Summary
Denne analysen benytter musembryonale stamceller differensiert i embryoidlegemer dyrket i 3D-kollagengel for å analysere de biologiske prosessene som styrer spirende angiogenese in vitro. Teknikken kan brukes til å teste medisiner, modellere sykdommer, og for å studere spesifikke gener i sammenheng med delesjoner som er embryonisk dødelige.
Abstract
Nylige fremskritt innen induserte pluripotente stamceller (iPSC) og genredigeringsteknologier muliggjør utvikling av nye humane cellebaserte sykdomsmodeller for fenotypisk legemiddeloppdagelse (PDD) -programmer. Selv om disse nye enhetene kunne forutsi sikkerheten og effekten av undersøkelsesmedisiner hos mennesker mer nøyaktig, er deres utvikling til klinikken fortsatt sterkt avhengig av pattedyrdata, særlig bruk av musesykdomsmodeller. Parallelt med humane organoide eller organ-on-chip sykdomsmodeller, er utviklingen av relevante in vitro musemodeller derfor et udekket behov for å evaluere direkte legemiddeleffekt og sikkerhetssammenligninger mellom arter og in vivo og in vitro forhold . Her beskrives en vaskulær spiringsanalyse som benytter museembryonale stamceller differensiert i embryoidlegemer (EB). Vaskulariserte EBer dyrket på 3D-kollagen gel utvikler nye blodkar som ekspanderer, en prosess som kalles spirende angiogenese. Denne modellen rekapitulerer viktige trekk ved in vivo spirende angiogenesedannelse av blodkar fra et eksisterende vaskulært nettverk - inkludert endotelcellevalg, endotelcellemigrasjon og proliferasjon, celleveiledning, rørdannelse og rekruttering av veggmalericeller. Det er egnet til screening for legemidler og gener som modulerer angiogenese og viser likheter med nylig beskrevne tredimensjonale (3D) vaskulære analyser basert på humane iPSC-teknologier.
Introduction
I de siste tre tiårene har målbasert legemiddeloppdagelse (TDD) vært mye brukt i legemiddelforskning av farmasøytisk industri. TDD inkorporerer et definert molekylært mål som spiller en viktig rolle i en sykdom og er avhengig av utvikling av relativt enkle cellekultursystemer og avlesninger for legemiddelscreening1. De fleste typiske sykdomsmodeller som brukes i TDD-programmer inkluderer tradisjonelle cellekulturmetoder som kreftceller eller immortaliserte cellelinjer dyrket i kunstige miljøer og ikke-fysiologiske substrater. Selv om mange av disse modellene har gitt levedyktige verktøy for å identifisere vellykkede legemiddelkandidater, kan bruken av slike systemer være tvilsom på grunn av deres dårlige sykdomsrelevans2.
For de fleste sykdommer er de underliggende mekanismene faktisk komplekse, og forskjellige celletyper, uavhengige signalveier og flere sett med gener er ofte funnet å bidra til en bestemt sykdomsfenotype. Dette gjelder også for arvelige sykdommer der den primære årsaken er en mutasjon i ett enkelt gen. Med den nylige adventen av humaninduserte pluripotente stamcelleteknologier (iPSC) og genredigeringsverktøy, er det nå mulig å generere 3D-organoider og organ-on-chip sykdomsmodeller som bedre kan rekapitulere in vivo menneskelig kompleksitet 3,4. Utviklingen av slike teknologier er forbundet med en gjenoppblomstring i interessen for fenotypisk legemiddeloppdagelse (PDD) -programmer1. PDD kan sammenlignes med empirisk screening, da de ikke er avhengige av kunnskap om identiteten til et bestemt legemiddelmål eller en hypotese om dens rolle i sykdom. PDD-tilnærmingen er nå i økende grad anerkjent for å sterkt bidra til oppdagelsen av førsteklasses medisiner5. Fordi utviklingen av humane organoid- og organ-on-chip-teknologier fortsatt er i sin barndom, forventes det at iPSC-modeller (supplert med innovative bildebehandlings- og maskinlæringsverktøy6,7) i nær fremtid vil gi flere nye komplekse cellebaserte sykdomsmodeller for narkotikascreening og tilhørende PDD-programmer for å overvinne den dårlige produktiviteten til TDD-tilnærmingen8, 9.
Mens humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan gi viktig innsikt i sykdomskompleksitet og identifisering av nye legemidler, er det å bringe medisiner inn i ny klinisk praksis også sterkt avhengig av data fra dyremodeller for å vurdere deres effekt og sikkerhet. Blant dem er genmodifiserte mus absolutt de mest foretrukne pattedyrmodellene. De har mange fordeler da de har en relativt kort generasjonstid for pattedyr, har mange lignende fenotyper til menneskelige sykdommer, og kan lett genetisk manipuleres. De er derfor mye brukt i narkotikaoppdagelsesprogrammer10. Å bygge bro mellom mus og mennesker er imidlertid fortsatt en viktig utfordring11. Utviklingen av in vitro musemodeller tilsvarende humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan i det minste delvis fylle dette gapet, da det vil muliggjøre direkte sammenligning av legemiddeleffekt og sikkerhet mellom in vivo mus og in vitro humane data.
Her beskrives en vaskulær spiringsanalyse i museembryoidlegemer (EB). Blodkar består av endotelceller (indre foring av karvegger), veggmalericeller (vaskulære glatte muskelceller og pericytter)12. Denne protokollen er basert på differensiering av musembryonale stamceller (mESC) til vaskulariserte EBer ved bruk av hengende dråper som rekapitulerer de novo endotelcelle- og veggmalericelledifferensiering13,14. Mus ESC kan enkelt etableres i kultur fra isolert dag 3.5 mus blastocyster med forskjellig genetisk bakgrunn15. De gir også muligheter for klonal analyse, avstamningssporing, og kan lett genetisk manipuleres for å generere sykdomsmodeller13,16.
Siden blodkar nærer alle organer, er det ikke overraskende at mange sykdommer, om ikke alle, er forbundet med endringer i mikrovaskulaturen. Under patologiske forhold kan endotelceller vedta en aktivert tilstand eller bli dysfunksjonelle, noe som resulterer i veggmalericelledød eller migrasjon bort fra blodkar. Disse kan resultere i overdreven angiogenese eller i karets sjeldenhet, kan indusere unormal blodstrøm og defekt blodkarbarriere som fører til ekstravasasjon av immunceller og betennelse12,17,18,19. Forskning for utvikling av medikamentmodulerende blodkar er derfor høy, og flere molekylære aktører og konsepter er allerede identifisert for terapeutisk målretting. I denne sammenheng er den beskrevne protokollen spesielt egnet for å bygge sykdomsmodeller og for narkotikatesting, da den rekapitulerer viktige trekk ved in vivo spirende angiogenese, inkludert endotelspiss og stengelcellevalg, endotelcellemigrasjon og proliferasjon, endotelcelleveiledning, rørdannelse og rekruttering av veggmalericeller. Det viser også likheter med nylig beskrevne 3D vaskulære analyser basert på humane iPSC-teknologier20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medieforberedelse og kultur av mESC
- Forbered betinget medium +/- (CM +//-) ved hjelp av supplement 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium med 10% (vol / vol) varmeinaktivert Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanol, 1x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat.
- Klargjør betinget medium +/+ (CM+/+) ved bruk av tilskuddet CM+/- medium med leukemihemmende faktor (LIF) (1 500 U/ml) og 0,1 mM β-merkaptoetanol.
- Forbered betinget medium +/+ i nærvær av to hemmere (CM+/+ 2i) ved bruk av tilskuddet CM+/+ medium med 1 μM PD0325901 og 3 μM CHIR99021.
- Forbered 0,1% gelatinoppløsning ved å blande 25 ml forvarmet 2% gelatinoppløsning i 500 ml fosfatbufret saltvann uten kalsium og magnesium (DPBS).
- Forbered 10x Trypsin Versene fosfat (TVP 10x) buffer ved å blande Trypsin (2,5%) med TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% kyllingserum, 0,01% trypsin (2,5%) i H2O) (1:10 forhold, vol / vol).
MERK: Filtrer alle løsningene gjennom et 0,22 μm porefilter. Oppbevar dyrkningsmediet ved -20 °C over lang tid og oppbevar andre reagenser ved 4 °C i opptil 3 uker (se Materialfortegnelse). - Belegg to 12-brønns cellekulturplater med 0,1% gelatinløsning (500 μL per brønn) og inkuber dem i 30 minutter i en CO 2 -inkubator (37 ° C, 5% CO2, fuktig atmosfære).
- Vask de gelatinbelagte platene med PBS og tilsett 500 μL CM +/- medium.
- Tine to hetteglass med 1 x 106 kryopreserverte bestrålte embryonale fibroblaster fra mus (MEF) ved 37 °C og overfør cellesuspensjonen til et konisk rør med 5 ml CM+/- medium.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Aspirer mediet og resuspender cellepelleten forsiktig i 12 ml CM +/- medium i en konsentrasjon på 1,67 x 105 celler per ml.
- Frø 500 μL MEF-suspensjon i en 12-brønns cellekulturplate (2,4 x 105 celler per cm 2) og inkuber platen over natten (o / n) i en CO2 -inkubator.
- Tine ett hetteglass med kryopreserverte mESC (1 x 106) i CM+/+ 2i medium.
- Frø mESC-suspensjonen på en forvasket 12-brønnplate med MEF-er i 1 ml CM+/+ 2i-medium og overfør platen til en CO 2-inkubator. Oppdater mediet daglig.
- Ved 70% samløp, vask mESC-koloniene med DPBS. Tilsett 150 μL varm 10x TVP-buffer og inkuber ved RT i 30 s for å initiere enzymatisk dissosiasjon.
- Fjern TVP-bufferen forsiktig, resuspender cellene i 1 ml CM+/+ 2i-medium og dissosiere koloniene til enkeltceller ved forsiktig pipettering.
- Passasje cellene ved å overføre dem til en ny 12-brønns cellekulturplate med MEFs (splittingsforhold: 1: 3-1: 5). Bland forsiktig for å distribuere cellene og inkubere i en CO2 -inkubator.
- Oppdater dyrkningsmediet (2-3 ml) og observer celleveksten/morfologien daglig. Gjenta seriepassering ved 70 % samløp hver 2. Bytt til CM + / + medium i to passasjer før du starter celledifferensiering.
2. EB-dannelse i hengende dråpe
- Forbered ferskt mesodermdifferensieringsmedium ved å supplere CM +/- mediet med basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) (50 ng · ml-1) og med benmorfogenetisk protein 4 (BMP-4) (5 ng · ml-1) og hold det ved 4 ° C til bruk.
- Belegg en brønn av 6-brønns cellekulturplaten med 500 μL 0,1% gelatinløsning og legg den i en CO2 -inkubator i 30 minutter.
- Vask de gelatinbelagte platene med PBS og tilsett 500 μL CM +/- medium.
- For å oppnå en ren populasjon av mESC, trypsiniser cellekulturplaten med 10x TVP-buffer i 30 s ved RT, resuspender cellene i 1 ml mesodermdifferensieringsmedium og overfør dem deretter til den gelatinbelagte 6-brønnsplaten i 30 minutter, slik at MEF-ene kan festes mens mESC-ene forblir i suspensjon.
- Samle cellesuspensjonen i et 50 ml konisk rør og tell cellene ved hjelp av et Neubauer hemocytometer og Trypan blått fargestoff for en levende / død celle utelukkelse.
- Sentrifuge cellene ved 200 x g i 5 minutter ved RT. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i mesodermdifferensieringsmedium for å nå 4,55 x 104 celler per ml.
- Fyll bunnen av 94 mm isoporfat med lavt feste med 15 ml sterilt vann.
MERK: Fire retter som inneholder hengende dråper (1,6 x 105 celler i 3,52 ml medium) vil være nødvendig for å teste en bestemt tilstand ved hjelp av 3D-spirende angiogeneseanalyse. - Overfør cellesuspensjonen til et sterilt plastreservoar og last fire posisjoner av en flerkanalspipett med 22 μL cellesuspensjon per kanal (1 x 103 celler per 22 μL dråpe).
- Løft og snu lokket på 94 mm-fatet og plasser det på den rene overflaten av strømningskabinettet med innsiden vendt oppover.
- Sett inn 40 dråper cellesuspensjon på den indre overflaten av hvert lokk. Snu lokket forsiktig uten forstyrrelser og legg det tilbake på fatet, slik at dråpene vender mot vannet.
- Inkubere oppvasken i en CO2 -inkubator. Betrakt dette som differensieringsdag 0. Vedlikehold platene i 4 dager for å danne EB.
3. Konkurranseanalyse for spisscelleposisjonen
- Dyrkning én fluorescerende og én ikke-fluorescerende mESC-linje som tidligere beskrevet13. Som et eksempel brukes 7ACS / EYFP mESCs merket i gult og R1 mESCs.
- Forbered mosaikk-EB-er ved å blande like mengder av de to mESC-linjene (1:1-forhold) og inkuber de hengende dråpefatene i en CO 2-inkubator som beskrevet i trinn2 .
4. Flytende EB-kultur for vaskulær differensiering
- Før du samler EB fra de hengende dråpene, må du forberede følgende.
- Tilbered 5 % agaroppløsning i H2O og steriliser den ved autoklavering (20 min ved 120 °C).
- Bruk den varme 5% agarløsningen til å tilberede G-MEM BHK-21 medium inneholdende 1% agar og hell raskt 3 ml i en av 60 mm polystyrenfatene. La agaren stivne i 1 time ved RT. Oppbevar oppvasken ved 4 °C til bruk.
- Forbered ferskt 2x vaskulært differensieringsmedium ved å supplere CM+/- mediet med bFGF (100 ng·mL-1) og VEGF-A (50 ng·mL-1). Oppbevar mediet ved 4 °C til bruk.
- Samle de hengende dråpene i et 15 ml konisk rør ved hjelp av en P1000-pipette og fjern supernatanten etter noen minutter med EB-sedimentering.
- Resuspender EB i 3 ml 2x vaskulært differensieringsmedium, overfør EB-suspensjonen til en agarbelagt dishand fordel EBene homogent for å unngå aggregering.
- Inkuber oppvasken i CO 2 -inkubator og oppdater mediet hver2. dag til dag 9 ved bruk av 1x vaskulært differensieringsmedium i nærvær av bFGF (50 ng · ml-1) og VEGF-A (25 ng · ml-1).
- Alternativt kan du legge til blodplateavledet vekstfaktor-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 på dag 4 og 5 ng·mL-1 på dag 6 og dag 8) til det vaskulære differensieringsmediet for å fremme veggmalericelledifferensiering.
5. Analyse av flowcytometri
- Samle de 9 dager gamle EB-ene i et 15 ml konisk rør ved hjelp av en P1000-pipette og vask dem én gang med varm PBS.
- Tilsett 1 ml G-MEM BHK-21 medium inneholdende 0,2 mg·ml-1 kollagenase A og inkuber cellene i en CO2 -inkubator i 5 minutter.
- Fjern sosisieringen av EB-ene ved å pipettere forsiktig opp og ned med en P1000-pipette.
- Stopp kollagenaseaktiviteten ved å tilsette 1 ml kaldt G-MEM BHK-21 medium med 10% FBS.
- Sentrifuge cellene ved 200 x g i 5 min ved RT.
- Resuspender cellene i 500 μL PBS med 2% FBS.
- Telle cellene ved hjelp av en Neubauer hemocytometer.
- Resuspender 400 000 celler i 100 μL PBS med 2% FBS per fargetilstand.
- Inkuber cellene i 45 minutter ved 4 °C med følgende antistoffer: APC konjugert rotte anti-mus PECAM-1 antistoff (klon MEC13.3) og FITC konjugert rotte anti-mus CD45 (klon 30-F11) eller isotype kontroll antistoffer.
- Vask cellene to ganger med 1 ml PBS inneholdende 2% FBS.
- Resuspender cellene for å nå en endelig konsentrasjon på 5 x 106 celler per ml.
- Filtrer cellene ved hjelp av en rund bunn polystyren reagensrør, med en celle sil snap cap.
- Analyser 20 000 PECAM-1 (+)-hendelser ved hjelp av flowcytometri.
6.3D spirende angiogeneseanalyse og immunfluorescensfarging
- På dag 9 klargjør du et spiremedium ved å tilsette 10 % FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), humant rekombinant erytropoietin (hEPO) (20 ng·mL-1), humant interleukin-6 (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-merkaptoetanol, NEAA (1x), L-glutamin (1x), natriumpyruvat (1x), type I kollagen fra rottehale (1,25 mg·mL-1), og NaOH (3,1 mM) til GMEM BHK-1 medium.
- For å unngå kollagengelering, hold spiremediet på is til bruk.
- For å evaluere effekten av pro / anti-angiogene molekyler, tilsett det valgte stoffet eller kjøretøyet til spiremediet ved den valgte konsentrasjonen.
- Samle 9 dager gamle EB-er fra en 60 mm agarfat i et 15 ml konisk rør (tilsvarende en tilstand) og fjern supernatanten etter noen minutters sedimentering.
- Dekk bunnen av en 35 mm kulturfat med 1 ml av spiremediet og rug ved 37 °C i 5 minutter for å indusere gelering.
- Bl.a. resuspender EB i 2 ml kaldt spirende medium.
- Overfør suspensjonen til 35 mm kulturfat belagt med det første laget av spirende medium.
- Fordel EB-ene over hele tallerkenen og sørg for at de er i lik avstand fra hverandre. Inkuber parabolen i en CO2 -inkubator. Den første spireformasjonen skjer innen 24-48 timer.
- På dag 12 overføres kollagengelen som inneholder EB forsiktig til et glassglass (75 x 26 mm) ved hjelp av en slikkepott.
- Fjern overflødig væske med en pipette (P1000) og dehydrer gelen ved å legge et gasbind av nylonlin og absorberende filterkort (gelblottingspapir) på toppen av gelen. Påfør trykk ved å plassere en vekt (250 g) i 2 minutter. Fjern forsiktig nylon-/filterpapirene og la lysbildene lufttørke i 30 minutter ved RT.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS i 5 min på RT.
- Fest EBene ved hjelp av sinkoppløsning (se Materialfortegnelse) o/n ved 4 °C. Alternativt kan du feste mosaikkfluorescerende EB med paraformaldehyd (PFA) (4 %) o/n ved 4 °C i mørket.
- Fjern fikseringsmiddelet. Vask lysbildene fem ganger med PBS i 5 min på RT.
- Permeabilisere EBs i PBS inneholdende 0,1% Triton-X100 i 15 min ved RT.
- Fjern permeabiliseringsoppløsningen. Vask lysbildene fem ganger med PBS i 5 min.
- Inkuber EBs i blokkeringsbufferen (PBS med 2% Bovine Serum Albumin, BSA) i 1 time ved RT.
- For å flekke endotelspirene, bruk et rotte anti-mus anti-PECAM-1 primært antistoff (1:100 fortynning) i blokkering av buffer o / n ved 4 ° C.
- Vask lysbildene fem ganger med PBS i 5 min.
- Inkuber lysbildene med geit anti-rotte Alexa 555 sekundært antistoff i blokkeringsbuffer (1:250 fortynning) og når det er nødvendig, med FITC-konjugert anti-α-SMA antistoff i blokkeringsbuffer (1:250 fortynning) for å flekke veggmalericeller i 2 timer ved RT i mørket.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS i 5 min og en gang med H20 før du monterer dem.
7. Konfokal avbildning, morfometrisk og kvantitativ analyse av EB endotelspirer
- Skaff høyoppløselige bilder av immunfargede EBs ved fokalplansammenslåing (z-stabling) ved hjelp av et konfokalmikroskop. Bruk 10x forstørrelse objektiv til bilde hele EBs.
- Analysere bildene som er oppnådd ved hjelp av ImageJ for å evaluere morfologien og kvantifisere egenskapene til PECAM-1 positive endotelspirer i henhold til etablerte kvantifiseringsmetoder13,14,21.
- Beregn gjennomsnittlig antall endotelspirer per EB ved å telle det totale spireantallet manuelt per individuelle EB.
- Mål de individuelle spirelengdene ved hjelp av tegneverktøyet ImageJ. Definer basen av endotelspiren som starter ved EB-kjerneområdet og tegn en linje manuelt til spirespissen slutter.
- Beregn gjennomsnittlig antall spissceller per spire ved å telle antall spissceller manuelt per individuelle spire og beregn deretter gjennomsnittet per EB.
- Beregn filopodiretningen ved å bestemme aksen til foreldrespiren manuelt og måle den akutte vinkelen mellom dem ved hjelp av ImageJ-programvarevinkelverktøyet. Beregn antall spirer med en orientering >50° og del den med det totale antall spirer av EB av interesse.
MERK: Vinklene varierte alltid fra 0 ° til 90 °.
- Skaff høyoppløselige bilder av immunfarget EB ved hjelp av et konfokalmikroskop. Bruk 40x forstørrelsesmål for å realisere høyoppløselige bilder av enkle endotelspirer.
- Kvantifiser fartøyets dekning av PECAM-1 positive EC-spirer omgitt av α-SMA-positive MC-er ved hjelp av ImageJ-programvaren.
- Del de sammenslåtte bildene i separate røde og grønne kanaler.
- Konverter bildene til binær form.
- Mål det totale cellulære området av spiren okkupert separat av PECAM-1 (endotelceller merket i rødt) og av α-SMA (veggmalericeller merket i grønne) positive celler.
- Generer det sammenslåtte bildet ved hjelp av bildekalkulatorfunksjonen og AND-operatoren. Mål det totale celleområdet i bildet. For å beregne dekningen, del arealet av det kolokaliserte bildet med området av PECAM-1 binært bilde.
- For å analysere cellekonkurransen om endotelspiss / stengelcelleposisjon av spirer utviklet av mosaikk-EB, skårer du manuelt antall spissceller og markerer deres genotypiske opprinnelse basert på fluorescenssignalet. Beregn middelverdier per EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolloversikten over blodkarspiringsanalysen er vist i figur 1. Ni dager gamle EB-er avledet fra tre uavhengige 129/Ola mESC-linjer (Z/Red, R1 og E14) ble enzymatisk dissosiert til enkeltceller ved bruk av kollagenase A. Celler ble farget for PECAM-1 og analysert ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) som beskrevet. Alle cellelinjene viste robust endoteldifferensiering, og ingen forskjeller i deres evne til å differensiere til endotelceller ble observert. Alle cellelinjene produserte ca. 10,5 % ± 1,3 % endotelceller (figur 2A). De relative ekspresjonsnivåene av PAN-endoteliale cellemarkører i PECAM-1 (+) cellepopulasjoner ble også kvantifisert. mRNA-ekspresjonsnivåene for alle de analyserte markørene (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 og Cdh5) var sammenlignbare mellom cellelinjene og eksperimentene, noe som bekrefter robustheten til differensieringsprotokollen (figur 2B). PECAM-1 (+) cellepopulasjoner uttrykte bare svært lave mRNA-nivåer av arterielle (Notch1 og Efnb2) eller venøse (Couptf2 og Ephb4) markører som støtter den relativt umodne tilstanden til endotelcellene som ble generert av protokollen (figur 2C).
Den vaskulære spirende EB-modellens evne til å screene for medikamenter som modulerer angiogenese ble deretter demonstrert (figur 3). DC101 og DAPT (N-[N-(3,5-difluorfenacetyl)-Lalanyl]-S-fenylglycin t-butylester) ble testet. Disse forbindelsene er mye brukt hos mus for henholdsvis å blokkere angiogenese ved å hemme VEGFR2-aktivitet eller for å fremme endotelcelledifferensiering og dannelsen av en tett vaskulær plexus ved å målrette Notch-signalering (figur 3A). Både VEGF og Notch signalveier er viktige regulatorer for spirende angiogenese in vivo. Effekten av ulike konsentrasjoner av DC101 og DAPT i EB belagt med kollagen I ble evaluert. Høye doser DC101 fra 6-30 mg· L-1 hemmet både antall og lengde på karspirene, mens DAPT hadde motsatte effekter ved dosen på 1 μmol· L-1 (figur 3B-C). Bilder med høy forstørrelse av karspirene farget for PECAM-1 av EBs dyrket i nærvær av DAPT er også gitt (figur 3D). DAPT selv ved lave doser fra 0,5-1 μmol· L-1 økte kraftig antall endotelspissceller med karspirer som hadde en misvisende fenotype (figur 3D-F). Høy dose DAPT førte også til karkoalesens og dannelse av store og flate endotelcelleområder uten organisering (figur 3A). Resultatene bekreftet modellens evne til å teste legemidler som enten fremmer eller hemmer angiogenese.
For å bekrefte at denne modellen er egnet for å etterligne vaskulære sykdommer, er konfokale bilder av EB avledet fra Acvrl1 +/- mESC gitt. Acvrl1-genet koder for ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), en reseptor spesifikt uttrykt i endotelceller som, hvis mutert, er ansvarlig for utviklingen av en vaskulær sjelden sykdom med angiodysplasi kalt arvelig hemoragisk telangiektasi (HHT). Et høyt forstørrelsesbilde av Acvrl1+/- endotelspirene viste at de hadde flere endotelspissceller og flere grener per spire som var i tilfeldige vinkler i forhold til foreldrekarene. Disse bekreftet in vitro en misvisende fenotype som observert hos HHT-mus (figur 4).
Ved å danne kimære EB-er som inneholder differensiert mESC fluorescerende merket og mESC av en bestemt genotype, er en alternativ protokoll for å studere prosessen med endotelspissvalg inkludert (figur 5A-C). Et konfokalt bilde av PECAM-1-merkede karspirer identifiserte den genotypiske opprinnelsen til de ledende endotelspisscellene (figur 5B). Blandinger av en villtype YFP (gult fluorescerende protein) mESC-linje i forholdet 1: 1 med en umerket mESC villtypelinje førte konsekvent til det samme bidraget fra hver populasjon til de ledende endotelspisscellene (figur 5C).
Denne protokollen er også egnet for å kvantifisere veggmalericelledekning av fartøyspiren. EB som gjennomgår angiogenese ble fiksert og farget for PECAM-1 (endotelceller, rød) og for α-glatt muskelaktin (α-SMA) (veggmalericeller, grønn) (figur 5D). Et bilde med høy forstørrelse avslørte hvordan en enkelt karspire var omgitt av veggmalericeller (figur 5E, til venstre). Binær transformasjon ble utført etter fargekanalseparasjon (figur F-G) for å kvantifisere forholdet mellom PECAM-1 (+) fartøy dekket av α-SMA (+) veggmalericeller ved hjelp av ImageJ-programvaren (figur 5H).
Figur 1: Tidslinje for protokollprosedyrene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av ECs avledet fra mESC vaskulær differensiering i EB. (A) Flowcytometrisk analyse av CD31-uttrykk fra 9 dager gamle EBs og kvantifisering av prosentandelen av Pecam-1 (+) celler. (B-D) mRNA-ekspresjonsnivåer av Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 og EphB4 i sorterte endotelceller fra 9 dager gamle EBer. Feilfelt representerer gjennomsnittet ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: 3D-spirende angiogeneseanalyse for narkotikatesting. (A) Konfokale bilder av tre representative EBer farget for Pecam-1 (hvite endotelceller) behandlet med vehikkel alene, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) eller DC101 (3 mg · L-1, 6 mg · L-1, 30 mg · L-1). (B) Kvantifisering av antall spirer per EB. (C) Kvantifisering av spirelengden. (D) På panelet øverst til venstre, høy forstørrelse av endotelspire som viser nettverkskompleksiteten og grenpunktet som teller på to forskjellige lag fra samme EB, på panelet nederst til venstre en skjematisk illustrasjon som representerer målemetoden for endotelspireorientering. På panelet øverst til høyre, høy forstørrelse av endotelspirer fra kjøretøyet alene og på panelet nederst til høyre, høy forstørrelse av endotelspirer fra DAPT (0,5 μmol· L-1) tilstand. (E) Kvantifisering av antall spissceller per spire. (F) Kvantifisering av prosentandelen filopodi innenfor vinkel >50°. Alle stolper representerer gjennomsnittlige ± SEM- og p-verdier fra uparet, enveis ANOVA-test. NS = ikke-signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Defekt karspiring i arvelig hemoragisk telangiektasi EB. På topppanelet, konfokale bilder av representative 12 dager gamle EBer fra Acvrl1+/+ og Acvrl1+/- genotyper farget for Pecam-1 (hvite, endotelceller). På bunnpanelet, høy forstørrelse av Acvrl1 +/- endotelspirer (hvit boks fra topppanelet) som viser mange spissceller (røde piler), endotelrike grenpunkter (blå prikker) og spirende misvisende fenotype (grønne piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Studere spiss / stengelcelleposisjon og fartøyets modning ved hjelp av 3D-spiringsanalysen. (A) Konfokalt bilde av en representativ 12 dager gammel kimær EB laget av R1 villtype cellelinje blandet 1: 1 med 7ACS / EYFP villtype cellelinje farget for Pecam-1 (røde, endotelceller). Røde piler indikerer spissceller fra R1-cellelinjen og grønne piler indikerer spissceller fra 7ACS/EYFP-cellelinjen. (B) Høy forstørrelse av en endotelspire som viser fordelingen av R1 og 7ACS / EYFP endotelcelle langs spiren. (C) Kvantifisering av de relative genotypingsspisscellene fra representative EB-er av villtype. (D) Konfokalt bilde av en representativ 12 dager gammel EB farget for Pecam-1 (røde, endotelceller) og α-SMA (grønne, veggmalericeller). (E) Høy forstørrelse av en endotelspire (hvit rektangulær prikket boks fra D) som viser veggmaleri / endotelcelleinteraksjon. (VG Nett) Bilder av den fargede endotelspiren og deres tilknyttede binære transformerte bilder. (H) Binært bilde av samlokalisert Pecam-1 og α-SMA-farging. Forholdet mellom endotelcellespirer dekket av veggmalericeller. Alle søyler representerer gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en objektiv, robust og reproduserbar 3D EB-basert vaskulær spiringsanalyse som er egnet til screening for legemidler og gener som modulerer angiogenese. Denne metoden gir fordeler i forhold til mange mye brukte todimensjonale (2D) analyser ved bruk av endotelcellekulturer som Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) for å overvåke migrasjon (lateral scratch assay eller Boyden chamber assay)22,23 eller spredning (telling av cellenummer, påvisning av DNA-syntese, påvisning av proliferasjonsmarkører eller metabolske analyser)24 ved at det unikt tillater studiet av både endotel- og veggmalericelledifferensiering og deres organisering i et vaskulært nettverk som etterligner viktige trinn for spirende angiogenese. Disse trinnene inkluderer valg av endotelspisscelle, spredning av stengelcellene, romlig orientering og migrasjon av karspiren og rekruttering av veggmalericeller til det begynnende blodkaret25. Det gir også fordeler for mange 3D-angiogenesemodeller. Fibrinperlen26,27 eller kollagengelanalysen28,29,30 som etterligner tubulogenesen, bruker vanligvis HUVECs eller Endothelial Colony Forming Cells avledede endotelceller (ECFC-EC) da de har en høy proliferativ hastighet, men er ikke egnet for primære endotelceller fra mus som er vanskelige å opprettholde i kultur. Ex vivo retina explant31 eller vaskularisert mikroorgananalyse32 kan rekapitulere godt alle blodkardannelsestrinnene, men de har komplekse eksperimentelle prosedyrer og er ikke egnet for høy gjennomstrømningsmedisin eller genetisk screening. Dette gjelder også for ex vivo aortakringanalysen 33,34 og for mange in vivo-analyser som tumorimplantert i mus eller tap av funksjonsstudier hos mus som ofte har høye kostnader og vanskeligheter med å skaffe store mengder data 35. Denne protokollen kompletterer også lignende in vitro angiogeneseanalyser ved bruk av humane iPSCer som tillater sammenligninger mellom mus og humane data. Selv om det er viktig å merke seg at humane iPSC-avledede endotelceller viser mindre evne til å spire enn musecellene36,37.
Metoden som utvikles her har også noen begrensninger. Det kan ikke evaluere effekten av væskestrøm på blodkarets modning, fartøypermeabilitet og produserer ikke begynnende blodkar i et bestemt vevsmiljø i forhold til nyere mikrofabrikerte enheter som er under utvikling. Faktisk kan organ-on-chip-teknologier som kombinerer mikrofluidikk med vevsteknikk gi dyrkede endotelceller med et mikromiljø som ligner det in vivo38,39. Mikrofluidiske systemer inneholder riktig ekstracellulær matrikssammensetning og er designet for å produsere mekaniske signaler som skjærspenning. Noen er designet for å innlemme veggmalerier og andre støttende celler i et gitt vev eller kan generere kjemiske gradienter. De inneholder nettverk av væskefylte kanaler i mikronskala som er like i størrelse og struktur til blodkapillærene. Organ-on-chip-teknologiene muliggjør også kvantifisering av spesifikke vaskulære funksjoner, inkludert permeabilitet og transendotelial elektrisk motstand. Selv om organ-on-chip-teknologier gir løfte, er de så langt utenfor forskningskompetansen til de fleste biologiske laboratorier, trenger fortsatt riktig standardisering og krever spesialiserte fabrikasjonsteknikker. Kommersialisering av organ-on-chip-teknologiproduksjon er bare begynnelsen, og disse systemene anses som kost-og-tid uoverkommelige for farmasøytiske selskaper for tiden40,41.
Det er flere kritiske skritt som bør tas i betraktning. Bruk celler av høy kvalitet som robust uttrykker godt aksepterte markører (Nanog, Oct4, Sox2 og SSEA-1) av den pluripotente tilstanden. Det er viktig å nøye overvåke deres vekst, mES-celleform og størrelsen og morfologien til mES-kolonier. Siden karyotypisk stabilitet er stokastisk i dyrkede celler, er det viktig å revurdere den etter omfattende passasje. Det anbefales å bruke produkter som allerede er testet for mESC-kultur og teste MEF-matere, kalveserum og alle kjemiske forbindelser i flere passasjer for å oppdage om mESC opprettholder sine cellulære egenskaper eller om de differensierer eller skaffer seg en epiblastisk fenotype. Mediet bør fornyes daglig og mESC-kolonier bør ikke få lov til å bli for store og tette. Til slutt må mESC dyrkes i minst to passasjer uten 2i før differensiering for å sikre det beste utbyttet av endotelceller.
Endoteldifferensieringen inkluderer to viktige trinn: dannelsen av EB ved bruk av hengende dråpemetode og deres kultur under flytende forhold i nærvær av vaskulært differensieringsmedium13,14. Bevegelsen av de hengende dråpefatene bør minimeres for å oppnå jevn celleaggregering. Antallet mESC-er som brukes til å danne et aggregat varierer i de fleste tilfeller mellom 800-1000 celler, men det må kanskje optimaliseres hvis mESC har en annen genetisk bakgrunn enn 129/ola for å sikre en optimal differensiering til vaskulariserte EB-er. Ved dyrking under flytende forhold må EB-er fordeles forsiktig og unngå bevegelse som favoriserer EB-klumping.
EBs blir til slutt dyrket i kollagen I gel for å danne karspirer. Angiogent medium skal tilberedes og når det er blandet med kollagen må jeg holdes på is for å unngå spontan gelering. Ved narkotikatesting tilsettes legemidler i den kalde blandingen i riktig konsentrasjon i løpet av dette trinnet. Justering av pH med NaOH før resuspendering av EBs er avgjørende, ellers vil kollagensyre forårsake celletoksisitet. Til slutt bør EB-er spres i lik avstand fra hverandre for å sikre reproduserbare resultater.
Avslutningsvis introduserer denne metoden en 3D vaskulær spiringsanalyse basert på mESC som har den nødvendige robustheten og skalerbarheten som skal brukes til genetisk screening som nylig beskrevet av Elling U. et al. som genererte en stor haplobank av hemi/homozygot mutert mESC16 og for fenotypisk legemiddeloppdagelsesprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, og av Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
- Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
- Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
- Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
- Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
- Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
- Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
- Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G.
- Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
- Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
- van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
- Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
- Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
- Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
- Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
- Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
- Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
- Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
- Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17 (2020).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
