbare en semi-geautomatiseerde vluchtige identificatie en kwantificering in rijpe zwarte bessenvruchten. Deze techniek kan worden gebruikt om de kennis over fruitaroma te vergroten en cultivars met verbeterde smaak te selecteren voor het doel van veredeling.
Abstract
Er is een toenemende belangstelling voor het meten van vluchtige organische stoffen (VOS) die door rijpe vruchten worden uitgestoten met het oog op het veredelen van variëteiten of cultivars met verbeterde organoleptische kenmerken en dus om de acceptatie door de consument te vergroten. Metabolomische platforms met hoge doorvoer zijn onlangs ontwikkeld om een breed scala aan metabolieten in verschillende plantenweefsels te kwantificeren, waaronder belangrijke verbindingen die verantwoordelijk zijn voor de smaak van fruit en aromakwaliteit (volatilomics). Een methode met behulp van headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) wordt hier beschreven voor de identificatie en kwantificering van VOC's die worden uitgestoten door rijpe zwarte bessenvruchten, een bes die zeer wordt gewaardeerd om zijn smaak en gezondheidsvoordelen.
Rijpe vruchten van zwarte bessenplanten (Ribes nigrum) werden geoogst en direct ingevroren in vloeibare stikstof. Na weefselhomogenisatie om een fijn poeder te produceren, werden monsters ontdooid en onmiddellijk gemengd met natriumchlorideoplossing. Na centrifugering werd het supernatant overgebracht in een glazen injectieflacon met natriumchloride. VOC's werden vervolgens geëxtraheerd met behulp van een vaste-fase micro-extractie (SPME) vezel en een gaschromatograaf gekoppeld aan een ionenval massaspectrometer. Vluchtige kwantificering werd uitgevoerd op de resulterende ionchromatogrammen door piekgebied te integreren, met behulp van een specifiek m/z-ion voor elke VOS. Correcte VOS-annotatie werd bevestigd door retentietijden en massaspectra van zuivere commerciële normen te vergelijken die onder dezelfde omstandigheden als de monsters worden uitgevoerd. Meer dan 60 VOC's werden geïdentificeerd in rijpe zwarte bessen die op contrasterende Europese locaties werden geteeld. Onder de geïdentificeerde VOC's kunnen belangrijke aromastoffen, zoals terpenoïden en C6-vluchtige stoffen, worden gebruikt als biomarkers voor de kwaliteit van zwarte bessen. Daarnaast worden voor- en nadelen van de methode besproken, inclusief toekomstige verbeteringen. Verder is de nadruk gelegd op het gebruik van controles voor batchcorrectie en minimalisering van de driftintensiteit.
Introduction
Smaak is een essentiële kwaliteitseigenschap voor elk fruit, dat van invloed is op de acceptatie door de consument en dus de verkoopbaarheid aanzienlijk beïnvloedt. Smaakperceptie omvat een combinatie van de smaak- en reuksystemen en is chemisch afhankelijk van de aanwezigheid en concentratie van een breed scala aan verbindingen die zich ophopen in eetbare plantendelen, of in het geval van VOC's, worden uitgestoten door de rijpe vrucht1,2. Terwijl traditionele veredeling zich heeft gericht op agronomische eigenschappen zoals opbrengst en resistentie tegen plagen, is de verbetering van de fruitkwaliteit, inclusief smaak, lang verwaarloosd vanwege de genetische complexiteit en de moeilijkheid om deze kenmerken goed te fenotyperen, wat leidt tot ontevredenheid van de consument3,4. Recente ontwikkelingen in metabolomische platforms zijn succesvol geweest in het identificeren en kwantificeren van belangrijke verbindingen die verantwoordelijk zijn voor de smaak en het aroma van fruit5,6,7,8. Bovendien maakt de combinatie van metabolietprofilering met genomische of transcriptomische hulpmiddelen de opheldering van de genetica die ten grondslag ligt aan de fruitsmaak mogelijk, wat op zijn beurt zal helpen bij het ontwikkelen van nieuwe variëteiten met verbeterde organoleptische kenmerken2,4,9,10,11,12,13,14.
Zwarte bessen (Ribes nigrum) worden zeer gewaardeerd om hun smaak en voedingseigenschappen en worden op grote schaal gekweekt in de gematigde zones van Europa, Azië en Nieuw-Zeeland15. Het grootste deel van de productie wordt verwerkt voor voedingsmiddelen en dranken, die erg populair zijn in de Scandinavische landen, voornamelijk vanwege de organoleptische eigenschappen van de bessen. De intense kleur en smaak van de vrucht zijn het resultaat van een combinatie van anthocyanen, suikers, zuren en VOC's die aanwezig zijn in de rijpe vruchten16,17,18. De analyse van vluchtige zwarte bessen gaat terug tot de jaren 196019,20,21. Meer recent hebben verschillende studies zich gericht op VOS van zwarte bessen, het identificeren van belangrijke verbindingen voor de perceptie van fruitaroma's en het beoordelen van de impact van genotype, omgeving of opslag- en verwerkingsomstandigheden op VOC-inhoud5,17,18,22,23.
Vanwege de vele voordelen is de voorkeurstechniek voor vluchtige profilering met hoge doorvoer HS-SPME/GC-MS24,25. Een silicavezel, bedekt met een polymere fase, wordt op een spuitapparaat gemonteerd, waardoor de adsorptie van de vluchtige stoffen in de vezel mogelijk is totdat een evenwichtsfase is bereikt. Headspace extractie beschermt de vezel tegen de niet-vluchtige verbindingen die aanwezig zijn in de matrix24. SPME kan met succes een groot aantal VOS isoleren die aanwezig zijn in zeer variabele concentraties (delen per miljard tot delen per miljoen)25. Bovendien is het een oplosmiddelvrije techniek die beperkte monsterverwerking vereist. Andere voordelen van HS-SPME zijn het automatiseringsgemak en de relatief lage kosten.
Het succes ervan kan echter beperkt zijn, afhankelijk van de chemische aard van de VOC's, het extractieprotocol (inclusief tijd, temperatuur en zoutconcentratie), monsterstabiliteit en de beschikbaarheid van voldoende vruchtweefsel26,27. Dit artikel presenteert een protocol voor zwarte bessen VOC's geïsoleerd door HS-SPME en geanalyseerd door gaschromatografie in combinatie met een ionenval massaspectrometer. Een evenwicht tussen de hoeveelheid plantaardig materiaal, de stabiliteit van het monster en de duur van de extractie en chromatografie werd bereikt om grote aantallen zwarte bessenmonsters te kunnen verwerken, waarvan sommige in deze studie werden gepresenteerd. In het bijzonder zullen VOC-profielen en/of chromatogrammen van vijf cultivars ('Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' en 'Tihope') als voorbeeldgegevens worden gepresenteerd en besproken. Bovendien is hetzelfde protocol met succes in de praktijk gebracht voor VOS-meting in andere fruitbessensoorten zoals aardbei (Fragaria x ananassa), framboos (Rubusidaeus) en bosbes (Vaccinium spp.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fruit oogsten
- Kweek tussen de 4 en 6 planten per genotype en/of behandeling om te zorgen voor voldoende vruchtmateriaal en variabiliteit.
- Oogst de monsters indien mogelijk op dezelfde datum; als er niet genoeg fruitmateriaal is, verzamel dan monsters die op verschillende data zijn geoogst.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de oogsttijd (ochtend, middag, middag) ongeveer identiek blijft, aangezien VOC-profielen worden beïnvloed door het dag/ circadiane ritme28,29,30,31. - Beoordeel de rijpingsfase van het fruit door visuele observatie32. Poolvruchten uit dezelfde rijpingsfase, omdat de rijpingsstatus een sterke invloed heeft op de VOS-uitstoot. Gooi alle beschadigde of met ziekteverwekkers geïnfecteerde vruchten weg.
OPMERKING: Om de rijpheid van fruit beter te beoordelen, kan textuuranalyse worden uitgevoerd33. Bovendien kan het tellen van dagen na de bloei worden gebruikt om ervoor te zorgen dat gepoolde vruchten tot een vergelijkbare rijpingsfase behoren. - Neem een minimum van 10-15 vruchten per biologische replicaat (3 tot 5) op voor VOC-analyse.
OPMERKING: Hier werden drie afzonderlijke pools van 13-20 vruchten (biologische replicaties) van 'Andega', 'Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' en 'Tihope' cultivars geoogst op twee locaties (Polen en Schotland) in de zomer van 2018 en direct ingevroren in vloeibare stikstof. Monsters werden vervolgens naar het laboratorium gestuurd en verwerkt zoals hieronder beschreven. - Vries na de oogst alle vruchten onmiddellijk in vloeibare stikstof in en bewaar ze vervolgens bij -80 °C tot de verwerking.
OPMERKING: Indien mogelijk kunnen vruchten direct na de oogst worden verwerkt. In dit geval kan vers fruit worden gehomogeniseerd in een mixer, gewogen en direct geanalyseerd (stap 3.1 verder). Om echter te voorkomen dat fruit na de oogst verder degraderend wordt, moet het verse materiaal in een koeler (4 °C) worden opgeslagen en zo snel mogelijk worden verwerkt. Als het niet goed wordt behandeld, kan vloeibare stikstof koude brandwonden veroorzaken en verstikking veroorzaken in slecht geventileerde ruimtes.
2. Fruitmonster en reagensbereiding
- Maal de vruchten tot een fijn poeder en zorg ervoor dat ze altijd bevroren blijven met behulp van vloeibare stikstof. Gebruik een cryogene molen, kralenmolen of een vijzel en stamper voor homogenisatie. Precool roestvrijstalen maalpotten of vijzel en stamper met vloeibare stikstof om te voorkomen dat het monster ontdooit.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om monsters te homogeniseren tot een fijn poeder om een goede VOS-extractie te garanderen. - Weeg 1 g bevroren materiaal (vanaf stap 2.1.) in een buis van 5 ml die eerder is afgekoeld in vloeibare stikstof en noteer het exacte gewicht. Houd het materiaal op -80 °C totdat stap 3.1 is verwerkt.
- Neem 'referentie'- of 'controlemonsters' op in de analyse om de technische variatie te controleren, inclusief VOS-extractie en HS-SPME/GC-MS-prestaties. Verzamel hiervoor een mengsel van willekeurig gekozen fruitmonsters en neem ten minste één controlemonster per dag op voor VOS-analyse. Gebruik bovendien een interne standaard, zoals beschreven in stap 2.5., om de impact van intensiteitsdrift te minimaliseren.
- Bereid 20% (m/v) natriumchlorideoplossing in water van hoge-prestatievloeistofchromatografie (HPLC) (hierna NaCl-oplossing genoemd). Los NaCl op met behulp van een magneetroerder; zorgen voor de beschikbaarheid van 1 ml van de oplossing per monster.
- Bereid een 1 ppm-oplossing in HPLC-kwaliteit methanol van N-pentadecaan (D32, 98%) uit zuivere commerciële standaard (hierna de interne standaard genoemd).
OPMERKING: N-pentadecane-d32 zal worden gebruikt als een interne standaard en 5 μL per monster zal nodig zijn. Methanol moet onder een zuurkast worden gemanipuleerd. - Bereid 1 ppm-oplossingen voor in HPLC-kwaliteit methanol van zuivere commerciële normen voor VOS-identificatie (zie tabel 1 voor de lijst van commerciële normen die in dit onderzoek worden gebruikt).
- Bereid injectieflacons met schroefdop 10 ml voor door 0,5 g NaCl toe te voegen aan elke benodigde injectieflacon. Zorg ervoor dat schroefdoppen een septum bevatten dat bestaat uit een zacht materiaal, d.w.z. siliconen, met een dunne polytetrafluorethyleenfilm aan de binnenkant, om verontreiniging te voorkomen.
3. Monstervoorbereiding
- Voeg 1 ml NaCl-oplossing toe aan de buis van 5 ml met het gewogen bevroren monster. Schud de buis totdat het monster volledig is ontdooid en gehomogeniseerd.
- Centrifugeer bij 5000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng het supernatant met een pipetpunt van 1000 μL over naar de NaCl-bevattende injectieflacon met headspace. Snijd het uiteinde van de punt om dit proces te vergemakkelijken.
- Voeg 5 μL interne standaard toe aan elke monsterbevattende headspace-injectieflacon.
4. HS-SPME/GC-MS data-acquisitie
- Plaats de injectieflacon met gesloten headspace in een GC-MS autosampler bij kamertemperatuur, voor een geautomatiseerde HS-SPME/GC-MS-run, die wordt beschreven in rubriek 4. Plaats geen biologische replicaties in opeenvolgende posities in de autosampler; verdeel ze in plaats daarvan willekeurig om de impact van intensiteitsdrift te minimaliseren.
OPMERKING: Ongeveer 10-12 injectieflacons kunnen tegelijk in de autosampler worden geplaatst, zonder de stabiliteit van het monster te beïnvloeden. - Pre-incrateer de injectieflacons met headspace 10 min bij 50 °C met agitatie bij 17 x g.
- Plaats een SPME-apparaat in de injectieflacon om de vezel gedurende 30 minuten bij 50 °C bloot te stellen aan de headspace voor VOC-extractie met agitatie bij 17 x g.
- Breng de vezel gedurende 1 minuut bij 250 °C in splitless-modus in de injectiepoort voor vluchtige desorptie.
- Reinig de vezel in een SPME-reinigingsstation met stikstof (1 bar N2, ≥ 99,8% zuiver) gedurende 5 min bij 250 °C. Hergebruik de vezel ongeveer 100x.
- Analyseer VOC's met een gaschromatograaf gekoppeld aan een ionenvalmassaspectrometer (zie de tabel met materialen) en voer chromatografie uit onder een constante stroom helium (Hij ≥ 99,9999% zuiverheid) van 1 ml / min, met een kolom met afmetingen van 60 m x 0,25 mm x 1 μm dikte. Gebruik een oventemperatuurprogramma dat isotherm is bij 40 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door een helling van 8 °C/min tot 250 °C en gedurende 5 minuten op 250 °C. Voor massaspectrometrie stelt u de temperatuur van de overdrachtslijn en de ionenbron in op respectievelijk 260 °C en 230 °C. Stel de ionisatie-energie in op 70 eV en het geregistreerde massabereik op m/z 35-220 bij 6 scans per s.
- Extraheer en analyseer 1 ppm-oplossingen van commerciële normen zoals hierboven beschreven. Voer bovendien een mengsel uit dat alle verdunde commerciële normen bevat, gemengd met 300 μL NaCl-oplossing en 900 μL HPLC-water vóór monstergegevensverzameling om de juiste kalibratie van de apparatuur te controleren. Neem bovendien in elke batch een blancomonster met alleen NaCl-oplossing op.
5. Analyse van GC-MS profielchromatogrammen: VOS-identificatie en semi-kwantificering
- Open raw GC-MS-profielbestanden met de software van de fabrikant. Om verbindingen te identificeren, vergelijkt u hun retentietijden en massaspectra en Kovats lineaire retentie-indices bepaald uit de chromatogrammen van de monsters met retentie-indices verkregen uit authentieke standaarden. Annoteer voor elke commerciële standaard de retentietijd en de meest voorkomende m/z-ionen . Selecteer vervolgens een specifiek m/z-ion voor elke VOS (tabel 1).
- Integreer VOC-pieken automatisch op basis van standaard retentietijden en gekozen m/z-ionen van de geselecteerde GC-MS raw-bestanden. Geef hiervoor een lijst op voor elke VOC met retentietijd en geselecteerd m/z-ion . Hoewel de software automatisch piekgebied integreert dat overeenkomt met dezelfde retentietijd en m / z-ion als in de volgorde-instelling, controleert u de juiste integratie van elke piek en corrigeert u deze indien nodig handmatig.
- Bereken het piekoppervlak van elke VOC ten opzichte van dat van de interne standaard om instrumentele variatie en intensiteitsdrift te minimaliseren.
OPMERKING: Bij het analyseren van fruit van verschillende genotypen of groei- en bewaaromstandigheden, wordt het ten zeerste aanbevolen om het VOS-gehalte te bepalen ten opzichte van het droge gewicht van het fruit om verdunningseffecten als gevolg van verschillen in watergehalte uit te sluiten. - Voor batcheffectcorrectie normaliseert u het VOC-piekgebied van elk monster tot het overeenkomstige piekgebied in het controlemonster dat in dezelfde run is geanalyseerd.
OPMERKING: Er wordt een relatieve VOS-kwantificering verkregen; voor het doel van het experiment kan het VOS-gehalte echter worden bepaald ten opzichte van elk monster (bijvoorbeeld onbehandelde vruchten om het effect van opslag op VOS-niveaus te vergelijken).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
High-throughput VOC-profilering in een grote reeks fruitgewassen die onder verschillende omstandigheden of locaties worden geteeld of tot verschillende genotypen behoren, is noodzakelijk voor nauwkeurige aromafenotypering. Hier wordt een snel en semi-geautomatiseerd HS-SPME/GC-MS-platform voor relatieve VOC-kwantificering in zwarte bessencultivars gepresenteerd. VOC-detectie en -identificatie waren gebaseerd op een bibliotheek die werd ontwikkeld om bessenfruitsoorten te profileren (tabel 1). Een typisch vluchtig profiel van zwarte bessen (totaal ionchromatogram) verkregen door HS-SPME/GC-MS in de bovengenoemde omstandigheden is weergegeven in figuur 1A. In totaal werden 63 VOS geïdentificeerd, behorend tot verschillende chemische klassen, waarvan de meerderheid esters (27), aldehyden (12), alcoholen (8), ketonen (7), terpenen (5) en furanen (3) waren (tabel 1).
Van terpenoïde verbindingen, esters en C6-verbindingen is beschreven dat ze de zwarte bessenvolatoom domineren en belangrijk zijn voor het aroma van het verse fruit5,17. In overeenstemming met deze eerdere studies komen enkele van de meest voorkomende pieken waargenomen in figuur 1A overeen met twee monoterpenen (linalool en terpineol) en twee C6-verbindingen ((E)-2-hexenaal en (Z)-3-hexeenaal). Voorbeelden van massaspectra verkregen uit zwarte bessenprofielen en hun vergelijking met spectra van zuivere commerciële normen worden getoond voor (E)-2-hexeenaal en terpineol in respectievelijk figuur 1B en figuur 1C.
Figuur 1: Representatieve chromatogrammen van rijpe zwarte bessenvruchten verkregen door HS-SPME/GC-MS (van cultivar "Andega"). (A) Totaal ionchromatogram. (Z)-3-hexenale (retentietijd 14,33 min), (E)-2-hexenale (15,86 min), linalool (21,65 min) en terpineol (24,01 min) pieken worden aangegeven met respectievelijk de getallen 1, 2, 3 en 4. (B) Massaspectrum overeenkomend met (E)-2-hexenale piek van een zwarte bessenprofiel en vergelijking met een zuivere commerciële standaard. (C) Massaspectrum dat overeenkomt met de terpineolpiek van een zwarte bessenprofiel en vergelijking met een zuivere commerciële standaard. Afkorting: HS-SPME/GC-MS = headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hoewel terpenen zijn afgebeeld als indicatoren van de versheid van zwarte bessen, staan C6-verbindingen bekend als 'groene bladvluchtige stoffen', die 'groene' tonen geven aan het aroma van fruit en groenten34. De semi-kwantificering van deze VOC's die worden uitgestoten door rijpe vruchten van verschillende zwarte bessenvariëteiten kan dus de eerste stap zijn in het verbeteren van smaakgerelateerde eigenschappen. Aangezien het milieu en de groeiomstandigheden van planten een sterke invloed hebben op het VOS-gehalte van fruit, wat een van de belangrijkste nadelen is voor aromaveredeling, was een van de doelstellingen van deze studie om de hypothese te valideren dat de semi-kwantificering van de geïdentificeerde VOS in dezelfde cultivars ('Ben Tron', 'Ben Gairn', 'Ben Tirran' en 'Tihope') reproduceerbaar was in diametraal tegenovergestelde Europese locaties zoals Polen en Schotland. Zoals verwacht toonde de analyse van de hoofdcomponenten (PCA) van de VOS-profielen van vier verschillende cultivars van zwarte bessen aan dat de omgeving een sterke invloed heeft op het vluchtige gehalte, aangezien hoofdcomponent (PC) 1 monsters scheidt op basis van hun locatie (figuur 2). Het effect van het genotype kan echter worden waargenomen met PC2, omdat 'Ben Tirran' duidelijk gescheiden is van de resterende cultivars (figuur 2).
Figuur 3 toont het relatieve gehalte aan linalool en (E)-2-hexenaal in de vier beoordeelde zwarte bessencultivars. Voor beide locaties werd het VOS-gehalte genormaliseerd naar hetzelfde controlemonster, waarvoor de semi-kwantificering bevestigde dat het linaloolgehalte in Polen over het algemeen hoger was dan in Schotland, terwijl (E)-2-hexenaal de tegenovergestelde trend laat zien (figuur 3). Dit resultaat toont de milieu-impact op het VOS-gehalte in zwarte bessenvruchten, hoewel het aandeel van de twee vluchtige stoffen in de vier beoordeelde cultivars constant was, waarbij 'Ben Tirran'- en 'Ben Tron'-cultivars respectievelijk de hoogste hoeveelheden linalool en (E)-2-hexenaal vertoonden (figuur 3). Al met al geven deze resultaten aan dat de voorgestelde methode geldig is voor het FENOTYPE VOS-gehalte en in combinatie met genetische benaderingen kan worden gebruikt voor de veredeling van de fruitkwaliteit.
Figuur 2: PCA om de variantie tussen VOS-profielen in de vier zwarte bessencultivars die in Polen en Schotland worden gekweekt, te beoordelen. PC1 (omgeving) verklaart 46,2% van de variabiliteit, terwijl PC2 (genotype) 24,8% van de variantie in de dataset bijdraagt. Afkortingen: PCA = principal component analysis; PC1 = eerste hoofdcomponent; PC2 = tweede hoofdcomponent; VOS = vluchtige organische stof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Relatief gehalte van twee representatieve VOS in aromaprofielen voor zwarte bessen-linalool en (E)-2-hexenaal, geoogst in Schotland en Polen. Vier verschillende zwarte bessencultivars werden beoordeeld ('Ben Gairn', 'Ben Tirran', 'Ben Tron' en 'Tihope'). De staven vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van twee biologische replicaties en foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc test om significante verschillen in VOC-gehalte tussen cultivars en landen te bepalen. Voor VOS-gehalten met dezelfde kleine letters (a, ab, b) werden geen significante verschillen waargenomen bij P < 0,05. Afkortingen: VOS = vluchtige organische stoffen; ANOVA = variantieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van VOS geïdentificeerd door HS-SPME/GC-MS in zwarte bessenvruchten. Retentietijd (min), geselecteerd m/z-ion voor VOS-identificatie en semi-kwantificering, aromabeschrijving, chemische klasse en formule en CAS-nummer worden aangegeven. Afkortingen: HS-SPME/GC-MS = headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry; VOS = vluchtige organische stoffen; KRI = Kovats retentie index; CAS-nummer = Registratienummer van de Chemical Abstracts Service. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het veredelen van fruitaroma's wordt al lang belemmerd door de complexe genetica en biochemie die ten grondslag liggen aan de synthese van vluchtige stoffen en het gebrek aan technologieën voor een goede fenotypering. Recente ontwikkelingen in metabolomische platforms, gecombineerd met genomische hulpmiddelen, maken het echter eindelijk mogelijk om de metabolieten te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de voorkeuren van de consument en om gewassen met een verbeterde smaak te kweken3. Hoewel de meeste vooruitgang is geboekt in het modelfruit, tomaat9,10, kunnen vergelijkbare resultaten worden bereikt in andere economisch relevante gewassoorten zoals aardbei, appel of bosbes2,12,35,36.
Dit artikel presenteert een snel en reproduceerbaar HS-SPME / GC-MS-gebaseerd platform dat met succes is gebruikt voor het meten van VOS-gehalte in verschillende bessensoorten, waaronder zwarte bessen, een vrucht die zeer wordt gewaardeerd om zijn delicate smaak en opmerkelijke voedingswaarde. In vergelijking met eerder gepubliceerde methoden werd de belangrijkste verbetering bereikt door de totale chromatografische looptijd te verkorten. Het was inderdaad mogelijk om de temperatuurstijging te verhogen van 5 °C/min naar 8 °C/min met voldoende resolutie, waardoor de chromatografische tijd werd teruggebracht van 50 min tot 35 min (figuur 1A)27. Bovendien lijkt de grote hoeveelheid NaCl die aan de monsters wordt toegevoegd (1 ml 20% NaCl-oplossing + 0,5 g vaste NaCl) de stabiliteit van het monster in de loop van de tijd positief te beïnvloeden. Inderdaad, vluchtige profielen waren stabiel in de tijd en in combinatie met snellere chromatografie, maakte het mogelijk om tot 20-22 monsters per dag te meten.
Het gebruik van een interne standaard, zoals N-pentadecane-d32, samen met een goede verdeling van de biologische replicaties langs de run, is noodzakelijk om intensiteitsdrift37 te voorkomen. Bovendien moeten controle- of referentiemonsters ten minste eenmaal per dag worden geanalyseerd voor batchcorrectie. Variaties tussen batches worden voornamelijk veroorzaakt door veranderingen in de gevoeligheid van de detector of door vezelveroudering27. Hoewel dit protocol de detectie mogelijk maakte van meer dan 60 VOC's die aanwezig zijn in de headspace van rijpe zwarte bessenvruchten, moeten lezers er rekening mee houden dat dit aantal gemakkelijk kan worden verhoogd door zuivere commerciële normen toe te voegen aan de voorgestelde bibliotheek (tabel 1). Gepubliceerde studies detecteerden bijvoorbeeld een groot aantal terpenoïde verbindingen die niet in deze analyse waren opgenomen5,17. In die zin kan indien nodig gemakkelijk een meer zwarte bessen-aroma-specifieke VOC-bibliotheek worden samengesteld. Het doel van deze studie was echter om een eerder gevestigde bibliotheek27 aan te passen voor VOC-meting in verschillende bessen, waaronder frambozen-, aardbei- en zwarte bessenvruchten.
Het is opmerkelijk dat het hier gepresenteerde protocol verschillende voor- en nadelen heeft, zoals andere HS-SPME / GC-MS-platforms, die elders al zijn besproken25,26,38. Hoewel het automatiseringsgemak biedt, waardoor het de techniek bij uitstek is wanneer een groot aantal monsters moet worden geanalyseerd, is het belangrijkste nadeel de gevoeligheid voor matrixeffecten38. Bovendien moet speciale voorzichtigheid worden betracht tijdens de selectie van SPME-vezelcoatings en met bemonsteringsomstandigheden afhankelijk van de chemische aard van de beoogde VOS25,27. Tot slot wordt hier een snel en semi-geautomatiseerd protocol voor VOC-profilering in de headspace van bessenfruit gepresenteerd dat indien nodig eenvoudig kan worden aangepast voor gebruik met een grotere bibliotheekgrootte. De verwachting is dat dit platform kan worden aangepast aan andere fruitsoorten en in combinatie met genomische studies en/of sensorisch analysepanel zal dit helpen bij het profileren en verbeteren van gewasaroma's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación van de Universiteit van Malaga voor HS-SPME/GC-MS metingen. We erkennen de hulp van Sara Fernández-Palacios Campos bij volatiele kwantificering. We bedanken ook de consortiumleden van GoodBerry voor het leveren van het fruitmateriaal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ' omics' approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A.
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. Antonio, C. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. 1284, Springer Science+Businesss. 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J.
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
