Summary
Diese Arbeit beschreibt eine auf Magnetschwebenutzung basierende Methode, die spezifisch das Vorhandensein von Antigenen, entweder löslich oder membrangebunden, nachweisen kann, indem Änderungen der Levitationshöhe von Auffangperlen mit festen Dichten quantifiziert werden.
Abstract
Die beschriebene Methode wurde basierend auf den Prinzipien der Magnetschwebebahn entwickelt, die Zellen und Partikel anhand ihrer Dichte und magnetischen Eigenschaften trennt. Dichte ist eine Zelltyp-identifizierende Eigenschaft, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate, Differenzierung und seinem Aktivierungsstatus steht. Die Magnetschwebebahn ermöglicht einen einstufigen Ansatz zur erfolgreichen Trennung, Abbildung und Charakterisierung zirkulierender Blutzellen sowie zur Erkennung von Anämie, Sichelzellenanämie und zirkulierenden Tumorzellen basierend auf Dichte und magnetischen Eigenschaften. Dieser Ansatz ist auch für den Nachweis löslicher Antigene in einer Lösung geeignet, indem Sätze von Perlen niedriger und hoher Dichte verwendet werden, die mit Einfang- bzw. Nachweisantikörpern beschichtet sind. Wenn das Antigen in Lösung vorhanden ist, überbrückt es die beiden Sätze von Perlen und erzeugt einen neuen Perlen-Perlen-Komplex, der zwischen den Reihen der antikörperbeschichteten Perlen schwebt. Eine erhöhte Konzentration des Zielantigens in Lösung erzeugt im Vergleich zu niedrigeren Antigenkonzentrationen eine größere Anzahl von Perlen-Perlen-Komplexen, wodurch quantitative Messungen des Zielantigens ermöglicht werden. Die Magnetschwebebahn ist für andere Methoden aufgrund ihrer verkürzten Probenvorbereitungszeit und der fehlenden Abhängigkeit von klassischen Auslesemethoden vorteilhaft. Das erzeugte Bild kann einfach mit einem Standardmikroskop oder einem mobilen Gerät wie einem Smartphone oder einem Tablet erfasst und analysiert werden.
Introduction
Die Magnetschwebebahn ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Zelltypen1,2,3,Proteine4,5 und Opioide6 ausschließlich auf der Grundlage ihrer spezifischen Dichte und paramagnetischen Eigenschaften zu trennen, zu analysieren und zu identifizieren. Die Zelldichte ist eine einzigartige, intrinsische Eigenschaft jedes Zelltyps, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate und seinem Differenzierungsstatus steht7,8,9,10,11,12,13,14. Die Quantifizierung subtiler und vorübergehender Veränderungen der Zelldichte unter stationären Bedingungen und während einer Vielzahl von Zellprozessen könnte einen unübertroffenen Einblick in die Zellphysiologie und Pathophysiologie ermöglichen. Veränderungen der Zelldichte sind mit der Zelldifferenzierung15,16, der Zellzyklusprogression9,17,18,19, apoptose20,21,22,23und der malignen Transformation24,25,26 verbunden . Daher kann die Quantifizierung spezifischer Änderungen der Zelldichte verwendet werden, um zwischen Zellen verschiedener Typen zu unterscheiden und zwischen demselben Zelltyp zu unterscheiden, der verschiedenen Aktivierungsprozessen unterzogen wird. Dies ermöglicht Experimente, die auf eine bestimmte Zellteilpopulation abzielen, wobei dynamische Dichteänderungen als Indikator für einen veränderten Zellstoffwechsel dienen27. Da festgestellt wurde, dass eine Zelle ihre Dichte als Reaktion auf eine sich ändernde Umgebung ändern kann7, ist es unerlässlich, die Kinetik der Zelle in Bezug auf ihre Dichte zu messen, um sie vollständig zu verstehen, was aktuelle Methoden möglicherweise nicht liefern12. Die Magnetschwebebahn hingegen ermöglicht eine dynamische Bewertung von Zellen und ihren Eigenschaften28.
Zellen sind diamagnetisch, was bedeutet, dass sie kein permanentes magnetisches Dipolmoment haben. Wenn es jedoch einem externen Magnetfeld ausgesetzt wird, wird in den Zellen ein schwaches magnetisches Dipolmoment in der entgegengesetzten Richtung des angelegten Feldes erzeugt. Wenn Zellen also in einer paramagnetischen Lösung suspendiert und einem starken vertikalen Magnetfeld ausgesetzt werden, schweben sie von der Magnetquelle weg und stoppen bis zu einer Höhe, die in erster Linie von ihrer individuellen Dichte abhängt. Die diamagnetische Levitation eines Objekts, das auf das Minimum eines inhomogenen Magnetfeldes beschränkt ist, ist möglich, wenn die beiden folgenden Kriterien erfüllt sind: 1) Die magnetische Anfälligkeit des Partikels muss kleiner sein als die des umgebenden Mediums und 2) die Magnetkraft muss stark genug sein, um die Auftriebskraft des Partikels auszugleichen. Beide Kriterien können erfüllt werden, indem Erythrozyten in einem magnetischen Puffer aufgehängt und starke Magnetfeldgradienten mit kleinen, kostengünstigen, handelsüblichen Permanentmagneten erzeugt werden1. Die Gleichgewichtsposition eines magnetisch gefangenen Teilchens auf einer Achse entlang der Gravitationsrichtung wird durch seine Dichte (relativ zur Dichte des Puffers), seine magnetische Anfälligkeit (relativ zur magnetischen Empfindlichkeit des Puffers) und die Signatur des angelegten Magnetfeldes bestimmt. Da die Dichte und die magnetischen Eigenschaften der Lösung im gesamten System konstant sind, sind die intrinsischen Dichteeigenschaften der Zellen der Hauptfaktor, der die Levitationshöhe der Zellen bestimmt, wobei dichtere Zellen im Vergleich zu weniger dichten Zellen niedriger schweben. Dieser Ansatz verwendet einen Satz von zwei Dichtereferenzperlen (1,05 und 1,2 g/ ml), die es uns ermöglichen, eine präzise, ratiometrische Analyse für Dichtemessungen zu verwenden. Die Änderung der Konzentration der magnetischen Lösung ermöglicht es, verschiedene Zelluläre Populationen wie Erythrozyten von WBCs zu isolieren, da die Dichte der zirkulierenden Zellen zellspezifisch ist, wodurch isolationsprotokolle oder andere Zellmanipulationen entfallen.
Die Mehrzahl der in der biologischen Forschung verwendeten Nachweismethoden beruht auf der Extrapolation spezifischer Bindungsereignisse in leicht zu quantifizierende lineare Signale. Diese Auslesemethoden sind oft komplex und erfordern spezielle Geräte und engagiertes wissenschaftliches Personal. Ein Ansatz, der auf den Nachweis von Antigenen abzielt, die entweder auf der Plasmamembran von Zellen oder extrazellulären Vesikeln gefunden werden oder die im Plasma löslich sind, wobei entweder eine oder zwei Antikörperbeschichtete Kügelchen verwendet werden, wird hierin beschrieben. Die Perlen müssen von unterschiedlicher Dichte sein als die voneinander und von denen der befragten Ziele. Das Vorhandensein des Zielantigens in einem bestimmten Biofluid wird in eine spezifische, messbare Änderung der Levitationshöhe einer Antigen-positiven Zelle übersetzt, die an eine Nachweisperle gebunden ist. Im Falle von löslichen Antigenen oder extrazellulären Vesikeln sind sie sowohl an Einfang- als auch an Nachweisperlen gebunden und bilden eher einen Perlen-Perlen-Komplex als einen Perlen-Zell-Komplex. Die Änderung der Levitationshöhe hängt von der neuen Dichte der Perlenzell- oder Perlen-Perlen-Komplexe ab. Neben der Änderung der Levitationshöhe der Komplexe, die auf das Vorhandensein von Antigen im Biofluid hinweist, hängt die Anzahl der Komplexe auch von der Menge des Ziels ab, was die Magnetschwebebahn auch zu einem quantitativen Ansatz für den Antigennachweis macht24.
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Protocol
Das in dieser Studie verwendete experimentelle Protokoll wurde vom Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB) genehmigt.
1. Geräteeinrichtung
HINWEIS: Für die Abbildung schwebender Zellen müssen zwei seltenere Neodym-Magnete, die auf der z-Achse magnetisiert sind, mit demselben Pol zueinander platziert werden, um ein Magnetfeld zu erzeugen. Der Abstand zwischen den Magneten kann in Abhängigkeit von der Intensität des Magnetfeldes und der Dichte der Ziele angepasst werden. In diesem Fall sind die Magnete durch einen 1mm Raum getrennt, der für das Einsetzen eines 50 mm langen 1x1 mm quadratischen Glaskapillarrohrs ausreicht. Das Gerät wurde mit einem AutoCAD-Design, das auf Anfrage erhältlich ist, in 3D gedruckt.
- Legen Sie das Mikroskop auf die Seite, perfekt horizontal.
HINWEIS: Ein Mikroskop, das in einer standardmäßigen aufrechten Position platziert ist, ist aufgrund der Positionen der Magnete in Bezug auf Kondensator und Objektiv nicht direkt für die Abbildung schwebender Objekte geeignet. Diese Einschränkung kann umgangen werden, indem das Mikroskop auf die Seite gelegt wird, perfekt horizontal, so dass der Kondensator das Licht in die Kapillare fokussieren kann und die Objektivlinse die zwischen den Magneten schwebende Zelle unter Beibehaltung der Köhler-Beleuchtungsanforderungen abbildet. - Unterstützen und nivellieren Sie den Ständer auf einem Steckbretttisch mit 2 oder 3 Laborbuchsen.
- Um Vibrationen zu begrenzen, stützen Sie den Steckbretttisch mit gummidämpfenden Füßen.
- Entfernen Sie die Stufe und ersetzen Sie sie durch eine kompakte Laborbuchse zum Einstellen der Höhe der Levitationsvorrichtung(y-Achse)und zwei einachsige Translationstische. eine zum Einstellen des Fokus (z-Achse) und die zweite zum Scannen des Kapillarrohrs.
- Befestigen Sie das Magnetschwebegerät mit zwei optischen Pfosten der Miniserie an der Laborbuchse.
2. Bindung von Antikörpern an Carboxy-Mikropartikel/Kügelchen (Modifiziert aus einem Protokoll von PolyAn)
HINWEIS: Für den Rh(+)-Nachweis müssen nur Perlen niedriger Dichte (1,05 g/ml) beschichtet werden, aber sowohl Perlen mit hoher als auch niedriger Dichte sind für den Nachweis extrazellulärer Vesikel beschichtet.
- Nehmen Sie 1 mg Äquivalent Perlensuspension heraus und geben Sie es in 0,5 ml Aktivierungspuffer (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg in 1 ml)) pH 5,0 und 0,001% Polysorbat-20).
- Fügen Sie 12 μL frisch hergestellte 1,5 M EDC (MW 191,7, 0,28755 g in 1 mL) und 12 μL 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g in 1 mL) in eiskaltes Wasser hinzu.
- Legen Sie die Röhren auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie 1 h bei Raumtemperatur kräftig, um die Carboxylgruppen auf den Kügelchen zu aktivieren.
- Stoppen Sie die Aktivierung nach 1 h durch Zugabe von 0,5 ml Kopplungspuffer (10x PBS oder 0,1 M Phosphat pH 7-9).
- Pelletieren Sie die Perlen durch Zentrifugieren bei 20.000 x g für 10 min oder, wenn die Perlen nicht pelletiert werden können, verwenden Sie einen 0,45 μm Zentrifugenrohrfilter. Aspirieren Sie den Überstand oder den Durchfluss.
- Waschen Sie die Perlen mit 1 ml 10x PBS 3 mal wie in Schritt 2.5.
- Berechnen Sie 25 μg Antikörper pro mg Kügelchen und mischen Sie den gewünschten Antikörper mit aktivierten Kügelchen zu einer endgültigen Antikörperkonzentration von 0,7-1,0 mg/ml in 10x PBS.
- Legen Sie die Rohre auf eine Rohrwippe, die auf eine niedrige Geschwindigkeit eingestellt ist. Rohre sanft bei Raumtemperatur über Nacht zum Kuppeln rollen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 und waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml 10x PBS.
- Waschen Sie mit 0,5 mL 1 M Ethanolamin (98% Schaft = 16,2 M) in Puffer pH 8,0 mit 0,02% Polysorbat-20 für 1 h bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 und waschen Sie die Perlen einmal in 1 ml DPBS. Die Perlen können in 200 μL DPBS bei 4 °C gelagert werden, bis sie benötigt werden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Gewinnung und Aufbereitung von Blut für den Rh(+)-Nachweis
- Stechen Sie mit einem Ein-Klick-Stechgerät in den Finger eines Rh(+)-Spenders und sammeln Sie 10 μL Blut in 1 ml DPBS.
- Färben Sie die Rh+-Zellen mit einer fluoreszierenden Plasmamembranfärbung. Gegebenenfalls 1 μL Fluoreszenzfarbstoff in die 1 mL Suspension von Rh+ Zellen geben (1:1000 Verdünnung).
- Inkubieren Sie die Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff bei 37 °C für 15 min.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Drehen bei 5.600 x g für 15 s und waschen Sie 3 mal mit 1 ml DPBS. Resuspend in 1 ml HBSS mit Calcium und Magnesium (HBSS++).
- Stechen Sie mit dem Ein-Klick-Stechgerät in den Finger eines Rh(-)Spenders und sammeln Sie 2 μL Blut.
HINWEIS: Wenn Sie mehr als 2 Bedingungen vorbereiten, sammeln Sie genug Blut, um 1 μL Rh (-) Blut zu jedem Röhrchen hinzuzufügen. - Bereiten Sie die notwendigen Versuchsröhrchen vor: Perlen allein, IgG-Kontrolle, Probe.
- Perlen allein: Fügen Sie 174 μL HBSS++, 1 μL IgG-Kontrollperlen, 1 μL Perlen hoher Dichte (1,2 g/ml) und 24 μL 500 mM Gd3+ (60 mM) hinzu.
- IgG-Kontrolle: Fügen Sie 172 μL HBSS++, 1 μL IgG-Kontrollperlen, 1 μL High-Density-Perlen, 1 μL Rh-Blut, 1 μL gefärbte Rh+ Blutsuspension und 24 μL 500 mM Gd3+hinzu.
- Probenröhrchen fügen 172 μL HBSS++, 1 μL Anti-RhD-beschichtete Perlen, 1 μL Hochdichteperlen, 1 μL Rh-Blut, 1 μL gefärbte Rh(+)-Blutsuspension und 24 μL 500 mM Gd3+hinzu.
HINWEIS: Perlen mit hoher Dichte werden zu Rh-Proben als Referenz hinzugefügt.
4. Isolierung von PMNs zur Demonstration der Zelltrennung
- Isolierung von Neutrophilen
- Ziehen Sie 40 ml venöses Blut in eine 60 ml Spritze, die 6 ml Natriumcitrat/Zitronensäure (0,15 m, pH 5,5) und 14 ml 6% Dextran-70 enthält.
- Warten Sie 50 Minuten, bis sich das Blut sedimentiert hat.
- Schichten Sie die Buffy-Coat-Zellen langsam auf 20 ml Ficoll-Paque, indem Sie die oberen 18 ml durch den Blutentnahmeschlauch in ein 50-ml-Röhrchen schieben, um eine Kontamination mit sedimentierten Erythrozyten zu vermeiden. Es wird empfohlen, ein Frische-Blutentnahme-Set zu verwenden, um die Kontamination mit verbleibenden Erythrozyten, die im ursprünglichen Blutentnahmeröhrchen verbleiben, zu minimieren.
- Pelletieren Sie die Buffy-Mantelzellen durch Zentrifugation für 20 min bei 3.000 x g. Neutrophile und kontaminierende Erythrozyten werden am Boden des Röhrchens pelletiert. PBMC bildet eine weiße Schicht auf Ficoll-Paque.
- Übertragen Sie die Neutrophilen in ein neues 50-ml-Röhrchen.
- Lysieren Sie alle verbleibenden Erythrozyten, indem Sie die Neutrophilen mit 20 ml 0,2% kalter NaCl-Lösung für 25 Sekunden inkubieren, gefolgt von weiteren 20 ml 1,6% NaCl. Die endgültige Konzertierung von NaCl sollte 0,9% betragen (isotonisch).
- Zentrifugieren Sie die Suspension für 10 min bei 3.000 x g.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspentieren Sie die Neutrophilen auf die gewünschte Konzentration.
-
Isolierung von Lymphozyten
- Platten Sie die PBMCs in RPMI mit 5% hitzeinaktiviertem Serum in 6-Well-Kulturplatten.
- Die Platten 1 h bei 37 °C inkubieren. Monozyten haften an der Platte, Lymphozyten schwimmen frei.
- Entfernen Sie den Puffer, der die Lymphozyten enthält, und waschen Sie ihn zweimal mit RPMI.
- Resuspendieren Sie die Lymphozyten in der gewünschten Konzentration.
-
Markieren Sie RBCs, PMN und Lymphozyten.
- Markieren Sie jeden Zelltyp mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff. Stellen Sie sicher, dass jeder Farbstoff in einem anderen Kanal fluoresziert. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für jeden der ausgewählten Farbstoffe.
5. Erzeugung von RBC Extrazellulären Vesikeln über die Komplementaktivierung
- Erhalten Sie Vollblut durch Venenpunktion mit EDTA-Röhrchen.
- Blut durch einen Weißen Blutkörperchenfilter leiten und dann 3 mal bei 500 x g für jeweils 10 min zentrifugieren, um rote Blutkörperchen zu isolieren. Verwenden Sie HBSS++ als Waschpuffer.
- Machen Sie Aliquots aus 100 μL verpackten Erythrozyten in 1,5 ml Röhrchen und machen Sie das Volumen durch Zugabe von HBSS++ auf 1 ml auf.
- C5b,6 zu einer Endkonzentration von 0,18 μg/ml in HBSS++ geben und dann wirbeln.
- 15 Min. lang einen langsamen Shaker bei Raumtemperatur aufsetzen.
- C7-Protein in eine Endkonzentration von 0,2 μg/ml geben. Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen einige Male vorsichtig umkehren. Wirbeln Sie ab diesem Punkt nicht mehr.
- Legen Sie das Rohr für 5 min bei Raumtemperatur auf einen mit niedriger Geschwindigkeit eingestellten Rohrschüttler.
- C8-Protein auf eine Endkonzentration von 0,2 μg/ml und C9-Protein auf 0,45 μg/ml geben. Mischen Sie, indem Sie die Röhrchen einige Male vorsichtig umkehren.
- Bei 37 °C für 30 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 x g für 10 min.
- Sammeln Sie den EV-haltigen Überstand in einer oder mehreren neuen Röhren. Zittern Sie den Überstand nicht zu nahe an das Zellpellet.
6. Zellen auf dem Magnetschwebegerät analysieren
- Führen Sie den Gerätestart gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
- Laden Sie 50 μL Probe in ein Kapillarrohr, bis das Röhrchen gefüllt ist. Versiegeln Sie die Enden des Kapillarrohrs mit Kapillardichtungsmittel, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
- Laden Sie das Kapillarrohr in den Halter zwischen den oberen und unteren Magneten. Passen Sie die Bühne und den Fokus für eine optimale Betrachtung an.
HINWEIS: Zellen/Kügelchen können 5-20 Minuten brauchen, um ihre magnetische Gleichgewichtsposition zu erreichen, basierend auf ihrer Dichte und der Konzentration von Gd3+. Je höher die Konzentration von Gd3+,desto kürzer die Zeit.
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Representative Results
Die Magnetschwebebahn fokussiert Objekte unterschiedlicher Dichte bei unterschiedlichen Levitationshöhen, abhängig von der Dichte des Objekts, seiner magnetischen Signatur, der Konzentration der paramagnetischen Lösung und der Stärke des Magnetfeldes, das von zwei starken Seltenerdmagneten erzeugt wird. Da die beiden Magnete übereinander angeordnet sind, können schwebende Proben unter Beibehaltung der Köhler-Beleuchtung nur mit einem zur Seite gedrehten Mikroskop betrachtet werden (Abbildung 1). Die endgültige Levitationshöhe, die von jedem Zelltyp erreicht wird, kann leicht durch Ändern der Konzentration der paramagnetischen Lösung geändert werden. Abbildung 2 veranschaulicht die Trennung der verschiedenen zirkulierenden Blutzellen unter Verwendung verschiedener Gadoliniumkonzentrationen. Die beiden Perlentypen mit unterschiedlichen Dichten (1,05 und 1,2 g/ml) wurden verwendet, um Dichteschwebehöhen und Größenreferenzen bereitzustellen. Da die Levitationshöhe eines bestimmten Zelltyps von seiner intrinsischen Dichte abhängt, bietet die Magnetschwebebahn ein direktes Mittel zur Isolierung von Zellen von Interesse ohne nennenswerte Manipulation24. Der Hauptzweck dieses Protokolls bestand darin, die Fähigkeit der Magnetschwebebahn nachzuweisen, das Vorhandensein von membrangebundenen Antigenen, in diesem Fall dem Rh-Faktor, auf zirkulierenden roten Blutkörperchen nachzuweisen. Für dieses Experiment wurden Perlen niedriger Dichte entweder mit IgG-Kontrollantikörper oder Anti-RhD beschichtet. Die Proben wurden dann durch Spiking von Blut von einem Rh(-)Spender mit Blut von einem Rh(+) im Verhältnis 1:1000 hergestellt. Anti-RhD(+)-beschichtete Kügelchen oder die Kontroll-IgG-beschichteten Kügelchen wurden der Blutprobe zugesetzt und 10 Minuten lang inkubiert. Abbildung 3A zeigt die IgG-Kontrollprobe, die keine perlenroten Blutkörperchenkomplexe erzeugte. Als nächstes wurde die Identität der roten Blutkörperchen, die von den Rh(+)-positiven Kügelchen erfasst wurden, durch Vorfärbung der Rh(+)-Zellen mit einer fluoreszierenden Plasmamembranfärbung verifiziert und dann mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet (Abbildung 3B). Ein positives Erkennungsereignis ist in Abbildung 3C dargestellt. Die Bindung der Anti-Rh-Perle an die Rh(+)-Zellen erzeugt einen Kügelchen-Zell-Komplex mit einer Dichte zwischen der der Kügelchen und der Zelle, der daher in einer Höhe schwebt, die sich zwischen den ungebundenen Fangperlen und negativen Erythrozyten befindet. Eine Nahaufnahme der Perlenzellkomplexe wurde unter fluoreszierendem Licht aufgenommen, um das Vorhandensein der Rh(+)-Zellen zu bestätigen, die mit einer fluoreszierenden Plasmamembranfärbung markiert sind. (Abbildung 3D). Abbildung 3E zeigt Perlen-Perlen-Komplexe, die sich zwischen Perlen hoher und niedriger Dichte bilden, die mit Antikörpern für CR1 und CD47 beschichtet sind, die auf das Vorhandensein extrazellulärer Vesikel hinweisen. Ein Schema des Perlenzellkomplexes ist in Abbildung 3F dargestellt.
Abbildung 1. Prinzipien der Magnetschwebebahn: (A) Schemata des Magnetfeldes. (B) Ein Forschungsmikroskop, das auf die Seite gekippt ist, um die seitliche Abbildung der im Kapillarrohr schwebenden Ziele zu ermöglichen. (C) Schrägansicht der Magnetschwebevorrichtung unter dem Mikroskopobjektiv. (D) Magnetschwebevorrichtung Frontalansicht. (E) Schematische Darstellung der Magnetschwebevorrichtung mit einem kapillaren Rohr, das zwischen zwei Magneten montiert ist, Vorder- und Seitenansicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Demonstration des zellspezifischen Dichtegleichgewichts: (A) Perlen niedriger und hoher Dichte (1,05 und 1,2 g/ml) allein bei 60 mM Gd3+ (betrachtet auf einem 10-fachen Objektiv). (B) PMNs, die bei 21 mM Gd3+über roten Blutkörperchen schweben, wobei unscharfe Blutplättchen zirkulieren (auf einem 10-fachen Objektiv betrachtet). (C) Vollblut, das bei 60 mM Gd3+schwebt, was eine Konzentration ist, die sich auf Erythrozyten konzentriert (auf einem 10-fachen Objektiv betrachtet). (D) Diese Zahl wurde modifiziert von [Tasoglu, S. et al. Levitationale Bildzytometrie mit zeitlicher Auflösung. Fortschrittliche Materialien. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Dichtetrennung von Erythrozyten (rot), PMNs (grün) und Lymphozyten (blau) bei 40 mM Gd3+. Jede Zellpopulation schwebte in einer Höhe, die auf ihren intrinsischen Dichten basierte (auf einem 10-fachen Objektiv betrachtet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Nachweis des Rh-Faktors in einer Blutprobe: (A) Rh(-)Blut mit Rh(+)-Blut und IgG-Kontrollperlen. Es bilden sich keine Perlenzellkomplexe (betrachtet auf einem 10-fachen Objektiv). (B) IgG-Kontrollprobe unter fluoreszierendem Licht, das die Rh(+)-Zellen hervorhebt (betrachtet auf einem 10-fachen Objektiv). (C) Rh(-)Blut mit Rh(+)-Blut und Anti-RhD-beschichteten Kügelchen, was die Bildung von Perlenzellkomplexen zeigt (auf einem 10-fachen Objektiv betrachtet). (D) Eine Nahaufnahme eines Perlenzellkomplexes unter fluoreszierendem Licht (betrachtet auf einem 10-fachen Objektiv). (E) Anti-CR1- und Anti-CD47-beschichtete Kügelchen bildende Komplexe, die auf das Vorhandensein von RBC-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln hinweisen (auf einem 10-fachen Objektiv betrachtet). (F) Diagramm, das den Perlenzellkomplex darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Gradientenzentrifugation ist derzeit die Standardtechnik zur Isolierung subzellulärer Komponenten aufgrund ihrer einzigartigen Dichten. Dieser Ansatz erfordert jedoch den Einsatz spezialisierter Gradientenmedien sowie Zentrifugenanlagen. Der hier vorgestellte Magnetschwebeansatz ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften zirkulierender Zellen mit minimaler, wenn überhaupt, Manipulation der Zellen, was einen nahezu in vivo-Zugang zu zirkulierenden Zellen ermöglicht.
Bei der Magnetschwebebahn sind jedoch mehrere Punkte erwähnenswert. Erstens muss das für die Bildgebung verwendete Mikroskop dieser Methode gewidmet sein, da der Aufbau zeitaufwendig ist und erfordert, dass das Mikroskop teilweise zerlegt und perfekt horizontal positioniert wird, wobei die Optik genau auf die Magnete und das Kapillarrohr ausgerichtet ist. Zweitens erfordern der Laborheber und die Translationsstufen, die zur Einstellung der Bewegungen des Kapillarglases und des Fokus verwendet werden, eine genaue Positionierung und freie Bewegung auf jeder der drei Achsen. Die wahrscheinlich kritischste Ausrichtung des gesamten Aufbaus ist die Montage der Magnetschwebevorrichtung in den Translationsstufen, so dass die oberen und unteren Magnete perfekt auf den Schwerkraftvektor ausgerichtet sowie perfekt horizontal ausgerichtet sind. Jede Abweichung von diesen Anforderungen würde einen Winkel zwischen der magnetischen Kraft und der Schwerkraft erzeugen, der die Zellen zu beiden Seiten des Kapillarrohrs drücken würde, den Levitationsprozess stören und die Ergebnisse unzuverlässig machen würde.
Die optimale Konzentration der Gadolinium-Lösung, die für die Schwebende von Zellen verwendet wird, muss für den Zelltyp und das Ziel des Experiments angepasst werden. Änderungen in der Konzentration der Gadoliniumlösung verändern die Levitationshöhe der zu analysierenden Zellen erheblich und müssen daher von einer Versuchsreihe zur anderen konstant gehalten werden. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, abhängig von der Dichte der Zielzellen, können sie überhaupt nicht schweben, während, wenn sie zu hoch ist, die Bandbreite der nachweisbaren Veränderungen begrenzt, die genau quantifiziert werden können.
Schwebende Strukturen erzeugen stabile Bänder, wenn die einzigen Kräfte, die auf sie einwirken, Schwerkraft und magnetische Abstoßung sind. Das Vorhandensein auch nur einer millimetergroßen Blase im Kapillarrohr erzeugt kleine kreisförmige Ströme an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die die schwebenden Zellen stören, was jede Analyse praktisch unmöglich macht. Beim Laden einer Probe in ein Kapillarrohr und dann nach dem Versiegeln muss man sicherstellen, dass keine Luft vorhanden ist, indem man die Kapillare unter einem Stereomikroskop oder einem Objektiv mit geringer Leistung (4x) untersucht.
Die Levitation von Zellen in einer festgelegten Höhe hängt davon ab, dass ihre magnetische Signatur im Laufe der Zeit gleich bleibt. Wenn die paramagnetischen Gadolinium-Ionen aus dem Levitationsmedium entweder durch Pinozytose oder erhöhte Membranpermeabilität, wie während der Apoptose, in die Zellen gelangen, ist die erhöhte Zelldichte, die anhand der Dichtereferenzperlen gemessen wird, fehlerhaft. Glücklicherweise haben die meisten zirkulierenden Zellen schlechte pinozytäre Fähigkeiten26, was diese Methode zu einem geeigneten Ansatz für die Untersuchung von Zellen über lange Zeiträume macht.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Getulio Pereira für seine Hilfe bei der extrazellulären Vesikelarbeit.
Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse des National Institute of Health an ICG unterstützt: RO1CA218500, UG3HL147353 und UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
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