Summary
Este artículo describe un método basado en la levitación magnética que puede detectar específicamente la presencia de antígenos, ya sean solubles o unidos a la membrana, cuantificando los cambios en la altura de levitación de las perlas de captura con densidades fijas.
Abstract
El método descrito se desarrolló en base a los principios de la levitación magnética, que separa las células y las partículas en función de su densidad y propiedades magnéticas. La densidad es una propiedad de identificación de tipo celular, directamente relacionada con su tasa metabólica, diferenciación y estado de activación. La levitación magnética permite un enfoque de un solo paso para separar, obtener imágenes y caracterizar con éxito las células sanguíneas circulantes, y para detectar anemia, enfermedad de células falciformes y células tumorales circulantes en función de la densidad y las propiedades magnéticas. Este enfoque también es susceptible de detectar antígenos solubles presentes en una solución mediante el uso de conjuntos de perlas de baja y alta densidad recubiertas con anticuerpos de captura y detección, respectivamente. Si el antígeno está presente en la solución, une los dos conjuntos de perlas, generando un nuevo complejo de cuentas- cuentas, que levitará entre las filas de cuentas recubiertas de anticuerpos. El aumento de la concentración del antígeno objetivo en solución generará un mayor número de complejos de perlas en comparación con concentraciones más bajas de antígeno, lo que permitirá mediciones cuantitativas del antígeno objetivo. La levitación magnética es ventajosa para otros métodos debido a su menor tiempo de preparación de la muestra y la falta de dependencia de los métodos clásicos de lectura. La imagen generada se captura y analiza fácilmente utilizando un microscopio estándar o un dispositivo móvil, como un teléfono inteligente o una tableta.
Introduction
La levitación magnética es una técnica desarrollada para separar, analizar e identificar los tipos celulares1,2,3,proteínas4,5 y opioides6 basándose únicamente en su densidad específica y propiedades paramagnéticas. La densidad celular es una propiedad única e intrínseca de cada tipo de célula directamente relacionada con su tasa metabólica y estado de diferenciación7,8,9,10,11,12,13,14. Cuantificar los cambios sutiles y transitorios en la densidad celular durante las condiciones de estado estacionario, y durante una variedad de procesos celulares, podría permitirle a uno una visión inigualable de la fisiología celular y la fisiopatología. Los cambios en la densidad celular se asocian con ladiferenciación celular15,16,la progresión del ciclo celular9,17, 18,19,la apoptosis 20,21,22,23y la transformación maligna24,25,26 . Por lo tanto, la cuantificación de cambios específicos en la densidad celular, se puede utilizar para diferenciar entre células de diferentes tipos, así como discriminar entre un mismo tipo de células sometidas a diversos procesos de activación. Esto permite experimentos dirigidos a una subal población celular en particular, donde los cambios dinámicos en la densidad sirven como un indicador del metabolismo celular alterado27. Como se ha establecido que una célula puede alterar su densidad en respuesta a un entorno cambiante7,es imperativo medir la cinética de la célula en relación con su densidad para entenderla completamente, lo que los métodos actuales pueden no proporcionar12. La levitación magnética, por otro lado, permite una evaluación dinámica de las células y sus propiedades28.
Las células son diamagnéticas, lo que significa que no tienen un momento dipolar magnético permanente. Sin embargo, cuando se expone a un campo magnético externo, se genera un momento dipolar magnético débil en las células, en la dirección opuesta al campo aplicado. Por lo tanto, si las células están suspendidas en una solución paramagnética y expuestas a un fuerte campo magnético vertical, levitarán lejos de la fuente magnética y se detendrán a una altura, que depende principalmente de su densidad individual. La levitación diamagnética de un objeto confinado al mínimo de un campo magnético no homogéneo es posible cuando se cumplen los dos criterios siguientes: 1) la susceptibilidad magnética de la partícula debe ser menor que la del medio circundante, y 2) la fuerza magnética debe ser lo suficientemente fuerte como para contrarrestar la fuerza de flotabilidad de la partícula. Ambos criterios pueden cumplirse suspendiendo los glóbulos rojos en un búfer magnético y creando fuertes gradientes de campo magnético con imanes permanentes pequeños, económicos y disponibles comercialmente1. La posición de equilibrio de una partícula atrapada magnéticamente en un eje a lo largo de la dirección de la gravedad está determinada por su densidad (en relación con la densidad del tampón), su susceptibilidad magnética (en relación con la susceptibilidad magnética del tampón) y la firma del campo magnético aplicado. Como la densidad y las propiedades magnéticas de la solución son constantes en todo el sistema, las propiedades de densidad intrínseca de las células serán el factor principal que determine la altura de levitación de las células, con células más densas que levitan más bajas en comparación con las células menos densas. Este enfoque utiliza un conjunto de dos cuentas de referencia de densidad (1,05 y 1,2 g/ml) que nos permite utilizar un análisis preciso y ratiométrico para las mediciones de densidad. Alterar la concentración de la solución magnética permite aislar diferentes poblaciones celulares, como los glóbulos rojos de los glóbulos blancos, ya que la densidad de las células circulantes es específica de la célula, eliminando la necesidad de protocolos de aislamiento u otra manipulación celular.
La mayoría de los métodos de detección utilizados en la investigación biología se basan en la extrapolación de eventos de unión específicos en señales lineales fáciles de cuantificar. Estos métodos de lectura son a menudo complejos e involucran equipos especializados y personal científico dedicado. Aquí se describe un enfoque dirigido a la detección de antígenos que se encuentran en la membrana plasmática de las células o vesículas extracelulares o que son solubles en plasma, utilizando una o dos perlas recubiertas de anticuerpos. Las cuentas deben ser de diferentes densidades entre sí y de las de los objetivos interrogados. La presencia del antígeno objetivo en cualquier biofluido dado se traduce en un cambio específico y medible en la altura de levitación de una célula positiva para antígeno que está unida a una cuenta de detección. En el caso de antígenos solubles o vesículas extracelulares, están unidas tanto a cuentas de captura como de detección, formando un complejo de cuentas-cuentas en lugar de un complejo de perlas-células. El cambio en la altura de levitación depende de la nueva densidad de los complejos de células de cuentas o cuentas. Además del cambio en la altura de levitación de los complejos, que indica la presencia de antígeno en el biofluido, el número de complejos también depende de la cantidad de objetivo, lo que hace que la levitación magnética también sea un enfoque cuantitativo para la detección de antígenos24.
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Protocol
El protocolo experimental utilizado en este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Beth Israel Deaconess (IRB).
1. Configuración del instrumento
NOTA: Las imágenes de células levitizantes requieren que dos imanes de neodimio de tierras raras magnetizados en el eje Z se coloquen con el mismo polo uno frente al otro para generar un campo magnético. La distancia entre los imanes se puede personalizar dependiendo de la intensidad del campo magnético y la densidad de los objetivos. En este caso, los imanes están separados por un espacio de 1 mm suficiente para la inserción de un tubo capilar de vidrio cuadrado de 1x1 mm de 50 mm de largo. El dispositivo se imprimió en 3D utilizando un diseño de AutoCAD, que está disponible bajo petición.
- Coloca el microscopio de lado, perfectamente horizontal.
NOTA: Un microscopio colocado en posición vertical estándar no es directamente adecuado para obtener imágenes de objetos levitantes debido a las posiciones de los imanes con respecto al condensador y el objetivo. Esta limitación se puede evitar colocando el microscopio de lado, perfectamente horizontal permitiendo que el condensador enfoque la luz en el capilar, y la lente del objetivo para obtener imágenes de la célula levitando entre los imanes, manteniendo los requisitos de iluminación de Köhler. - Apoye y nivele el soporte en una mesa de placa de pruebas utilizando 2 o 3 tomas de laboratorio.
- Para limitar las vibraciones, apoye la mesa de la placa de pruebas con pies amortiguadores de goma.
- Retire la etapa y reemplácela con un conector de laboratorio compacto para ajustar la altura del dispositivo de levitación(eje y)y dos etapas de traslación de un solo eje; uno para ajustar el enfoque(eje z),y el segundo para escanear el tubo capilar.
- Conecte el dispositivo de levitación magnética a la toma de laboratorio mediante dos postes ópticos de la miniserie.
2. Unión de anticuerpos a carboxi-micropartículas/perlas (Modificado a partir de un protocolo por PolyAn)
NOTA: Solo las perlas de baja densidad (1,05 g/ml) deben recubrirse para la detección de Rh(+), pero tanto las perlas de alta como las de baja densidad están recubiertas para la detección de vesículas extracelulares.
- Saque 1 mg equivalente de suspensión de perlas y agregue a 0.5 mL de tampón de activación (50 mM MES (MW195.2, 9.72 mg en 1 ml)) pH 5.0 y 0.001% polisorbato-20).
- Añadir 12 μL de EDC 1,5 M recién hecho (MW 191,7, 0,28755 g en 1 mL) y 12 μL de 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g en 1 mL) en agua helada.
- Coloque los tubos en un agitador orbital y agite vigorosamente durante 1 h a temperatura ambiente para activar los grupos carboxilo en las perlas.
- Detenga la activación después de 1 h agregando 0.5 mL de tampón de acoplamiento (10x PBS, o 0.1 M de fosfato pH 7-9).
- Peletizar las perlas centrifugando a 20.000 x g durante 10 min, o, si las perlas no se pueden peletizar, utilizar un filtro de tubo de centrífuga de 0,45 μm. Aspirar el sobrenadante o flow-through.
- Lave las perlas con 1 ml de 10x PBS 3 veces como en el paso 2.5.
- Calcule 25 μg de anticuerpos por mg de perlas y mezcle el anticuerpo deseado con perlas activadas a una concentración final de anticuerpos de 0.7-1.0 mg / ml en 10X PBS.
- Coloque los tubos en un balancín de tubos a baja velocidad. Enrolle los tubos suavemente a temperatura ambiente durante la noche para el acoplamiento.
- Repita el paso 2.5 y lave las perlas dos veces con 1 ml de 10x PBS.
- Lavar con 0,5 ml de etanolamina de 1 M (98% de stock = 16,2 M) en tampón de pH 8,0 con polisorbato-20 al 0,02% durante 1 h a temperatura ambiente mientras se agita suavemente.
- Repita el paso 2.5 y lave las perlas una vez en 1 ml de DPBS. Las perlas se pueden almacenar en 200 μL de DPBS a 4 °C hasta que sea necesario.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
3. Recolección y preparación de sangre para la detección de Rh(+)
- Usando un dispositivo de punción de un solo clic, pinche el dedo de un donante Rh(+) y recolecte 10 μL de sangre en 1 mL de DPBS.
- Teñir las células Rh+ con una tinción fluorescente de membrana plasmática. Opcionalmente, agregue 1 μL de colorante fluorescente a la suspensión de 1 ml de células Rh + (dilución 1: 1000).
- Incubar las células con el colorante fluorescente a 37 °C durante 15 min.
- Peletizar las células girando a 5.600 x g durante 15 s y lavar 3 veces usando 1 mL de DPBS. Resuspend en 1 mL de HBSS con calcio y magnesio (HBSS++).
- Usando el dispositivo de punción de un solo clic, pinche el dedo de un donante Rh(-) y recolecte 2 μL de sangre.
NOTA: Si prepara más de 2 condiciones, recolecte suficiente sangre para agregar 1 μL de sangre Rh(-) a cada tubo. - Preparar los tubos experimentales necesarios: Perlas solas, control de IgG, muestra.
- Perlas solas: agregue 174 μL de HBSS++, 1 μL de perlas de control de IgG, 1 μL de perlas de alta densidad (1,2 g/mL) y 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Control de IgG: agregue 172 μL de HBSS++, 1 μL de perlas de control de IgG, 1 μL de perlas de alta densidad, 1 μL de sangre Rh,1 μL de suspensión sanguínea Rh+ teñida y 24 μL de 500 mM Gd3+.
- El tubo de muestra agrega 172 μL de HBSS++, 1 μL de perlas recubiertas anti-RhD, 1 μL de perlas de alta densidad, 1 μL de sangre Rh-, 1 μL de suspensión sanguínea Teñida Rh(+) y 24 μL de 500 mM Gd3+.
NOTA: Las perlas de alta densidad se agregan a las muestras de Rh como referencia.
4. Aislamiento de PMN para demostración de separación celular
- Aislamiento de neutrófilos
- Extraiga 40 ml de sangre venosa en una jeringa de 60 ml que contenga 6 ml de citrato de sodio/ácido cítrico (0,15 M, pH 5,5) y 14 ml de dextrano-70 al 6%.
- Espere 50 minutos para que la sangre se sedimente.
- Coloque lentamente las células de la capa buffy sobre 20 ml de Ficoll-Paque empujando los 18 ml superiores a través del tubo de recolección de sangre en un tubo de 50 ml, evitando la contaminación con glóbulos rojos sedimentados. Se recomienda utilizar un conjunto de recolección de sangre fresca, para minimizar la contaminación con glóbulos rojos residuales sobrantes en el tubo de recolección de sangre original.
- Pellet las células de la capa buffy por centrifugación durante 20 min a 3.000 x g. Los neutrófilos y los glóbulos rojos contaminantes se gricarán en la parte inferior del tubo. PBMC formará una capa blanca en la parte superior de Ficoll-Paque.
- Transfiera los neutrófilos a un nuevo tubo de 50 ml.
- Lise cualquier glóbulo rojo residual incubando los neutrófilos con 20 ml de solución de NaCl fría al 0,2% durante 25 segundos, seguido de 20 ml adicionales de NaCl al 1,6%. La concertación final de NaCl debe ser del 0,9% (isotónica).
- Centrifugar la suspensión durante 10 min a 3.000 x g.
- Retire el sobrenadante y vuelva a colocar los neutrófilos a la concentración deseada.
-
Aislamiento de linfocitos
- Placa los PBMCs en RPMI con suero inactivado por calor al 5% en placas de cultivo de 6 pozos.
- Incubar las placas durante 1 h a 37 °C. Los monocitos se adherirán a la placa, los linfocitos flotarán libremente.
- Retire el tampón que contiene los linfocitos y lávelo dos veces con RPMI.
- Resuspend los linfocitos a la concentración deseada.
-
Etiquete los glóbulos rojos, pmN y linfocitos.
- Etiquete cada tipo de célula con un tinte fluorescente diferente. Asegúrese de que cada colorante fluorescencia en un canal diferente. Siga las instrucciones del fabricante para cada uno de los tintes elegidos.
5. Generación de vesículas extracelulares de glóbulos rojos a través de la activación del complemento
- Obtener sangre entera a través de la venopunción utilizando tubos de EDTA.
- Pase la sangre a través de un filtro de glóbulos blancos y luego centrífuga 3 veces a 500 x g durante 10 minutos cada una para aislar los glóbulos rojos. Utilice HBSS++ como tampón de lavado.
- Haga alícuotas de glóbulos rojos empaquetados de 100 μL en tubos de 1.5 ml y sume el volumen a 1 ml agregando HBSS ++.
- Agregue C5b,6 a una concentración final de 0,18 μg/ml en HBSS++, y luego vórtice.
- Coloque un agitador lento a temperatura ambiente durante 15 min.
- Añadir la proteína C7 a una concentración final de 0,2 μg/ml. Mezclar invirtiendo el tubo suavemente un par de veces. No vórtice a partir de este punto.
- Coloque el tubo en un agitador de tubos a baja velocidad durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir la proteína C8 a una concentración final de 0,2 μg/ml, y la proteína C9 a 0,45 μg/ml. Mezclar invirtiendo los tubos suavemente un par de veces.
- Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Centrifugar el tubo a 10.000 x g durante 10 min.
- Recoja el sobrenadante que contiene EV en un tubo nuevo. No tremove el sobrenadante demasiado cerca de la bolita celular.
6. Análisis de células en el dispositivo de levitación magnética
- Realice el arranque del instrumento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cargue 50 μL de muestra en un tubo capilar hasta que el tubo se llene. Selle los extremos del tubo capilar con sellador capilar asegurándose de que no haya burbujas de aire presentes.
- Cargue el tubo capilar en el soporte entre los imanes superior e inferior. Ajuste el escenario y el enfoque para una visualización óptima.
NOTA: Las células / perlas pueden tardar entre 5 y 20 minutos en alcanzar su posición de equilibrio magnético en función de su densidad y la concentración de Gd3+. Cuanto mayor sea la concentración de Gd3+,menor será el tiempo.
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Representative Results
La levitación magnética enfoca objetos de diferentes densidades a diferentes alturas de levitación dependiendo de la densidad del objeto, su firma magnética, la concentración de solución paramagnética y la fuerza del campo magnético creado por dos imanes fuertes de tierras raras. Como los dos imanes se colocan uno encima del otro, las muestras que levitan solo se pueden ver, manteniendo la iluminación de Köhler, mediante el uso de un microscopio girado de lado(Figura 1). La altura de levitación final alcanzada por cada tipo de célula se puede modificar fácilmente cambiando la concentración de la solución paramagnética. La Figura 2 ilustra la separación de las diferentes células sanguíneas circulantes mediante el uso de varias concentraciones de gadolinio. Los dos tipos de perlas con diferentes densidades (1,05 y 1,2 g/ml) se utilizaron para proporcionar alturas de levitación de densidad y referencias de tamaño. Como la altura de levitación de un tipo de célula dado depende de su densidad intrínseca, la levitación magnética proporciona un medio directo para aislar las células de interés sin ninguna manipulación significativa24. El objetivo principal de este protocolo fue demostrar la capacidad de la levitación magnética para detectar la presencia de antígenos unidos a la membrana, en este caso el factor Rh, en los glóbulos rojos circulantes. Para este experimento, las perlas de baja densidad se recubrieron con anticuerpos de control IgG o anti-RhD. Luego se prepararon muestras de sangre de un donante rh(-) con sangre de un Rh(+) en una proporción de 1:1000. Las perlas recubiertas anti-RhD(+) o las perlas recubiertas de IgG de control se agregaron a la muestra de sangre y se incubaron durante 10 minutos. La Figura 3A muestra la muestra de control de IgG, que no generó ningún complejo de glóbulos rojos perlas. A continuación, la identidad de los glóbulos rojos capturados por las perlas Rh(+) positivas se verificó mediante la tinción previa de las células Rh(+) con una tinción fluorescente de la membrana plasmática, y luego se obtuvo una imagen utilizando microscopía de fluorescencia(Figura 3B). Un evento de detección positivo se muestra en la Figura 3C. La unión de la cuenta anti-Rh a las células Rh(+) crea un complejo de células de cuentas con una densidad entre la de las perlas y la célula, por lo tanto, levitando a una altura situada entre las perlas de captura no unidas y los glóbulos rojos negativos. Se obtuvo una imagen de un primer plano de los complejos de células perlas bajo luz fluorescente para confirmar la presencia de las células Rh(+) etiquetadas con una tinción fluorescente de membrana plasmática. (Figura 3D). La Figura 3E muestra complejos de perlas que se forman entre cuentas de alta y baja densidad recubiertas con anticuerpos para CR1 y CD47, que indican la presencia de vesículas extracelulares. Un esquema del complejo de celdas de cuentas se muestra en la Figura 3F.
Figura 1. Principios de levitación magnética: (A) Esquemas del campo magnético. (B) Un microscopio de grado de investigación inclinado sobre su lado para permitir la obtención de imágenes laterales de los objetivos que levitan en el tubo capilar. (C) Vista en ángulo del aparato de levitación magnética bajo el objetivo del microscopio. (D) Aparato de levitación magnética vista frontal. (E) Esquemas del aparato de levitación magnética con un tubo capilar montado entre dos imanes, vista frontal y lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Demostración del equilibrio de densidad específica de la célula: (A) Perlas de baja y alta densidad (1,05 y 1,2 g/ml) solas a 60 mM Gd3+ (visto en un objetivo 10x). (B) PMN que levitan por encima de los glóbulos rojos a 21 mM Gd3+,con plaquetas fuera de foco circulando (visto en un objetivo 10x). (C) Sangre total que levita a 60 mM Gd3+,que es una concentración que se centra en los glóbulos rojos (visto en un objetivo 10x). (D) Esta cifra ha sido modificada de [Tasoglu, S. et al. Citometría de imagen levitacional con resolución temporal. Materiales avanzados. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Separación de densidad de glóbulos rojos (rojo), PMN (verde) y linfocitos (azul) a 40 mM Gd3+. Cada población celular levitó a una altura basada en sus densidades intrínsecas (visto en un objetivo 10x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Detección del factor Rh en una muestra de sangre: (A) Sangre Rh(-) con picos de sangre Rh(+) y perlas de control de IgG. No se forman complejos de células de cuentas (vistos en un objetivo 10x). (B) Muestra de control de IgG bajo luz fluorescente que resalta las células Rh(+) (vista en un objetivo 10x). (C) Sangre Rh(-) con sangre Rh(+) y cuentas recubiertas anti-RhD, mostrando la formación de complejos de células de cuentas (visto en un objetivo 10x). (D) Una vista en primer plano de un complejo de células de cuentas bajo luz fluorescente (vista en un objetivo 10x). (E) Perlas recubiertas anti-CR1 y anti-CD47 que forman complejos, lo que indica la presencia de vesículas extracelulares derivadas de glóbulos rojos (visto en un objetivo 10x). (F) Diagrama que representa el complejo de celdas de cuentas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La centrifugación por gradiente es actualmente la técnica estándar para aislar componentes subcelulares en función de sus densidades únicas. Este enfoque, sin embargo, requiere el uso de medios de gradiente especializados, así como equipos de centrífuga. El enfoque de levitación magnética presentado aquí permite una investigación detallada de las propiedades morfológicas y funcionales de las células circulantes, con una manipulación mínima, si es que hay alguna, de las células, proporcionando un acceso casi in vivo a las células circulantes.
Sin embargo, cuando se utiliza la levitación magnética, vale la pena mencionar varios puntos. En primer lugar, el microscopio utilizado para la obtención de imágenes debe dedicarse a este método, ya que la configuración requiere mucho tiempo y requiere que el microscopio se desmonte parcialmente, colocado perfectamente horizontalmente con la óptica alineada con precisión con los imanes y el tubo capilar. En segundo lugar, el gato de laboratorio y las etapas de traslación utilizadas para ajustar los movimientos del vidrio capilar y el enfoque requieren un posicionamiento exacto y un movimiento libre en cada uno de los tres ejes. Probablemente la alineación más crítica de toda la configuración, es montar el dispositivo de levitación magnética en las etapas de traslación de tal manera que los imanes superior e inferior estén perfectamente alineados con el vector de gravedad, así como perfectamente horizontales. Cualquier desviación de estos requisitos crearía un ángulo entre la fuerza magnética y la gravedad que empujaría a las células hacia ambos lados del tubo capilar, interrumpiendo el proceso de levitación y haciendo que los resultados no sean confiables.
La concentración óptima de la solución de gadolinio utilizada para las células levitizantes debe ajustarse para el tipo de célula y el objetivo del experimento. Los cambios en la concentración de la solución de gadolinio alterarán significativamente la altura de levitación de las células que se están analizando y, por lo tanto, deben mantenerse constantes de un conjunto de experimentos a otro. Si la concentración es demasiado baja, dependiendo de la densidad de las células objetivo, es posible que no levite en absoluto, mientras que si es demasiado alta, limitará el rango de cambios detectables que se pueden cuantificar con precisión.
Las estructuras levitantes crearán bandas estables si las únicas fuerzas que actúan sobre ellas son la gravedad y la repulsión magnética. La presencia de incluso una burbuja de tamaño milimétrico en el tubo capilar creará pequeñas corrientes circulares en la interfaz aire-líquido, lo que perturbará las células que levitan, haciendo que cualquier análisis sea prácticamente imposible. Al cargar una muestra en un tubo capilar, y luego después del sellado, uno debe asegurarse de que no haya aire presente, examinando el capilar bajo un objetivo estereomitroscopio o de baja potencia (4x).
La levitación de las células a una altura establecida depende de que su firma magnética permanezca igual a lo largo del tiempo. Si los iones paramagnéticos de gadolinio de los medios de levitación entran en las células, ya sea a través de la pinocitosis o el aumento de la permeabilidad de la membrana, como durante la apoptosis, el aumento de la densidad celular medido en función de las perlas de referencia de densidad será erróneo. Afortunadamente, la mayoría de las células circulantes tienen capacidades pinocíticas deficientes26,lo que hace de este método un enfoque adecuado para estudiar las células durante largos períodos de tiempo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Getulio Pereira por su ayuda con el trabajo de vesículas extracelulares.
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones del Instituto Nacional de Salud al ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 y UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
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