Summary
Este artigo descreve um método baseado em levitação magnética que pode detectar especificamente a presença de antígenos, solúveis ou ligados à membrana, quantificando mudanças na altura de levitação das contas de captura com densidades fixas.
Abstract
O método descrito foi desenvolvido com base nos princípios da levitação magnética, que separa células e partículas com base em sua densidade e propriedades magnéticas. Densidade é um tipo de célula que identifica propriedade, diretamente relacionada à sua taxa metabólica, diferenciação e status de ativação. A levitação magnética permite uma abordagem de um passo para separar, imagem e caracterizar com sucesso as células sanguíneas circulantes, e detectar anemia, doença falciforme e células tumorais circulantes com base na densidade e propriedades magnéticas. Esta abordagem também é favorável à detecção de antígenos solúveis presentes em uma solução usando conjuntos de contas de baixa e alta densidade revestidas com anticorpos de captura e detecção, respectivamente. Se o antígeno estiver presente na solução, ele fará a ponte entre os dois conjuntos de contas, gerando um novo complexo de contas de contas, que levitará entre as fileiras de contas revestidas de anticorpos. O aumento da concentração do antígeno alvo na solução gerará um número maior de complexos de contas de contas quando comparados com menores concentrações de antígeno, permitindo assim medições quantitativas do antígeno alvo. A levitação magnética é vantajosa para outros métodos devido ao seu tempo de preparação amostral reduzido e à falta de dependência dos métodos clássicos de leitura. A imagem gerada é facilmente capturada e analisada usando um microscópio padrão ou dispositivo móvel, como um smartphone ou um tablet.
Introduction
Levitação magnética é uma técnica desenvolvida para separar, analisar e identificar os tipos celulares1,2,3, proteínas4,5 e opioides 6 baseadasapenas em sua densidade específica e propriedades paramagnéticas. A densidade celular é uma propriedade única e intrínseca de cada tipo celular diretamente relacionada à sua taxa metabólica e ao estado de diferenciação7,8,9,10,11,12,13,14. Quantificar mudanças sutis e transitórias na densidade celular durante condições de estado constante, e durante uma variedade de processos celulares, poderia permitir uma visão incomparável da fisiologia celular e da fisiopatologia. Alterações na densidade celular estão associadas à diferenciação celular15,16, progressão do ciclo celular9,17,18,19, apoptose20,21,22,23, e transformação maligna24,25,26 . Portanto, a quantificação de alterações específicas na densidade celular, pode ser usada para diferenciar entre células de diferentes tipos, bem como discriminar entre o mesmo tipo de células submetidas a vários processos de ativação. Isso permite experimentos que visam uma determinada subsumão celular, onde mudanças dinâmicas na densidade servem como um indicador do metabolismo celular alterado27. Como foi estabelecido que uma célula pode alterar sua densidade em resposta a um ambiente em mudança7,é imperativo medir a cinética da célula em relação à sua densidade para entendê-la plenamente, que os métodos atuais podem não fornecer12. A levitação magnética, por outro lado, permite uma avaliação dinâmica das células e suas propriedades28.
As células são diamagnéticas, o que significa que elas não têm um momento de dipolo magnético permanente. No entanto, quando exposto a um campo magnético externo, um momento fraco de dipolo magnético é gerado nas células, na direção oposta do campo aplicado. Assim, se as células forem suspensas em uma solução paramagnética e expostas a um forte campo magnético vertical, elas levitarão para longe da fonte magnética e pararão até uma altura, que depende principalmente de sua densidade individual. A levitação diamagnética de um objeto confinado ao mínimo de um campo magnético inhomogenous é possível quando os dois seguintes critérios são cumpridos: 1) a suscetibilidade magnética da partícula deve ser menor do que a do meio circundante, e 2) a força magnética deve ser forte o suficiente para contrabalançar a força de flutuação da partícula. Ambos os critérios podem ser preenchidos suspendendo os RBCs em um buffer magnético e criando fortes gradientes de campo magnético com ímãs permanentes pequenos, baratos e comercialmente disponíveis1. A posição de equilíbrio de uma partícula presa magneticamente em um eixo ao longo da direção da gravidade é determinada por sua densidade (em relação à densidade do tampão), sua suscetibilidade magnética (em relação à suscetibilidade magnética do tampão) e a assinatura do campo magnético aplicado. Como a densidade e as propriedades magnéticas da solução são constantes em todo o sistema, as propriedades de densidade intrínseca das células serão o principal fator determinante da altura de levitação das células, com células mais densas levitando mais baixas em comparação com células menos densas. Esta abordagem utiliza um conjunto de duas contas de referência de densidade (1,05 e 1,2 g/mL) que nos permite usar análises precisas e racionmétricas para medições de densidade. Alterar a concentração da solução magnética permite isolar diferentes populações celulares, como RBCs de WBCs, já que a densidade das células circulantes é específica das células, removendo a necessidade de protocolos de isolamento ou outras manipulações celulares.
A maioria dos métodos de detecção usados em pesquisas de biologia dependem da extrapolação de eventos de ligação específicos em sinais lineares fáceis de quantificar. Esses métodos de leitura são muitas vezes complexos e envolvem equipamentos especializados e pessoal científico dedicado. Uma abordagem destinada à detecção de antígenos encontrados na membrana plasmática das células ou vesículas extracelulares ou que são solúveis no plasma, usando uma ou duas contas revestidas de anticorpos, está aqui descrita. As contas devem ser de densidades diferentes umas das outras e das dos alvos interrogados. A presença do antígeno alvo em qualquer biofluido é traduzida em uma mudança específica e mensurável na altura de levitação de uma célula antígeno positivo que está ligada a uma conta de detecção. No caso de antígenos solúveis ou vesículas extracelulares, eles são obrigados tanto à captura quanto à detecção de contas, formando um complexo de contas de contas em vez de complexo de células de contas. A mudança na altura da levitação depende da nova densidade dos complexos de células de contas ou contas de contas. Além da mudança na altura de levitação dos complexos, o que indica a presença de antígeno no biofluido, o número de complexos também depende da quantidade de destino, tornando a levitação magnética também uma abordagem quantitativa para detecção de antígenos24.
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Protocol
O protocolo experimental utilizado neste estudo foi aprovado pelo Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Configuração do instrumento
NOTA: As células levitando de imagem requer dois ímãs de neodímio de terras raras magnetizados no eixo z para serem colocados com o mesmo polo voltados um para o outro para gerar um campo magnético. A distância entre os ímãs pode ser personalizada dependendo da intensidade do campo magnético e da densidade dos alvos. Neste caso, os ímãs são separados por um espaço de 1mm suficiente para a inserção de um tubo capilar de vidro quadrado de 1x1 mm de comprimento de 1x1 mm de comprimento. O dispositivo foi impresso em 3D usando um design AutoCAD, que está disponível mediante solicitação.
- Coloque microscópio de lado, perfeitamente horizontal.
NOTA: Um microscópio colocado em uma posição vertical padrão não é diretamente adequado para imagens levitando objetos devido às posições dos ímãs em relação ao condensador e objetivo. Essa limitação pode ser contornada colocando o microscópio de lado, perfeitamente horizontal permitindo que o condensador concentre a luz no capilar, e a lente objetiva para a imagem da célula levitando entre os ímãs, mantendo os requisitos de iluminação de Köhler. - Apoie e nivele o suporte em uma mesa de pão usando 2 ou 3 tomadas de laboratório.
- Para limitar as vibrações, apoie a mesa de breadboard com pés umedecidos de borracha.
- Remova o estágio e substitua-o por uma tomada de laboratório compacta para ajustar a altura do dispositivo de levitação(eixo y) e dois estágios translacionais de um eixo único; um para ajustar o foco(eixo z), e o segundo para a varredura do tubo capilar.
- Conecte o dispositivo de levitação magnética à tomada de laboratório usando dois posts ópticos de mini-série.
2. Vinculação de anticorpos a micropartículas/contas carboxy (Modificadas a partir de um protocolo pela PolyAn)
NOTA: Apenas contas de baixa densidade (1,05 g/mL) precisam ser revestidas para detecção de Rh(+), mas tanto as contas de alta e baixa densidade são revestidas para a detecção de vesículas extracelulares.
- Tire 1 mg equivalente à suspensão de contas e adicione em 0,5 mL de Buffer de Ativação (50 mM MES (MW195.2, 9,72 mgs em 1 mL)) pH 5.0 e 0,001% Polisorbate-20).
- Adicione 12 μL de EDC recém-fabricado de 1,5 M (MW 191,7, 0,28755 g em 1 mL) e 12 μL de 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g em 1 mL) em água gelada.
- Coloque tubos em um agitador orbital e agite vigorosamente por 1h à temperatura ambiente para ativar os grupos carboxílicos em contas.
- Pare a ativação após 1h adicionando 0,5 mL de Tampão de Acoplamento (10x PBS, ou 0,1 M pH 7-9).
- Pelota as contas por centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos, ou, se as contas não puderem ser pelotas, use um filtro de tubo de centrífugas de 0,45 μm. Aspire o supernatante ou o fluxo.
- Lave as contas com 1 mL de 10x PBS 3 vezes mais que na etapa 2.5.
- Calcule 25 μg de anticorpos por mg de contas e misture o anticorpo desejado com contas ativadas a uma concentração final de anticorpos de 0,7-1,0 mg/mL em PBS 10X.
- Coloque tubos em um roqueiro de tubo situado em baixa velocidade. Enrole os tubos suavemente à temperatura ambiente durante a noite para o acoplamento.
- Repita o passo 2.5 e lave as contas duas vezes com 1 mL de PBS de 10x.
- Lave com 0,5 mL de 1 M de etanolamina (98% de estoque = 16,2 M) no pH tampão 8,0 com 0,02% Polisorbate-20 para 1h à temperatura ambiente enquanto treme suavemente.
- Repita o passo 2.5 e lave as contas uma vez em 1 mL de DPBS. As contas podem ser armazenadas em 200 μL de DPBS a 4 °C até que seja necessário.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Coleta e Preparação de Sangue para Detecção de Rh(+)
- Usando um dispositivo de lancing de um clique, pique o dedo de um doador Rh(+) e colete 10 μL de sangue em 1 mL de DPBS.
- Manche as células Rh+ com uma mancha de membrana de plasma fluorescente. Opcionalmente, adicione 1 μL de corante fluorescente à suspensão de 1 mL de células Rh+ (diluição de 1:1000).
- Incubar as células com o corante fluorescente a 37 °C por 15 min.
- Pelota as células girando a 5.600 x g para 15 s e lave 3 vezes usando 1 mL de DPBS. Resuspend em 1 mL de HBSS com cálcio e magnésio (HBSS++).
- Usando o dispositivo de lancing de um clique, pique o dedo de um doador rh(-) e colete 2 μL de sangue.
NOTA: Se preparar mais de 2 condições, colete sangue suficiente para adicionar 1 μL de sangue rh(-) a cada tubo. - Prepare os tubos experimentais necessários: Contas sozinhas, controle IgG, amostra.
- Contas sozinhas: adicionar 174 μL de HBSS+++, 1 μL de contas de controle IgG, 1 μL de contas de alta densidade (1,2 g/mL) e 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Controle de IgG: adicionar 172 μL de HBSS+++, 1 μL de contas de controle IgG, 1 μL de contas de alta densidade, 1 μL de sangue Rh, 1 μL de suspensão sanguínea Rh+ manchada e 24 μL de 500 mM Gd3+.
- O tubo de amostra adiciona 172 μL de HBSS+++, 1 μL de contas revestidas anti-RhD, 1 μL de contas de alta densidade, 1 μL de sangue rh, 1 μL de suspensão sanguínea rh(+) manchada e 24 μL de 500 mM Gd3+.
NOTA: Contas de alta densidade são adicionadas às amostras de Rh para referência.
4. Isolamento de PMNs para Demonstração de Separação celular
- Isolamento de Neutrófilos
- Desenhe 40 mL de sangue venoso em uma seringa de 60 mL contendo 6 mL de citrato/ácido cítrico de sódio (0,15 M, pH 5,5) e 14 mL de 6% Dextran-70.
- Espere 50 min para sangue sedimentar.
- Coloque lentamente as células do casaco buffy em cima de 20 mL de Ficoll-Paque empurrando os 18 mL superiores através da tubulação de coleta de sangue em um tubo de 50 mL, evitando contaminação com RBCs sedimentados. Recomenda-se o uso de um conjunto de coleta de sangue fresco, para minimizar a contaminação com RBCs residuais que sobraram no tubo de coleta de sangue original.
- Pelota as células de casaco buffy por centrifugação por 20 min a 3.000 x g. Neutrófilos e RBCs contaminantes vão pelotar na parte inferior do tubo. O PBMC formará uma camada branca em cima do Ficoll-Paque.
- Transfira os neutrófilos para um novo tubo de 50 mL.
- Lyse quaisquer RBCs residuais incubando os neutrófilos com 20 mL de solução NaCl fria de 0,2% por 25 segundos, seguido por um adicional de 20 mL de 1,6% naCl. A concertação final de NaCl deve ser de 0,9% (isotônico).
- Centrifugar a suspensão por 10 min a 3.000 x g.
- Remova o supernatante e resuspenda os neutrófilos para a concentração desejada.
-
Isolamento de Linfócitos
- Emplaque os PBMCs em RPMI com 5% de soro inativado de calor em placas de cultura de 6 poços.
- Incubar as placas por 1h a 37 °C. Os monócitos aderirão à placa, os linfócitos estarão livremente flutuando.
- Remova o tampão contendo os linfócitos e lave-o duas vezes com RPMI.
- Resuspend os linfócitos na concentração desejada.
-
Rotular RBCs, PMN e Linfócitos.
- Rotule cada tipo de célula com um corante fluorescente diferente. Certifique-se de que cada corante fluoresce em um canal diferente. Siga as instruções do fabricante para cada um dos corantes escolhidos.
5. Geração de Vesículos Extracelular RBC através da Ativação Complementar
- Obtenha sangue inteiro através da venipuntura usando tubos EDTA.
- Passe sangue através de um filtro de glóbulos brancos, e depois centrífugas 3 vezes a 500 x g por 10 minutos cada para isolar os glóbulos vermelhos. Use o HBSS++ como tampão de lavagem.
- Faça alíquotas de 100 RBCs embalados em 1,5 mL e compor o volume até 1 mL adicionando HBSS++.
- Adicione C5b,6 a uma concentração final de 0,18 μg/mL no HBSS++, e depois vórtice.
- Coloque um agitador lento à temperatura ambiente por 15 minutos.
- Adicione proteína C7 a uma concentração final de 0,2 μg/mL. Misture invertendo o tubo suavemente algumas vezes. Não vórtice deste ponto em diante.
- Coloque o tubo em um agitador de tubo situado em baixa velocidade por 5 minutos a temperatura ambiente.
- Adicione proteína C8 a uma concentração final de 0,2 μg/mL, e proteína C9 a 0,45 μg/mL. Misture invertendo os tubos suavemente algumas vezes.
- Incubar a 37 °C por 30 min.
- Centrifugar o tubo a 10.000 x g por 10 min.
- Colete o supernante contendo EV em um novo tubo(s). Não trema muito perto da pelota celular.
6. Analisando células no dispositivo de levitação magnética
- Execute a inicialização do instrumento de acordo com as instruções do fabricante.
- Carregue 50 μL de amostra em um tubo capilar até que o tubo esteja cheio. Sele as extremidades do tubo capilar com selante capilar certificando-se de que não há bolhas de ar presentes.
- Coloque o tubo capilar no suporte entre os ímãs superior e inferior. Ajuste o estágio e o foco para uma visualização ideal.
NOTA: As células/contas podem levar de 5 a 20 minutos para alcançar sua posição de equilíbrio magnético com base em sua densidade e na concentração de Gd3+. Quanto maior a concentração de Gd3+,menor o tempo.
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Representative Results
A levitação magnética concentra objetos de diferentes densidades em diferentes alturas de levitação, dependendo da densidade do objeto, sua assinatura magnética, a concentração de solução paramagnética e a força do campo magnético criado por dois ímãs fortes e de terras raras. À medida que os dois ímãs são colocados em cima um do outro, as amostras levitando só podem ser vistas, mantendo a iluminação de Köhler, usando um microscópio virado de lado(Figura 1). A altura final de levitação alcançada por cada tipo de célula pode ser facilmente modificada alterando a concentração da solução paramagnética. A Figura 2 ilustra a separação das diferentes células sanguíneas circulantes usando várias concentrações de gadolínio. Os dois tipos de contas com densidades diferentes (1,05 e 1,2 g/mL) foram utilizados para fornecer alturas de levitação de densidade e referências de tamanho. Como a altura de levitação de um determinado tipo de célula depende de sua densidade intrínseca, a levitação magnética fornece um meio direto de isolar células de interesse sem qualquer manipulação significativa24. O principal objetivo deste protocolo foi demonstrar a capacidade da levitação magnética para detectar a presença de antígenos ligados à membrana, neste caso o fator Rh, sobre glóbulos vermelhos circulantes. Para este experimento, as contas de baixa densidade foram revestidas com anticorpo de controle IgG ou anti-RhD. As amostras foram então preparadas por sangue espiando de um doador rh(-) com sangue de um Rh(+) a uma proporção de 1:1000. Contas revestidas anti-RhD(+) ou as contas revestidas de IgG de controle foram adicionadas à amostra de sangue e incubadas por 10 minutos. A Figura 3A mostra a amostra de controle de IgG, que não gerou nenhum complexo de glóbulos vermelhos. Em seguida, a identidade dos glóbulos vermelhos capturados pelas contas rh(+)positivas foi verificada através da pré-coloração das células Rh(+) com uma mancha de membrana de plasma fluorescente, e então visualizada usando microscopia de fluorescência(Figura 3B). Um evento de detecção positivo é mostrado na Figura 3C. A ligação da anti-Rh-contas às células Rh(+) cria um complexo de células de contas com uma densidade entre a das contas e a célula, levitando-se, portanto, a uma altura situada entre as contas de captura não ligadas e RBCs negativas. Um close-up dos complexos de células de contas foi visualizado sob luz fluorescente para confirmar a presença das células Rh(+) rotuladas com uma mancha de membrana de plasma fluorescente. (Figura 3D). A Figura 3E mostra complexos de contas de contas se formando entre contas de alta e baixa densidade revestidas com anticorpos para CR1 e CD47, que indicam a presença de vesículas extracelulares. Um esquema do complexo de células de contas é mostrado na Figura 3F.
Figura 1. Princípios da Levitação Magnética: (A) Esquemas de campo magnético. (B) Um microscópio de grau de pesquisa inclinado de lado para permitir a imagem lateral dos alvos levitando no tubo capilar. (C) Visão angular do aparelho de levitação magnética sob o objetivo do microscópio. (D) Visão frontal do aparelho de levitação magnética. (E) Esquemas do aparelho de levitação magnética com um tubo capilar montado entre dois ímãs, visão frontal e lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Demonstração do Equilíbrio de Densidade Específica celular: (A) Contas de baixa e alta densidade (1,05 e 1,2 g/mL) sozinhas a 60 mM Gd3+ (visualizadas em um objetivo de 10x). (B) PMNs levitando acima de glóbulos vermelhos a 21 mM Gd3+,com plaquetas fora de foco circulando (visualizadas em um objetivo de 10x). (C) Levitação de sangue inteiro a 60 mM Gd3+, que é uma concentração que se concentra em RBCs (visto em um objetivo de 10x). (D) Esta figura foi modificada de [Tasoglu, S. et al. Citometria de imagem levitacional com Resolução Temporal. Materiais Avançados. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Separação de densidade de RBCs (vermelho), PMNs (verde) e linfócitos (azul) a 40 mM Gd3+. Cada população celular levitava a uma altura com base em suas densidades intrínsecas (vista em um objetivo de 10x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Detecção de Fator Rh em uma Amostra de Sangue: (A) Sangue Rh(-) cravado com contas de sangue Rh(+) e controle de IgG. Não são formados complexos de células de contas (visualizados em um objetivo de 10x). (B) Amostra de controle de IgG sob luz fluorescente destacando as células Rh(+) (visualizadas em um objetivo de 10x). (C) Sangue rh(-) cravado com sangue Rh(+) e contas revestidas anti-RhD, mostrando a formação de complexos de células de contas (vistas em um objetivo de 10x). (D) Uma visão de perto de um complexo de células de contas sob luz fluorescente (visto em um objetivo de 10x). (E) Contas revestidas anti-CR1 e anti-CD47 formando complexos, indicando a presença de vesículas extracelulares derivadas da RBC (vistas em um objetivo de 10x). (F) Diagrama representando o complexo de células de contas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Centrifugação gradiente é atualmente a técnica padrão para isolar componentes subcelulares com base em suas densidades únicas. Essa abordagem, no entanto, requer o uso de meios de gradientes especializados, bem como equipamentos de centrífuga. A abordagem de levitação magnética aqui apresentada permite uma investigação detalhada das propriedades morfológicas e funcionais das células circulantes, com mínimo, se alguma manipulação das células, proporcionando um acesso quase in vivo às células circulantes.
No entanto, ao usar levitação magnética, vários pontos merecem ser mencionados. Em primeiro lugar, o microscópio utilizado para a imagem deve ser dedicado a este método, pois a configuração é demorada, e requer que o microscópio seja parcialmente desmontado, posicionado perfeitamente horizontalmente com a óptica precisamente alinhada com os ímãs e o tubo capilar. Em segundo lugar, o jack de laboratório e os estágios translacionais usados para ajustar os movimentos do vidro capilar e o foco requerem posicionamento exato e livre circulação em cada um dos três eixos. Provavelmente o alinhamento mais crítico de toda a configuração, é a montagem do dispositivo de levitação magnética nos estágios translacionais de tal forma que os ímãs superior e inferior estão perfeitamente alinhados com o vetor de gravidade, bem como perfeitamente horizontal. Qualquer desvio desses requisitos criaria um ângulo entre a força magnética e a gravidade que empurraria as células para ambos os lados do tubo capilar, interrompendo o processo de levitação e tornando os resultados não confiáveis.
A concentração ideal da solução de gadolínio utilizada para células levitando precisa ser ajustada para o tipo celular e o objetivo do experimento. Mudanças na concentração da solução de gadolínio alterarão significativamente a altura de levitação das células que estão sendo analisadas e, portanto, precisam ser mantidas constantes de um conjunto de experimentos para outro. Se a concentração for muito baixa, dependendo da densidade das células-alvo, elas podem não levitar nada, enquanto se for muito alta, limitará o alcance de alterações detectáveis que podem ser quantificadas com precisão.
Estruturas levitando criarão bandas estáveis se as únicas forças que atuam nelas forem gravidade e repulsão magnética. A presença de até mesmo uma bolha de tamanho milímetro no tubo capilar criará pequenas correntes circulares na interface ar-líquido, o que perturbará as células levitando, tornando qualquer análise praticamente impossível. Ao carregar uma amostra em um tubo capilar e, em seguida, após a vedação, deve-se certificar-se de que não há ar presente, examinando o capilar sob um estereomicroscope ou de baixa potência (4x).
A levitação de células a uma altura definida depende de sua assinatura magnética permanecer o mesmo ao longo do tempo. Se os íons de gadolínio paramagnéticos da mídia levitação entrarem nas células, seja através da peticose ou aumento da permeabilidade da membrana, como durante a apoptose, o aumento da densidade celular medido com base nas contas de referência de densidade será errôneo. Felizmente, a maioria das células circulantes tem baixa capacidade de peticítica26, tornando este método uma abordagem adequada para estudar células por longos períodos de tempo.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos para revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Getúlio Pereira pela ajuda com o trabalho de vesícula extracelular.
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas do Instituto Nacional de Saúde ao ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 e UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
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