Summary
Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.
Abstract
Les progrès récents dans les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et les technologies d’édition de gènes permettent le développement de nouveaux modèles de maladies à base de cellules humaines pour les programmes de découverte phénotypique de médicaments (TED). Bien que ces nouveaux dispositifs puissent prédire plus précisément l’innocuité et l’efficacité des médicaments expérimentaux chez l’homme, leur développement en clinique repose encore fortement sur des données sur les mammifères, notamment l’utilisation de modèles de maladies chez la souris. Parallèlement aux modèles de maladies organoïdes ou d’organes sur puce humains, le développement de modèles murins in vitro pertinents est donc un besoin non satisfait pour évaluer les comparaisons directes de l’efficacité et de l’innocuité des médicaments entre les espèces et les conditions in vivo et in vitro . Ici, un test de germination vasculaire qui utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes (EB) est décrit. Les EB vascularisés cultivés sur du gel de collagène 3D développent de nouveaux vaisseaux sanguins qui se dilatent, un processus appelé angiogenèse germée. Ce modèle récapitule les principales caractéristiques de la formation in vivo de l’angiogenèse des vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire préexistant, y compris la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, le guidage cellulaire, la formation de tubes et le recrutement de cellules murales. Il se prête au criblage de médicaments et de gènes modulant l’angiogenèse et présente des similitudes avec des tests vasculaires tridimensionnels (3D) récemment décrits basés sur des technologies iPSC humaines.
Introduction
Au cours des trois dernières décennies, la découverte de médicaments basée sur la cible (TDD) a été largement utilisée dans la découverte de médicaments par l’industrie pharmaceutique. La DJT incorpore une cible moléculaire définie jouant un rôle important dans une maladie et repose sur le développement de systèmes de culture cellulaire relativement simples et de lectures pour le dépistage de médicaments1. La plupart des modèles de maladies typiques utilisés dans les programmes de TDD comprennent des méthodes traditionnelles de culture cellulaire telles que les cellules cancéreuses ou les lignées cellulaires immortalisées cultivées dans des environnements artificiels et des substrats non physiologiques. Bien que bon nombre de ces modèles aient fourni des outils viables pour identifier les médicaments candidats efficaces, l’utilisation de tels systèmes peut être discutable en raison de leur faible pertinence pour la maladie2.
Pour la plupart des maladies, les mécanismes sous-jacents sont en effet complexes et divers types de cellules, des voies de signalisation indépendantes et de multiples ensembles de gènes contribuent souvent à un phénotype de maladie spécifique. Cela est également vrai pour les maladies héréditaires dont la cause principale est une mutation dans un seul gène. Avec l’avènement récent des technologies de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) et des outils d’édition de gènes, il est maintenant possible de générer des organoïdes 3D et des modèles de maladies d’organes sur puce qui pourraient mieux récapituler la complexité humaine in vivo 3,4. Le développement de telles technologies est associé à un regain d’intérêt pour les programmes de découverte de médicaments phénotypiques (TED)1. Les TED peuvent être comparés au dépistage empirique, car ils ne reposent pas sur la connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifique ou sur une hypothèse sur son rôle dans la maladie. L’approche PDD est maintenant de plus en plus reconnue comme contribuant fortement à la découverte de médicaments first-in-class5. Étant donné que le développement des technologies organoïdes et d’organes sur puce humains en est encore à ses balbutiements, on s’attend à ce que les modèles iPSC (complétés par des outils novateurs d’imagerie et d’apprentissage automatique6,7) fournissent, dans un proche avenir, de multiples nouveaux modèles de maladies complexes à base de cellules pour le dépistage de médicaments et les programmes de TED associés afin de surmonter la faible productivité de l’approche TDD8, 9.
Bien que les modèles organoïdes humains et d’organes sur puce puissent fournir des informations importantes sur la complexité de la maladie et l’identification de nouveaux médicaments, l’introduction de médicaments dans de nouvelles pratiques cliniques repose également fortement sur les données de modèles animaux pour évaluer leur efficacité et leur innocuité. Parmi eux, les souris génétiquement modifiées sont certainement les modèles de mammifères les plus préférés. Ils présentent de nombreux avantages car ils ont un temps de génération relativement court pour les mammifères, ont de nombreux phénotypes similaires aux maladies humaines et peuvent être facilement manipulés génétiquement. Ils sont donc largement utilisés dans les programmes de découverte de médicaments10. Cependant, combler le fossé entre les souris et les humains reste un défi important11. Le développement de modèles murins in vitro équivalents aux modèles organoïdes humains et aux modèles d’organes sur puce pourrait au moins partiellement combler cette lacune, car il permettra des comparaisons directes de l’efficacité et de l’innocuité des médicaments entre les données in vivo de souris et les données humaines in vitro.
Ici, un test de germination vasculaire dans les corps embryoïdes de souris (EB) est décrit. Les vaisseaux sanguins sont composés de cellules endothéliales (paroi interne des parois des vaisseaux), de cellules murales (cellules musculaires lisses vasculaires et péricytes)12. Ce protocole est basé sur la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) en EB vascularisés à l’aide de gouttelettes suspendues qui récapitulent la différenciation de novo des cellules endothéliales et des cellules murales13,14. Les CSE de souris peuvent être facilement établies en culture à partir de blastocystes de souris isolés du jour 3.5 ayant des antécédents génétiques différents15. Ils offrent également des possibilités d’analyse clonale, de traçage de lignée et peuvent être facilement manipulés génétiquement pour générer des modèles de maladie13,16.
Comme les vaisseaux sanguins nourrissent tous les organes, il n’est pas surprenant que de nombreuses maladies, sinon toutes, soient associées à des changements dans la microvascularisation. Dans des conditions pathologiques, les cellules endothéliales peuvent adopter un état activé ou devenir dysfonctionnelles, entraînant la mort des cellules murales ou la migration loin des vaisseaux sanguins. Ceux-ci peuvent entraîner une angiogenèse excessive ou une raréfaction des vaisseaux, peuvent induire un flux sanguin anormal et une barrière vasculaire défectueuse conduisant à une extravasation des cellules immunitaires et à une inflammation12,17,18,19. La recherche pour le développement de médicaments modulant les vaisseaux sanguins est donc élevée, et de multiples acteurs moléculaires et concepts ont déjà été identifiés pour le ciblage thérapeutique. Dans ce contexte, le protocole décrit est particulièrement adapté à la construction de modèles de maladies et aux tests de médicaments, car il récapitule les principales caractéristiques de l’angiogenèse in vivo, notamment la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale et de la tige, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, le guidage des cellules endothéliales, la formation de tubes et le recrutement de cellules murales. Il présente également des similitudes avec les tests vasculaires 3D récemment décrits basés sur les technologies iPSC humaines20.
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Protocol
1. Préparation des milieux et culture des CSEm
- Préparer le milieu conditionné +/- (CM+/-) en utilisant le supplément 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) milieu avec 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 0,05 mM de β-mercaptoéthanol, 1x acides aminés non essentiels (NEAA 1x), 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium.
- Préparer le milieu conditionné +/+ (CM+/+) en utilisant le supplément CM+/- milieu avec facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) (1 500 U/mL) et 0,1 mM β-mercaptoéthanol.
- Préparer le milieu conditionné +/+ en présence de deux inhibiteurs (CM+/+2i) en utilisant le complément CM+/+ milieu avec 1 μM PD0325901 et 3 μM CHIR99021.
- Préparer une solution de gélatine à 0,1 % en mélangeant 25 mL de solution de gélatine à 2 % préchauffée dans 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (DPBS).
- Préparer 10x tampon Trypsin Versene Phosphate (TVP 10x) en mélangeant Trypsine (2,5%) avec TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% sérum de poulet, 0,01% Trypsine (2,5%) dans H2O) (rapport 1:10, vol/vol).
REMARQUE: Filtrer toutes les solutions à travers un filtre à pores de 0,22 μm. Conserver le milieu de culture à -20 °C pendant une longue période et conserver les autres réactifs à 4 °C jusqu’à 3 semaines (voir le tableau des matières). - Enduisez deux plaques de culture cellulaire de 12 puits avec une solution de gélatine à 0,1 % (500 μL par puits) et incuber pendant 30 min dans un incubateur de CO 2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide).
- Laver les plaques enrobées de gélatine avec du PBS et ajouter 500 μL de milieu CM+/-.
- Décongeler deux flacons de 1 x 106 fibroblastes embryonnaires de souris irradiés cryoconservés à 37 °C et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique contenant 5 mL de milieu CM+/-.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Aspirer le milieu et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans 12 mL de milieu CM+/- à une concentration de 1,67 x 105 cellules par mL.
- Ensemencer 500 μL de suspension MEF dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits (2,4 x 105 cellules par cm 2) et incuber la plaque pendant une nuit (h/n) dans un incubateur de CO2.
- Décongeler un flacon de CSEm cryoconservés (1 x 106) dans un milieu CM+/+ 2i.
- Ensemencer la suspension de CSEm sur une plaque prélavée de 12 puits avec des MEF dans 1 mL de milieu CM+/+ 2i et transférer la plaque dans un incubateur à CO2 . Rafraîchir le milieu tous les jours.
- À 70% de confluence, laver les colonies de CSEm avec DPBS. Ajouter 150 μL de tampon TVP chaud 10x et incuber à TA pendant 30 s pour initier la dissociation enzymatique.
- Retirer délicatement le tampon TVP, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu CM+/+ 2i et dissocier les colonies en cellules simples par pipetage doux.
- Passage des cellules en les transférant dans une nouvelle plaque de culture cellulaire à 12 puits avec MEF (rapport de fractionnement: 1: 3-1: 5). Mélanger délicatement pour répartir les cellules et incuber dans un incubateur de CO2 .
- Rafraîchir le milieu de culture (2-3 mL) et observer quotidiennement la croissance et la morphologie cellulaires. Répétez la transmission en série à 70 % de confluence tous les 2 jours. Passez au milieu CM+/+ pendant deux passages avant d’initier la différenciation cellulaire.
2. Formation d’EB dans la goutte suspendue
- Préparer le milieu de différenciation du mésoderme frais en complétant le milieu CM+/- avec le facteur de croissance basique des fibroblastes (FGFb) (50 ng · mL-1) et avec la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP-4) (5 ng · mL-1) et le maintenir à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Enduisez un puits de la plaque de culture cellulaire à 6 puits avec 500 μL de solution de gélatine à 0,1% et placez-le dans un incubateur de CO2 pendant 30 min.
- Laver les plaques enrobées de gélatine avec du PBS et ajouter 500 μL de milieu CM+/-.
- Pour obtenir une population pure de CSEm, trypsiniser la plaque de culture cellulaire avec un tampon TVP 10x pendant 30 s à TA, remettre les cellules en suspension dans un milieu de différenciation mésodermique de 1 mL, puis les transférer dans la plaque à 6 puits recouverte de gélatine pendant 30 minutes permettant aux MEF de se fixer pendant que les CSEm restent en suspension.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer et d’un colorant bleu de trypan pour une exclusion des cellules vivantes / mortes.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à TA. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de différenciation du mésoderme pour atteindre 4,55 x 104 cellules par mL.
- Remplissez le fond des boîtes en polystyrène à faible fixation de 94 mm avec 15 ml d’eau stérile.
REMARQUE : Quatre boîtes contenant des gouttes suspendues (1,6 x 105 cellules dans 3,52 mL de milieu) seront nécessaires pour tester une condition particulière à l’aide du test d’angiogenèse germinative 3D. - Transférer la suspension cellulaire dans un réservoir en plastique stérile et charger quatre positions d’une pipette multicanal avec 22 μL de suspension cellulaire par canal (1 x 103 cellules par goutte de 22 μL).
- Soulevez et inversez le couvercle de l’antenne de 94 mm et placez-le sur la surface propre de l’armoire d’écoulement avec le côté intérieur tourné vers le haut.
- Déposez 40 gouttes de la suspension cellulaire sur la surface interne de chaque couvercle. Retournez soigneusement le couvercle sans déranger et replacez-le sur le plat, de sorte que les gouttes fassent face à l’eau.
- Incuber les plats dans un incubateur de CO2 . Considérez cela comme le jour 0 de différenciation. Maintenir les plaques pendant 4 jours pour former des EB.
3. Essai de compétition pour la position de la cellule de pointe
- Culture d’une lignée de CSEm fluorescente et d’une ligne de CSm non fluorescente comme décrit précédemment13. À titre d’exemple, les CSm 7ACS/EYFP étiquetés en jaune et les CSm R1 sont utilisés.
- Préparez les EB en mosaïque en mélangeant des quantités égales des deux lignes de CSEm (rapport 1:1) et incuber les boîtes suspendues dans un incubateur de CO 2 comme décrit à l’étape2 .
4. Culture d’EB flottants pour la différenciation vasculaire
- Avant de collecter les EB des gouttes suspendues, préparez ce qui suit.
- Préparer la solution de gélose à 5 % dansH2Oet la stériliser à l’autoclavage (20 min à 120 °C).
- Utilisez la solution chaude de gélose à 5 % pour préparer le milieu G-MEM BHK-21 contenant 1 % de gélose et versez rapidement 3 mL dans l’une des boîtes en polystyrène de 60 mm. Laisser la gélose se solidifier pendant 1 h à TA. Conserver la vaisselle à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Préparer le milieu de différenciation vasculaire 2x frais en complétant le milieu CM+/- avec du FGFb (100 ng·mL-1) et du VEGF-A (50 ng·mL-1). Conserver le milieu à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Recueillir les gouttes suspendues dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette P1000 et retirer le surnageant après quelques minutes de sédimentation EB.
- Resuspendre les EB dans 3 mL de milieu de différenciation vasculaire 2x, transférer la suspension EB dans une suspension enrobée d’agar distribuer les EB de manière homogène pour éviter l’agrégation.
- Incuber les plats dans l’incubateur de CO 2 et rafraîchir le milieu tous les2 jours jusqu’au jour 9 en utilisant 1x milieu de différenciation vasculaire en présence de FGFb (50 ng·mL-1) et de VEGF-A (25 ng·mL-1).
- Vous pouvez également ajouter le facteur de croissance dérivé des plaquettes-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 le jour 4 et 5 ng·mL-1 le jour 6 et le jour 8) au milieu de différenciation vasculaire pour favoriser la différenciation des cellules murales.
5. Analyse de cytométrie en flux
- Recueillir les EB âgés de 9 jours dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une pipette P1000 et les laver une fois avec du PBS chaud.
- Ajouter 1 mL de milieu G-MEM BHK-21 contenant 0,2 mg·mL-1 de collagénase A et incuber les cellules dans un incubateur de CO2 pendant 5 min.
- Dissocier les EB en pipetant doucement de haut en bas avec une pipette P1000.
- Arrêter l’activité de la collagénase en ajoutant 1 mL de milieu froid G-MEM BHK-21 avec 10% FBS.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à TA.
- Remettez les cellules en suspension dans 500 μL de PBS avec 2% de FBS.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer.
- Resuspendre 400 000 cellules dans 100 μL de PBS avec 2% FBS par condition de coloration.
- Incuber les cellules pendant 45 min à 4 °C avec les anticorps suivants : anticorps anti-souris PECAM-1 conjugué contre rat APC (clone MEC13.3) et anticorps anti-souris CD45 (clone 30-F11) ou anticorps témoins d’isotype conjugués FITC.
- Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS contenant 2% de FBS.
- Remettez les cellules en suspension pour atteindre une concentration finale de 5 x 106 cellules par mL.
- Filtrer les cellules à l’aide d’un tube à essai en polystyrène à fond rond, muni d’un capuchon à pression de crépine cellulaire.
- Analyser 20 000 événements PECAM-1 (+) par cytométrie en flux.
6.3D Essai d’angiogenèse germée et coloration par immunofluorescence
- Au jour 9, préparer un milieu germinatif en ajoutant 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), érythropoïétine humaine recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleukine-6 humaine (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoéthanol, NEAA (1x), L-glutamine (1x), pyruvate de sodium (1x), collagène de queue de rat de type I (1,25 mg·mL-1), et NaOH (3,1 mM) à GMEM BHK-1 milieu.
- Pour éviter la gélification du collagène, maintenez le milieu de germination sur la glace jusqu’à utilisation.
- Pour évaluer l’effet des molécules pro/anti-angiogéniques, ajouter le médicament ou le véhicule sélectionné au milieu de germination à la concentration sélectionnée.
- Prélever les EB de 9 jours d’une boîte de gélose de 60 mm dans un tube conique de 15 ml (équivalent à une condition) et retirer le surnageant après quelques minutes de sédimentation.
- Couvrir le fond d’une capsule de culture de 35 mm avec 1 mL du milieu de germination et incuber à 37 °C pendant 5 min pour induire la gélification.
- Remettez les EB en suspension dans 2 mL de milieu de germination à froid.
- Transférer la suspension dans la capsule de culture de 35 mm recouverte de la première couche de milieu de germination.
- Répartissez les EB sur toute la plaque et assurez-vous qu’ils sont à égale distance les uns des autres. Incuber le plat dans un incubateur de CO2 . La première formation de germes se produit dans les 24-48 heures.
- Au jour 12, le gel de collagène contenant des EB est soigneusement transféré sur une lame de verre (75 x 26 mm) à l’aide d’une spatule.
- Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette (P1000) et déshydratez le gel en plaçant une feuille de gaze de linge en nylon et des cartes filtrantes absorbantes (papier buvard gel) sur le gel. Appliquer une pression en plaçant un poids (250 g) pendant 2 min. Retirez délicatement les papiers nylon/filtres et laissez les lames sécher à l’air libre pendant 30 min à TA.
- Lavez les lames trois fois avec PBS pendant 5 min à TA.
- Fixer les EB à l’aide d’une solution de zinc (voir tableau des matières) à 4 °C. Vous pouvez également fixer les EB fluorescents en mosaïque avec du paraformaldéhyde (PFA) (4%) o/n à 4 °C dans l’obscurité.
- Retirez le fixateur. Lavez les lames cinq fois avec PBS pendant 5 min à RT.
- Perméabiliser les EB dans du PBS contenant 0,1% de Triton-X100 pendant 15 min à TA.
- Retirer la solution de perméabilisation. Lavez les lames cinq fois avec PBS pendant 5 min.
- Incuber les EB dans le tampon bloquant (PBS avec 2% d’albumine sérique bovine, BSA) pendant 1 h à TA.
- Pour colorer les germes endothéliaux, utiliser un anticorps primaire anti-souris anti-PECAM-1 chez le rat (dilution de 1:100) dans le tampon de blocage o/n à 4 °C.
- Lavez les lames cinq fois avec PBS pendant 5 min.
- Incuber les lames avec l’anticorps secondaire anti-rat de chèvre Alexa 555 dans un tampon de blocage (dilution de 1:250) et, si nécessaire, avec un anticorps anti-α-SMA conjugué FITC dans un tampon de blocage (dilution de 1:250) pour colorer les cellules murales pendant 2 h à TA dans l’obscurité.
- Lavez les lames trois fois avec PBS pendant 5 min et une fois avec H20 avant de les monter.
7. Imagerie confocale, analyse morphométrique et quantitative des germes endothéliaux EB
- Acquérir des images haute résolution des EB immunocolorés par fusion du plan focal (empilement z) à l’aide d’un microscope confocale. Utilisez un objectif d’agrandissement 10x pour imager des EB entiers.
- Analyser les images acquises à l’aide d’ImageJ pour évaluer la morphologie et quantifier les caractéristiques des germes endothéliaux positifs PECAM-1 selon les méthodes de quantification établies13,14,21.
- Calculer le nombre moyen de germes endothéliaux par EB en comptant manuellement le nombre total de germes par EB individuel.
- Mesurez les longueurs de germination individuelles à l’aide de l’outil de dessin ImageJ. Définissez la base de la pousse endothéliale en commençant par la zone centrale EB et tracez manuellement une ligne jusqu’à l’extrémité de la pousse.
- Calculez le nombre moyen de cellules d’extrémité par germination en comptant manuellement le nombre de cellules d’extrémité par germe individuel, puis calculez la moyenne par EB.
- Calculez l’orientation des filopodia en déterminant manuellement l’axe de la pousse parente et mesurez l’angle aigu entre elles à l’aide de l’outil d’angle du logiciel ImageJ. Calculer le nombre de germes avec une orientation >50° et le diviser par le nombre total de germes de l’EB d’intérêt.
REMARQUE: Les angles allaient toujours de 0° à 90°.
- Acquérir des images haute résolution des EB immunocolorés à l’aide d’un microscope confocal. Utilisez un objectif de grossissement 40x pour réaliser des images haute résolution de pousses endothéliales uniques.
- Quantifier la couverture vasculaire des pousses EC positives PECAM-1 entourées de MC positifs α-SMA à l’aide du logiciel ImageJ.
- Divisez les images fusionnées en canaux rouges et verts distincts.
- Convertissez les images dans sa forme binaire.
- Mesurer la surface cellulaire totale de la pousse occupée séparément par PECAM-1 (cellules endothéliales marquées en rouge) et par α-SMA (cellules murales marquées en vert) positives.
- Générez l’image fusionnée à l’aide de la fonction calculatrice d’images et de l’opérateur ET. Mesurez la surface cellulaire totale de l’image. Pour calculer la couverture, divisez la surface de l’image colocalisée par la surface de l’image binaire PECAM-1.
- Pour analyser la compétition cellulaire pour la position des cellules endothéliales de pointe / tige des germes développés par les EB mosaïques, notez manuellement le nombre de cellules de pointe et marquez leur origine génotypique en fonction du signal de fluorescence. Calculer les valeurs moyennes par EB.
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Representative Results
L’aperçu du protocole du test de germination des vaisseaux sanguins est présenté à la figure 1. Des EB âgés de neuf jours dérivés de trois lignées indépendantes de CSEm 129 / Ola (Z/Red, R1 et E14) ont été dissociés enzymatiquement en cellules individuelles à l’aide de collagénase A. Les cellules ont été colorées pour PECAM-1 et analysées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) comme décrit. Toutes les lignées cellulaires présentaient une différenciation endothéliale robuste, et aucune différence dans leur capacité à se différencier en cellules endothéliales n’a été observée. Toutes les lignées cellulaires ont produit environ 10,5 % ± 1,3 % des cellules endothéliales (Figure 2A). Les niveaux d’expression relative des marqueurs cellulaires endotélial PAN dans les populations de cellules PECAM-1 (+) ont également été quantifiés. Les niveaux d’expression de l’ARNm de tous les marqueurs analysés (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 et Cdh5) étaient comparables entre les lignées cellulaires et les expériences, confirmant la robustesse du protocole de différenciation (Figure 2B). Les populations de cellules PECAM-1 (+) n’ont exprimé que de très faibles niveaux d’ARNm de marqueurs artériels (Notch1 et Efnb2) ou veineux (Couptf2 et Ephb4) soutenant l’état relativement immature des cellules endothéliales générées par le protocole (Figure 2C).
La capacité du modèle EB à germination vasculaire à dépister des médicaments modulant l’angiogenèse a ensuite été démontrée (Figure 3). Le DC101 et le DAPT (N-[N-(3,5-difluorophénacétyl)-Lalanyl]-S-phénylglycine t-butylester) ont été testés. Ces composés sont largement utilisés chez la souris pour respectivement bloquer l’angiogenèse en inhibant l’activité du VEGFR2 ou pour favoriser la différenciation des cellules de la pointe endothéliale et la formation d’un plexus vasculaire dense en ciblant la signalisation Notch (Figure 3A). Les voies de signalisation VEGF et Notch sont des régulateurs clés de l’angiogenèse germée in vivo. Les effets de diverses concentrations de DC101 et de DAPT dans les EB plaqués dans le collagène I ont été évalués. Fortes doses de DC101 allant de 6 à 30 mg· L-1 inhibait à la fois le nombre et la longueur des germes vasculaires tandis que le DAPT avait des effets opposés à la dose de 1 μmol· L-1 (figure 3B-C). Des images à fort grossissement des germes de vaisseaux colorés pour PECAM-1 de EB cultivés en présence de DAPT sont également fournies (Figure 3D). DAPT même à faibles doses allant de 0,5 à 1 μmol· L-1 a fortement augmenté le nombre de cellules de l’extrémité endothéliale avec des germes de vaisseaux qui avaient un phénotype erroné (Figure 3D-F). Une dose élevée de DAPT a également entraîné une coalescence des vaisseaux et la formation de zones cellulaires endothéliales grandes et plates sans organisation (Figure 3A). Les résultats ont confirmé la capacité du modèle à tester des médicaments qui favorisent ou inhibent l’angiogenèse.
Pour confirmer que ce modèle est adapté à l’imitation des maladies vasculaires, les images confocales des EB dérivées des CSEm Acvrl1+/- sont fournies. Le gène Acvrl1 code pour ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), un récepteur spécifiquement exprimé dans les cellules endothéliales qui, s’il est muté, est responsable du développement d’une maladie vasculaire rare avec angiodysplasie appelée télangiectasie hémorragique héréditaire (HHT). Une image à fort grossissement des pousses endothéliales Acvrl1+/- a révélé qu’elles avaient plus de cellules endothéliales et plus de branches par germe qui étaient à des angles aléatoires par rapport aux vaisseaux parents. Ceux-ci ont confirmé in vitro un phénotype erroné tel qu’observé chez les souris HHT (Figure 4).
En formant des EB chimériques contenant des CSEm différenciés marqués par fluorescence et des CSEm d’un génotype particulier, un protocole alternatif pour étudier le processus de sélection de l’extrémité endothéliale est inclus (Figure 5A-C). Une image confocale de germes de vaisseaux marqués PECAM-1 a identifié l’origine génotypique des principales cellules de l’extrémité endothéliale (Figure 5B). Les mélanges d’une lignée de CSEm de type YFP (protéine fluorescente jaune) de type sauvage à un rapport de 1:1 avec une lignée de type sauvage de CSEm non marquée ont systématiquement conduit à la contribution égale de chaque population aux principales cellules de l’extrémité endothéliale (Figure 5C).
Ce protocole convient également pour quantifier la couverture cellulaire murale de la germe du vaisseau. Les EB qui subissent une angiogenèse ont été fixés et colorés pour PECAM-1 (cellules endothéliales, rouge) et pour l’actine α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) (cellules murales, vert) (Figure 5D). Une image à fort grossissement a révélé comment une pousse de vaisseau individuelle était entourée de cellules murales (figure 5E, à gauche). Une transformation binaire a été réalisée après séparation du canal de couleur (Figure F-G) pour quantifier le rapport du vaisseau PECAM-1 (+) recouvert de cellules murales α-SMA (+) à l’aide du logiciel ImageJ (Figure 5H).
Figure 1 : Chronologie des procédures protocolaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation des CE dérivées de la différenciation vasculaire des CSEm à l’intérieur des EB. (A) Analyse cytométrique en flux de l’expression de CD31 à partir d’EB âgés de 9 jours et quantification du pourcentage de cellules Pecam-1 (+). (B-D) niveaux d’expression de l’ARNm de Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 et EphB4 dans des cellules endothéliales triées provenant d’EB âgés de 9 jours. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± l’erreur-type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Essai d’angiogenèse germée en 3D pour les tests de médicaments. (A) Images confocales de trois EB représentatifs colorées pour Pecam-1 (cellules endothéliales blanches) traitées avec véhicule seul, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) ou DC101 (3 mg· L-1, 6 mg· L-1, 30 mg· L-1). B) Quantification du nombre de germes par EB. (C) Quantification de la longueur de germination. (D) Sur le panneau supérieur gauche, fort grossissement de la pousse endothéliale montrant la complexité du réseau et le point de branche comptant sur deux couches différentes du même EB, sur le panneau inférieur gauche une illustration schématique représentant la méthode de mesure de l’orientation des germes endothéliaux. Sur le panneau supérieur droit, fort grossissement des germes endothéliaux du véhicule seul et sur le panneau inférieur droit, fort grossissement des germes endothéliaux du DAPT (0,5 μmol· L-1) condition. (E) Quantification du nombre de cellules d’extrémité par germe. F) Quantification du pourcentage de filopodia sous un angle >50°. Toutes les barres représentent les valeurs moyennes ± MEB et p du test ANOVA unidirectionnel non apparié. ns = non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Germination de vaisseaux défectueux dans les EB héréditaires de télangiectasie hémorragique. Sur le panneau supérieur, des images confocales d’EB représentatifs âgés de 12 jours des génotypes Acvrl1+/+ et Acvrl1+/- colorés pour Pecam-1 (cellules endothéliales blanches). Sur le panneau inférieur, fort grossissement des germes endothéliaux Acvrl1+/- (boîte blanche du panneau supérieur) montrant de nombreuses cellules de pointe (flèches rouges), des points de branche endothéliale (points bleus) et un phénotype d’égarement germé (flèches vertes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Étude de la position des cellules de pointe/tige et de la maturation des vaisseaux à l’aide du test de germination 3D. (A) Image confocale d’une EB chimérique représentative de 12 jours fabriquée à partir d’une lignée cellulaire de type sauvage R1 mélangée 1:1 avec une lignée cellulaire de type sauvage 7ACS/EYFP colorée pour Pecam-1 (cellules endothéliales rouges). Les flèches rouges indiquent les cellules de pointe de la lignée cellulaire R1 et les flèches vertes indiquent les cellules de pointe de la lignée cellulaire 7ACS / EYFP. (B) Grossissement élevé d’une pousse endothéliale montrant la distribution des cellules endothéliales R1 et 7ACS/EYFP le long de la pousse. (C) Quantification des cellules de pointe de génotypage relatives provenant d’EB représentatifs de type sauvage. (D) Image confocale d’un EB représentatif de 12 jours coloré pour Pecam-1 (rouge, cellules endothéliales) et α-SMA (vert, cellules murales). (E) Grossissement élevé d’une pousse endothéliale (boîte rectangulaire blanche en pointillés de D) montrant l’interaction entre les cellules murales et endothéliales. (F-G) Images de la pousse endothéliale colorée et de leurs images transformées binaires associées. (H) Image binaire de la coloration co-localisée de Pecam-1 et α-SMA. Ratio de germes de cellules endothéliales recouverts de cellules murales. Toutes les barres représentent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit un test de germination vasculaire 3D basé sur EB en 3D impartial, robuste et reproductible, qui se prête au criblage de médicaments et de gènes modulant l’angiogenèse. Cette méthode offre des avantages par rapport à de nombreux tests bidimensionnels (2D) largement utilisés utilisant des cultures de cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) pour surveiller la migration (test de rayures latérales ou le test de chambre de Boyden)22,23 ou la prolifération (comptage du nombre de cellules, détection de la synthèse de l’ADN, détection de marqueurs de prolifération ou tests métaboliques)24 En ce sens qu’il permet de manière unique l’étude de la différenciation des cellules endothéliales et murales et de leur organisation en un réseau vasculaire imitant les étapes clés de l’angiogenèse germinative. Ces étapes comprennent la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale, la prolifération des cellules de la tige, l’orientation spatiale et la migration de la germe du vaisseau, et le recrutement de cellules murales dans le vaisseau sanguin naissant25. Il offre également des avantages à de nombreux modèles d’angiogenèse 3D. Le dosage de la bille de fibrine 26,27 ou du gel de collagène28,29,30 imitant la tubulogenèse utilise couramment des HUVECs ou des cellules endothéliales dérivéesde cellules endothéliales formant des colonies (ECFC-EC) car elles ont un taux de prolifération élevé mais ne conviennent pas aux cellules endothéliales primaires de souris difficiles à maintenir en culture. Le test ex vivo de l’explant de rétine31 ou du micro-organe vascularisé32 peut bien récapituler toutes les étapes de formation des vaisseaux sanguins, mais ils ont des procédures expérimentales complexes et ne conviennent pas au criblage médicamenteux ou génétique à haut débit. Cela est également vrai pour le test ex vivo de l’anneau aortique 33,34 et pour de nombreux tests in vivo tels que les études de tumeur implantées chez la souris ou les études de perte de fonction chez la souris qui ont souvent un coût élevé et des difficultés à obtenir une grande quantité de données 35. Ce protocole complète également bien les tests similaires d’angiogenèse in vitro utilisant des CSPi humaines permettant des comparaisons entre les données de souris et humaines. Bien qu’il soit important de noter que les cellules endothéliales humaines dérivées de l’iPSC montrent moins de capacité à germer que les cellules de souris36,37.
La méthode développée ici a également quelques limites. Il ne peut pas évaluer les effets de l’écoulement des fluides sur la maturation des vaisseaux sanguins, la perméabilité des vaisseaux et ne produit pas de vaisseaux sanguins naissants dans un environnement tissulaire spécifique par rapport aux dispositifs microfabriqués récents qui sont en cours de développement. En effet, les technologies d’organes sur puce qui combinent la microfluidique avec l’ingénierie tissulaire peuvent fournir aux cellules endothéliales cultivées un microenvironnement similaire à celui in vivo38,39. Les systèmes microfluidiques contiennent la composition correcte de la matrice extracellulaire et sont conçus pour produire des signaux mécaniques tels que la contrainte de cisaillement. Certains sont conçus pour incorporer des cellules murales et d’autres cellules de soutien d’un tissu donné ou peuvent générer des gradients chimiques. Ils contiennent des réseaux de canaux remplis de fluide à l’échelle du micron qui sont similaires en taille et en structure aux capillaires sanguins. Les technologies d’organe sur puce permettent également de quantifier des fonctions vasculaires spécifiques, y compris la perméabilité et la résistance électrique transendothéliale. Bien que les technologies des organes sur puce soient prometteuses, elles dépassent de loin l’expertise en recherche de la plupart des laboratoires de biologie, nécessitent encore une normalisation appropriée et nécessitent des techniques de fabrication spécialisées. La commercialisation de la fabrication de la technologie des organes sur puce ne fait que commencer, et ces systèmes sont considérés comme prohibitifs en termes de coût et de temps pour les sociétés pharmaceutiques à l’heure actuelle40,41.
Plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte. Utilisez des cellules de haute qualité qui expriment de manière robuste les marqueurs bien acceptés (Nanog, Oct4, Sox2 et SSEA-1) de l’état pluripotent. Il est essentiel de surveiller attentivement leur croissance, la forme des cellules mES, ainsi que la taille et la morphologie des colonies de mES. Comme la stabilité caryotypique est stochastique dans les cellules en culture, il est essentiel de la réévaluer après un passage prolongé. Il est recommandé d’utiliser des produits déjà testés pour la culture de CSEm et de tester les mangeoires de MEF, le sérum de veau fœtal et tous les composés chimiques pendant plusieurs passages afin de détecter si les CSEm conservent leurs propriétés cellulaires ou s’ils différencient ou acquièrent un phénotype épiblastique. Le milieu doit être rafraîchi quotidiennement et les colonies de CSEm ne doivent pas devenir trop grandes et denses. Enfin, les CSEm doivent être cultivées au moins pendant deux passages sans 2i avant la différenciation pour assurer le meilleur rendement des cellules endothéliales.
La différenciation endothéliale comprend deux étapes importantes : la formation des EB par la méthode de la goutte suspendue et leur culture en conditions flottantes en présence d’un milieu de différenciation vasculaire13,14. Le mouvement des boîtes suspendues doit être minimisé pour obtenir une agrégation uniforme des cellules. Le nombre de CSEm utilisées pour former un agrégat dans la plupart des cas, varie entre 800 et 1 000 cellules, mais il peut être nécessaire de l’optimiser si les CSEm ont un bagage génétique différent de 129/ola pour assurer une différenciation optimale en EB vascularisés. Lorsqu’ils sont cultivés dans des conditions flottantes, les EB doivent être soigneusement répartis et éviter les mouvements qui favorisent l’agglutination des EB.
Les EB sont finalement cultivés dans un gel de collagène I pour former des germes de vaisseaux. Le milieu angiogénique doit être fraîchement préparé et une fois mélangé avec du collagène, je dois être maintenu sur de la glace pour éviter la gélification spontanée. En cas de test de drogue, les médicaments sont ajoutés dans le mélange froid à la bonne concentration au cours de cette étape. Ajuster le pH avec NaOH avant de remettre en suspension les EB est crucial, sinon l’acidité du collagène entraînera une toxicité cellulaire. Enfin, les EB doivent être répartis à égale distance les uns des autres pour assurer des résultats reproductibles.
En conclusion, cette méthode introduit un test de germination vasculaire 3D basé sur mESC qui a la robustesse et l’évolutivité requises pour être utilisé pour le dépistage génétique comme récemment décrit par Elling U. et al. qui a généré une grande banque d’haplobank de mESC16 mutant hémi/homozygote et pour le programme de découverte phénotypique de médicaments.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), du Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND et de l’Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
- Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
- Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
- Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
- Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
- Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
- Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
- Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G.
- Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
- Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
- van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
- Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
- Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
- Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
- Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
- Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
- Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
- Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
- Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17 (2020).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
