Summary
Dit artikel beschrijft een op magnetische levitatie gebaseerde methode die specifiek de aanwezigheid van antigenen kan detecteren, oplosbaar of membraangebonden, door veranderingen in de levitatiehoogte van vanvangkralen met vaste dichtheden te kwantificeren.
Abstract
De beschreven methode is ontwikkeld op basis van de principes van magnetische levitatie, die cellen en deeltjes scheidt op basis van hun dichtheid en magnetische eigenschappen. Dichtheid is een celtype identificerende eigenschap, direct gerelateerd aan de stofwisseling, differentiatie en activeringsstatus. Magnetische levitatie maakt een aanpak in één stap mogelijk om circulerende bloedcellen met succes te scheiden, in beeld te brengen en te karakteriseren, en om bloedarmoede, sikkelcelziekte en circulerende tumorcellen te detecteren op basis van dichtheid en magnetische eigenschappen. Deze aanpak is ook vatbaar voor het detecteren van oplosbare antigenen die aanwezig zijn in een oplossing door gebruik te maken van sets kralen met lage en hoge dichtheid bedekt met respectievelijk vang- en detectieantistoffen. Als het antigeen in oplossing aanwezig is, zal het de twee sets kralen overbruggen en een nieuw kralencomplex genereren, dat tussen de rijen met antilichamen bedekte kralen zal zweven. Een verhoogde concentratie van het doelantigeen in oplossing zal een groter aantal kralencomplexen genereren in vergelijking met lagere concentraties antigeen, waardoor kwantitatieve metingen van het doelantigeen mogelijk zijn. Magnetische levitatie is voordelig voor andere methoden vanwege de verminderde monstervoorbereidingstijd en het gebrek aan afhankelijkheid van klassieke uitleesmethoden. Het gegenereerde beeld wordt eenvoudig vastgelegd en geanalyseerd met behulp van een standaardmicroscoop of mobiel apparaat, zoals een smartphone of een tablet.
Introduction
Magnetische levitatie is een techniek die is ontwikkeld om celtypen1,2,3,eiwitten4,5 en opioïden6 te scheiden, analyseren en identificeren, uitsluitend op basis van hun specifieke dichtheid en paramagnetische eigenschappen. Celdichtheid is een unieke, intrinsieke eigenschap van elk celtype die direct verband houdt met de stofwisseling en differentiatiestatus7,8,9,10,11,12,13,14. Het kwantificeren van subtiele en voorbijgaande veranderingen in celdichtheid tijdens steady state-omstandigheden en tijdens een verscheidenheid aan celprocessen, zou iemand een ongeëvenaard inzicht in celfysiologie en pathofysiologie kunnen bieden. Veranderingen in celdichtheid zijn geassocieerd met celdifferentiatie15,16,celcyclusprogressie9,17,18,19,apoptose20,21,22,23en kwaadaardige transformatie24,25,26 . Daarom kan kwantificering van specifieke veranderingen in celdichtheid worden gebruikt om onderscheid te maken tussen cellen van verschillende typen, en om onderscheid te maken tussen hetzelfde type cellen dat verschillende activeringsprocessen ondergaat. Dit maakt experimenten mogelijk die zich richten op een bepaalde celsubpopulatie, waarbij dynamische veranderingen in dichtheid dienen als een indicator van veranderd celmetabolisme27. Aangezien is vastgesteld dat een cel zijn dichtheid kan veranderen als reactie op een veranderende omgeving7, is het noodzakelijk om de kinetiek van de cel te meten in relatie tot zijn dichtheid om deze volledig te begrijpen, wat de huidige methoden mogelijk niet bieden12. Magnetische levitatie daarentegen zorgt voor een dynamische evaluatie van cellen en hun eigenschappen28.
Cellen zijn diamagnetisch, wat betekent dat ze geen permanent magnetisch dipoolmoment hebben. Bij blootstelling aan een extern magnetisch veld wordt echter een zwak magnetisch dipoolmoment gegenereerd in de cellen, in de tegenovergestelde richting van het toegepaste veld. Dus als cellen worden opgehangen in een paramagnetische oplossing en worden blootgesteld aan een sterk verticaal magnetisch veld, zullen ze weg zweven van de magnetische bron en stoppen tot een hoogte, die voornamelijk afhangt van hun individuele dichtheid. Diamagnetische levitatie van een object dat beperkt is tot het minimum van een inhomogeen magnetisch veld is mogelijk wanneer aan de volgende twee criteria is voldaan: 1) de magnetische gevoeligheid van het deeltje moet kleiner zijn dan die van het omringende medium, en 2) de magnetische kracht moet sterk genoeg zijn om tegenwicht te bieden aan de drijfkracht van het deeltje. Aan beide criteria kan worden voldaan door RBC's in een magnetische buffer op te hangen en door sterke magnetische veldgradiënten te creëren met kleine, goedkope, in de handel verkrijgbare permanente magneten1. De evenwichtspositie van een magnetisch gevangen deeltje op een as langs de zwaartekrachtrichting wordt bepaald door zijn dichtheid (ten opzichte van de dichtheid van de buffer), zijn magnetische gevoeligheid (ten opzichte van de magnetische gevoeligheid van de buffer) en de signatuur van het toegepaste magnetische veld. Omdat de dichtheid en de magnetische eigenschappen van de oplossing constant zijn in het hele systeem, zullen de intrinsieke dichtheidseigenschappen van de cellen de belangrijkste factor zijn die de levitatiehoogte van de cellen bepaalt, waarbij dichtere cellen lager zweven in vergelijking met minder dichte cellen. Deze benadering maakt gebruik van een set van twee dichtheidsreferentieparels (1,05 en 1,2 g / ml) waarmee we nauwkeurige, ratiometrische analyse kunnen gebruiken voor dichtheidsmetingen. Door de concentratie van de magnetische oplossing te veranderen, kan men verschillende cellulaire populaties, zoals RBC's, isoleren van WBC's, omdat de dichtheid van circulerende cellen celspecifiek is, waardoor isolatieprotocollen of andere celmanipulatie niet meer nodig zijn.
De meeste detectiemethoden die in biologisch onderzoek worden gebruikt, zijn gebaseerd op extrapolatie van specifieke bindingsgebeurtenissen in gemakkelijk te kwantificeren lineaire signalen. Deze uitleesmethoden zijn vaak complex en omvatten gespecialiseerde apparatuur en toegewijd wetenschappelijk personeel. Een benadering gericht op de detectie van antigenen gevonden op het plasmamembraan van cellen of extracellulaire blaasjes of die oplosbaar zijn in plasma, met behulp van een of twee antilichaam gecoate kralen, wordt hierin beschreven. De kralen moeten van verschillende dichtheden zijn en van die van de ondervraagde doelwitten. De aanwezigheid van het doelantigeen in een bepaald biofluïde wordt vertaald in een specifieke, meetbare verandering in de levitatiehoogte van een antigeenpositieve cel die gebonden is aan een detectiekraal. In het geval van oplosbare antigenen of extracellulaire blaasjes zijn ze gebonden aan zowel vangst- als detectieparels, waardoor een kraal-kraalcomplex wordt gevormd in plaats van een kralencelcomplex. De verandering in levitatiehoogte hangt af van de nieuwe dichtheid van de kraalcel- of kraal-kraalcomplexen. Naast de verandering in de levitatiehoogte van de complexen, die de aanwezigheid van antigeen in de biofluïde aangeeft, is het aantal complexen ook afhankelijk van de hoeveelheid doel, waardoor magnetische levitatie ook een kwantitatieve benadering is voor antigeendetectie24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol dat in deze studie werd gebruikt, werd goedgekeurd door de Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Instrument instellen
OPMERKING: Voor het afbeelden van zwevende cellen moeten twee zeldzame aard neodymiummagneten die op de z-as zijn gemagnetiseerd, worden geplaatst met dezelfde pool naar elkaar toe om een magnetisch veld te genereren. De afstand tussen de magneten kan worden aangepast afhankelijk van de intensiteit van het magnetisch veld en de dichtheid van de doelen. In dit geval worden de magneten gescheiden door een ruimte van 1 mm die voldoende is voor het inbrengen van een 50 mm lange 1x1 mm vierkante glazen capillaire buis. Het apparaat werd 3D-geprint met behulp van een AutoCAD-ontwerp, dat op aanvraag beschikbaar is.
- Leg microscoop op zijn kant, perfect horizontaal.
OPMERKING: Een microscoop die in een standaard rechtopstaande positie wordt geplaatst, is niet direct geschikt voor het afbeelden van zwevende objecten vanwege de posities van de magneten ten opzichte van condensor en objectief. Deze beperking kan worden omzeild door de microscoop op zijn kant te leggen, perfect horizontaal waardoor de condensor het licht in het capillair kan richten, en de objectieflens om de cel die tussen de magneten zweeft in beeld te brengen, met behoud van köhler-verlichtingsvereisten. - Ondersteun en egaleer de standaard op een breadboardtafel met behulp van 2 of 3 lab jacks.
- Om trillingen te beperken, ondersteunt u de breadboardtafel met rubberen dempende voetjes.
- Verwijder het podium en vervang het door een compacte laboratoriumaansluiting voor het aanpassen van de hoogte van het levitatieapparaat(y-as)en twee eenassige translationele fasen; een voor het aanpassen van de focus (z-as), en de tweede voor het scannen van de capillaire buis.
- Bevestig het magnetische levitatieapparaat aan de labaansluiting met behulp van twee optische palen uit de miniserie.
2. Binding van antilichaam aan carboxy-microdeeltjes / kralen (gewijzigd van een protocol door PolyAn)
OPMERKING: Alleen kralen met een lage dichtheid (1,05 g/ml) moeten worden gecoat voor Rh(+)-detectie, maar zowel kralen met een hoge als lage dichtheid zijn gecoat voor de detectie van extracellulaire blaasjes.
- Neem 1 mg equivalent van de kralensuspensie en voeg toe aan 0,5 ml activeringsbuffer (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg in 1 ml)) pH 5,0 en 0,001% polysorbaat-20).
- Voeg 12 μL vers gemaakte 1,5 M EDC (MW 191,7, 0,28755 g in 1 ml) en 12 μL 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g in 1 ml) toe aan ijskoud water.
- Plaats buizen op een orbitale shaker en schud krachtig gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de carboxylgroepen op kralen te activeren.
- Stop de activering na 1 uur door 0,5 ml koppelingsbuffer (10x PBS, of 0,1 M fosfaat pH 7-9) toe te voegen.
- Pellet de kralen door centrifugeer 10 minuten lang op 20.000 x g of gebruik, als de kralen niet kunnen worden gepelleteerd, een centrifugebuisfilter van 0,45 μm. Aspirateer het supernatant of doorstroom.
- Was de kralen met 1 ml 10x PBS 3 keer zoals in stap 2.5.
- Bereken 25 μg antilichaam per mg kralen en meng het gewenste antilichaam met geactiveerde kralen tot een uiteindelijke antilichaamconcentratie van 0,7-1,0 mg / ml in 10X PBS.
- Plaats buizen op een buisknop die op een lage snelheid is ingesteld. Rol buizen 's nachts voorzichtig op kamertemperatuur voor koppeling.
- Herhaal stap 2.5 en was de kralen twee keer met 1 ml 10x PBS.
- Wassen met 0,5 ml 1 M ethanolamine (98% bouillon = 16,2 M) in buffer pH 8,0 met 0,02% polysorbaat-20 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur terwijl u voorzichtig schudt.
- Herhaal stap 2.5 en was de kralen eenmaal in 1 ml DPBS. De kralen kunnen worden bewaard in 200 μL DPBS bij 4 °C totdat ze nodig zijn.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
3. Inzameling en bereiding van bloed voor Rh(+) detectie
- Prik met één klik in de vinger van een Rh(+)-donor en verzamel 10 μL bloed in 1 ml DPBS.
- Kleur de Rh+ cellen met een fluorescerende plasmamembraanvlek. Voeg eventueel 1 μL fluorescerende kleurstof toe aan de 1 ml suspensie van Rh+ cellen (1:1000 verdunning).
- Incubeer de cellen met de fluorescerende kleurstof bij 37 °C gedurende 15 minuten.
- Pellet de cellen door 15 s met 5.600 x g te draaien en was 3 keer met 1 ml DPBS. Resuspend in 1 ml HBSS met calcium en magnesium (HBSS++).
- Prik met behulp van het prikapparaat met één klik in de vinger van een Rh(-)-donor en verzamel 2 μL bloed.
OPMERKING: Als u meer dan 2 aandoeningen voorbereidt, verzamel dan voldoende bloed om 1 μL Rh(-) bloed aan elke buis toe te voegen. - Bereid de nodige experimentele buizen voor: alleen kralen, IgG-controle, monster.
- Alleen kralen: voeg 174 μL HBSS++, 1 μL IgG-controleparels, 1 μL kralen met hoge dichtheid (1,2 g/ml) en 24 μL 500 mM Gd3+ (60 mM) toe.
- IgG-controle: voeg 172 μL HBSS++, 1 μL IgG-controleparels, 1 μL kralen met hoge dichtheid, 1 μL Rh-bloed, 1 μL gekleurde Rh+ bloedsuspensie en 24 μL 500 mM Gd3+toe.
- Monsterbuis voeg 172 μL HBSS++, 1 μL anti-RhD gecoate kralen, 1 μL kralen met hoge dichtheid, 1 μL Rh-bloed, 1 μL gekleurde Rh(+) bloedsuspensie en 24 μL 500 mM Gd3+toe.
OPMERKING: Kralen met een hoge dichtheid worden ter referentie toegevoegd aan Rh-monsters.
4. Isolatie van PMN's voor demonstratie van celscheiding
- Isolatie van neutrofielen
- Trek 40 ml veneus bloed in een spuit van 60 ml met 6 ml natriumcitraat/citroenzuur (0,15 M, pH 5,5) en 14 ml 6% Dextran-70.
- Wacht 50 minuten tot het bloed bezinkt.
- Leg langzaam de buffy coat-cellen bovenop 20 ml Ficoll-Paque door de bovenste 18 ml door de bloedafnameslang in een buis van 50 ml te duwen, waardoor besmetting met gesedimenteerde RBC's wordt voorkomen. Het wordt aanbevolen om een verse bloedafnameset te gebruiken om de besmetting met resterende RBC's die overblijven in de oorspronkelijke bloedafnamebuis te minimaliseren.
- Pellet de buffy coat cellen door centrifugeren gedurende 20 min op 3.000 x g. Neutrofielen en verontreinigende RBC's zullen op de bodem van de buis pelleteren. PBMC vormt een witte laag bovenop Ficoll-Paque.
- Breng de neutrofielen over naar een nieuwe buis van 50 ml.
- Lyse eventuele resterende RBC's door de neutrofielen gedurende 25 seconden te incuberen met 20 ml 0,2% koude NaCl-oplossing, gevolgd door een extra 20 ml van 1,6% NaCl. De uiteindelijke concertatie van NaCl moet 0,9% (isotoon) zijn.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 3.000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspend de neutrofielen tot de gewenste concentratie.
-
Isolatie van lymfocyten
- Verguld de PBMC's in RPMI met 5% warmte-geïnactiveerd serum in 6-well kweekplaten.
- Incubeer de platen gedurende 1 uur bij 37 °C. Monocyten zullen zich aan de plaat hechten, lymfocyten zullen vrij zweven.
- Verwijder de buffer met de lymfocyten en was deze tweemaal met RPMI.
- Resuspend de lymfocyten in de gewenste concentratie.
-
Label RBC's, PMN en lymfocyten.
- Label elk celtype met een andere fluorescerende kleurstof. Zorg ervoor dat elke kleurstof in een ander kanaal fluoresceert. Volg de instructies van de fabrikant voor elk van de gekozen kleurstoffen.
5. Generatie van RBC extracellulaire blaasjes via de complementactivering
- Verkrijg volbloed door venapunctuur met behulp van EDTA-buizen.
- Voer bloed door een witte bloedcelfilter en centrifugeer vervolgens 3 keer bij 500 x g gedurende 10 minuten elk om rode bloedcellen te isoleren. Gebruik HBSS++ als wasbuffer.
- Maak aliquots van 100 μL verpakte RBC's in buizen van 1,5 ml en maak het volume op 1 ml door HBSS ++ toe te voegen.
- Voeg C5b,6 toe aan een eindconcentratie van 0,18 μg/ml in HBSS++ en draaitex.
- Zet een slow shaker op kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg C7-eiwit toe aan een eindconcentratie van 0,2 μg/ml. Meng door de buis een paar keer voorzichtig om te keren. Draai vanaf dit punt niet vooruit.
- Plaats de buis op een buizenschudder die op een lage snelheid is ingesteld gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg C8-eiwit toe aan een eindconcentratie van 0,2 μg/ml en C9-eiwit aan 0,45 μg/ml. Meng door de buizen een paar keer voorzichtig om te keren.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 10.000 x g.
- Verzamel het EV-bevattende supernatant in een nieuwe buis(en). Tremoveer het supernatant niet te dicht bij de celkorrel.
6. Cellen analyseren op het magnetische levitatieapparaat
- Voer het opstarten van het instrument uit volgens de instructies van de fabrikant.
- Laad 50 μL monster in een capillaire buis totdat de buis is gevuld. Sluit de uiteinden van de capillaire buis af met capillaire kit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Laad de capillaire buis in de houder tussen de boven- en ondermagneten. Pas het podium en de focus aan voor een optimale weergave.
OPMERKING: Cellen / kralen kunnen overal van 5-20 minuten nodig hebben om hun magnetische evenwichtspositie te bereiken op basis van hun dichtheid en de concentratie van Gd3 +. Hoe hoger de concentratie van Gd3+,hoe korter de tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetische levitatie richt objecten van verschillende dichtheden op verschillende levitatiehoogten, afhankelijk van de dichtheid van het object, de magnetische signatuur, de concentratie van paramagnetische oplossing en de sterkte van het magnetisch veld gecreëerd door twee sterke, zeldzame aardmagneten. Omdat de twee magneten op elkaar zijn geplaatst, kunnen zwevende monsters alleen worden bekeken, met behoud van Köhler-verlichting, met behulp van een microscoop die op zijn kant isgedraaid (figuur 1). De uiteindelijke levitatiehoogte die door elk celtype wordt bereikt, kan eenvoudig worden gewijzigd door de concentratie van de paramagnetische oplossing te wijzigen. Figuur 2 illustreert de scheiding van de verschillende circulerende bloedcellen aan de hand van verschillende concentraties gadolinium. De twee kralensoorten met verschillende dichtheden (1,05 en 1,2 g/ml) werden gebruikt om dichtheidshoogten en groottereferenties te bieden. Aangezien de levitatiehoogte van een bepaald celtype afhankelijk is van de intrinsieke dichtheid, biedt magnetische levitatie een direct middel om interessante cellen te isoleren zonder significante manipulatie24. Het belangrijkste doel van dit protocol was om het vermogen van magnetische levitatie aan te tonen om de aanwezigheid van membraangebonden antigenen, in dit geval de Rh-factor, op circulerende rode bloedcellen te detecteren. Voor dit experiment werden kralen met een lage dichtheid gecoat met IgG-controleantilichaam of anti-RhD. Monsters werden vervolgens bereid door bloed van een Rh(-)-donor te spieken met bloed van een Rh(+) in een verhouding van 1:1000. Anti-RhD(+) gecoate kralen of de controle IgG gecoate kralen werden toegevoegd aan het bloedmonster en geïncubeerd gedurende 10 minuten. Figuur 3A toont het IgG-controlemonster, dat geen kraalrode bloedcelcomplexen gereereerde. Vervolgens werd de identiteit van de rode bloedcellen gevangen door de Rh(+)-positieve kralen geverifieerd door de Rh(+)-cellen vooraf te kleuren met een fluorescerende plasmamembraanvlek en vervolgens in beeld gebracht met behulp van fluorescentiemicroscopie (Figuur 3B). Een positieve detectiegebeurtenis wordt weergegeven in figuur 3C. De binding van de anti-Rh-kraal aan de Rh(+) cellen creëert een kraalcelcomplex met een dichtheid tussen die van de kralen en de cel, waardoor het zweeft op een hoogte tussen de ongebonden vangparels en negatieve RBC's. Een close-up van de kraalcelcomplexen werd afgebeeld onder fluorescerend licht om de aanwezigheid van de Rh(+)-cellen te bevestigen die zijn gelabeld met een fluorescerende plasmamembraanvlek. (Figuur 3D). Figuur 3E toont kraal-kralencomplexen die zich vormen tussen kralen met hoge en lage dichtheid bedekt met antilichamen voor CR1 en CD47, die wijzen op de aanwezigheid van extracellulaire blaasjes. Een schema van het kraalcelcomplex is weergegeven in figuur 3F.
Figuur 1. Principes van magnetische levitatie: (A) Schema's van magnetisch veld. (B)Een microscoop van onderzoekskwaliteit die op zijn kant kantelde om de doelen die in de capillaire buis zweven zijdelings in beeld te brengen. C)Schuine weergave van het magnetische levitatieapparaat onder het microscoopobjectief. (D) Magnetische levitatieapparatuur frontaal zicht. (E) Schema's van het magnetische levitatieapparaat met een capillaire buis gemonteerd tussen twee magneten, voor- en zijaanzicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Demonstratie van celspecifiek dichtheidsevenwicht: (A) Kralen met lage en hoge dichtheid (1,05 en 1,2 g / ml) alleen bij 60 mM Gd3+ (bekeken op een 10x-objectief). (B)PMN's zweven boven rode bloedcellen bij 21 mM Gd3+,met onscherp zichtbare bloedplaatjes die circuleren (bekeken op een 10x objectief). (C)Volbloed zwevend op 60 mM Gd3+,een concentratie die zich richt op RBC's (bekeken op een 10x objectief). (D) Dit cijfer is gewijzigd van [Tasoglu, S. et al. Levitationale beeldcytometrie met temporele resolutie. Geavanceerde materialen. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Dichtheidsscheiding van RBC's (rood), PMN's (groen) en lymfocyten (blauw) bij 40 mM Gd3+. Elke celpopulatie zweefde op een hoogte op basis van hun intrinsieke dichtheden (bekeken op een 10x objectief). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Detectie van Rh-factor in een bloedmonster: (A) Rh (-) bloed geprikt met Rh (+) bloed en IgG-controleparels. Er worden geen kraalcelcomplexen gevormd (bekeken op een 10x objectief). (B) IgG-controlemonster onder fluorescerend licht dat de Rh(+)-cellen markeert (bekeken op een 10x objectief). (C)Rh(-) bloed geprikt met Rh(+) bloed en anti-RhD gecoate kralen, die de vorming van kraalcelcomplexen laten zien (bekeken op een 10x objectief). (D) Een close-up van een kralencelcomplex onder fluorescerend licht (bekeken op een objectief van 10x). (E) Anti-CR1 en anti-CD47 gecoate kralen vormen complexen, wat wijst op de aanwezigheid van RBC afgeleide extracellulaire blaasjes (gezien op een 10x objectief). (F) Diagram met het kralencelcomplex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gradiëntcentrifugatie is momenteel de standaardtechniek voor het isoleren van subcellulaire componenten op basis van hun unieke dichtheden. Deze aanpak vereist echter het gebruik van gespecialiseerde gradiëntmedia en centrifuge-apparatuur. De magnetische levitatiebenadering die hier wordt gepresenteerd, maakt gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de morfologische en functionele eigenschappen van circulerende cellen, met minimale, indien enige manipulatie van de cellen, waardoor een bijna in vivo toegang tot circulerende cellen wordt geboden.
Bij het gebruik van magnetische levitatie zijn echter verschillende punten het vermelden waard. Ten eerste moet de microscoop die wordt gebruikt voor beeldvorming worden gewijd aan deze methode, omdat de opstelling tijdrovend is en vereist dat de microscoop gedeeltelijk wordt gedemonteerd, perfect horizontaal gepositioneerd met de optica precies uitgelijnd met de magneten en de capillaire buis. Ten tweede vereisen de laboratoriumaansluiting en de translationele fasen die worden gebruikt om de bewegingen van het capillaire glas en de focus aan te passen, exacte positionering en vrije beweging op elk van de drie assen. Waarschijnlijk de meest kritieke uitlijning van de hele opstelling, is het monteren van het magnetische levitatie-apparaat in de translationele fasen, zodat de bovenste en onderste magneten perfect zijn uitgelijnd met de zwaartekrachtvector en perfect horizontaal zijn. Elke afwijking van deze vereisten zou een hoek creëren tussen de magnetische kracht en de zwaartekracht die de cellen naar beide zijden van de capillaire buis zou duwen, waardoor het levitatieproces zou worden verstoord en de resultaten onbetrouwbaar zouden worden.
De optimale concentratie van de gadoliniumoplossing die wordt gebruikt voor zwevende cellen moet worden aangepast aan het celtype en het doel van het experiment. Veranderingen in de concentratie van de gadoliniumoplossing zullen de levitatiehoogte van de geanalyseerde cellen aanzienlijk veranderen en moeten daarom constant worden gehouden van de ene reeks experimenten naar de andere. Als de concentratie te laag is, afhankelijk van de dichtheid van de doelcellen, zweven ze mogelijk helemaal niet, terwijl als deze te hoog is, het bereik van detecteerbare veranderingen wordt beperkt dat nauwkeurig kan worden gekwantificeerd.
Zwevende structuren zullen stabiele banden creëren als de enige krachten die erop inwerken zwaartekracht en magnetische afstoting zijn. De aanwezigheid van zelfs een millimetergrote bel in de capillaire buis zal kleine cirkelvormige stromen creëren op het lucht-vloeistofinterface, die de zwevende cellen zullen verstoren, waardoor elke analyse vrijwel onmogelijk wordt. Bij het laden van een monster in een capillaire buis, en vervolgens na het afdichten, moet men ervoor zorgen dat er geen lucht aanwezig is, door het capillair te onderzoeken onder een stereomicroscoop of een laag vermogen (4x) objectief.
Levitatie van cellen op een bepaalde hoogte hangt af van het feit of hun magnetische signatuur in de loop van de tijd hetzelfde blijft. Als de paramagnetische gadoliniumionen uit de levitatiemedia de cellen binnenkomen, hetzij door pinocytose of verhoogde membraanpermeabiliteit, zoals tijdens apoptose, zal de verhoogde celdichtheid gemeten op basis van de dichtheidsreferentieparels onjuist zijn. Gelukkig hebben de meeste circulerende cellen slechte pinocytische mogelijkheden26, waardoor deze methode een geschikte aanpak is voor het bestuderen van cellen gedurende lange perioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Getulio Pereira bedanken voor zijn hulp bij extracellulair blaasjeswerk.
Dit werk werd ondersteund door de volgende National Institute of Health-subsidies aan ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 en UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al.
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M.
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al.
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
