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Biology

इन विट्रो संवहनी रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण के लिए माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस की त्रि-आयामी अंकुरण परख

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62554
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

Summary

यह परख विट्रो में अंकुरित एंजियोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाली जैविक प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए 3 डी-कोलेजन जेल में संवर्धित भ्रूण निकायों में विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करती है। तकनीक को दवाओं के परीक्षण, बीमारियों के मॉडलिंग और विलोपन के संदर्भ में विशिष्ट जीन ों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो भ्रूण रूप से घातक हैं।

Abstract

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) और जीन संपादन प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति फेनोटाइपिक दवा खोज (पीडीडी) कार्यक्रमों के लिए नए मानव सेल-आधारित रोग मॉडल के विकास को सक्षम करती है। यद्यपि ये नए उपकरण मनुष्यों में जांच दवाओं की सुरक्षा और प्रभावकारिता की अधिक सटीक भविष्यवाणी कर सकते हैं, क्लिनिक में उनका विकास अभी भी स्तनधारी डेटा पर दृढ़ता से निर्भर करता है, विशेष रूप से माउस रोग मॉडल का उपयोग। मानव ऑर्गनॉइड या ऑर्गन-ऑन-चिप रोग मॉडल के समानांतर, प्रासंगिक इन विट्रो माउस मॉडल का विकास इसलिए प्रजातियों के बीच और विवो और इन विट्रो स्थितियों में प्रत्यक्ष दवा प्रभावकारिता और सुरक्षा तुलना के मूल्यांकन के लिए एक अपूर्ण आवश्यकता है। यहां, एक संवहनी अंकुरण परख जो भ्रूण के शरीर (ईबी) में विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करती है, का वर्णन किया गया है। 3 डी-कोलेजन जेल पर संवर्धित संवहनी ईबी नई रक्त वाहिकाओं को विकसित करते हैं जो विस्तार करते हैं, एक प्रक्रिया जिसे अंकुरित एंजियोजेनेसिस कहा जाता है। यह मॉडल विवो स्प्राउटिंग एंजियोजेनेसिस की प्रमुख विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है- पहले से मौजूद संवहनी नेटवर्क से रक्त वाहिकाओं का गठन- जिसमें एंडोथेलियल टिप सेल चयन, एंडोथेलियल सेल माइग्रेशन और प्रसार, सेल मार्गदर्शन, ट्यूब गठन और भित्ति कोशिका भर्ती शामिल हैं। यह एंजियोजेनेसिस को संशोधित करने वाली दवाओं और जीन ों के लिए स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है और मानव आईपीएससी प्रौद्योगिकियों के आधार पर हाल ही में वर्णित त्रि-आयामी (3 डी) संवहनी परख के साथ समानताएं दिखाता है।

Introduction

पिछले तीन दशकों में, दवा उद्योग द्वारा दवा की खोज में लक्ष्य-आधारित दवा खोज (टीडीडी) को व्यापक रूप से नियोजित किया गया है। टीडीडी एक बीमारी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने वाले एक परिभाषित आणविक लक्ष्य को शामिल करता है और दवा स्क्रीनिंग1 के लिए अपेक्षाकृत सरल सेल कल्चर सिस्टम और रीडआउट के विकास पर निर्भर करता है। टीडीडी कार्यक्रमों में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश विशिष्ट रोग मॉडल में पारंपरिक सेल कल्चर विधियां शामिल हैं जैसे कि कैंसर कोशिकाएं या कृत्रिम वातावरण और गैर-शारीरिक सब्सट्रेट्स के भीतर उगाई गई अमर सेल लाइनें। यद्यपि इनमें से कई मॉडलों ने सफल दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए व्यवहार्य उपकरण प्रदान किए हैं, लेकिन ऐसी प्रणालियों का उपयोग उनकी खराब बीमारी प्रासंगिकता के कारण संदिग्ध होसकता है।

अधिकांश बीमारियों के लिए, अंतर्निहित तंत्र वास्तव में जटिल होते हैं और विभिन्न सेल प्रकार, स्वतंत्र सिग्नलिंग मार्ग, और जीन के कई सेट अक्सर एक विशिष्ट रोग फेनोटाइप में योगदान करने के लिए पाए जाते हैं। यह विरासत में मिली बीमारियों के लिए भी सच है जहां प्राथमिक कारण एक एकल जीन में उत्परिवर्तन है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकियों और जीन संपादन उपकरणों के हालिया आगमन के साथ, अब 3 डी ऑर्गेनोइड्स और ऑर्गन-ऑन-चिप रोग मॉडल उत्पन्न करना संभव है जो विवो मानव जटिलता 3,4 में बेहतर सुधार कर सकते हैं। ऐसी प्रौद्योगिकियों का विकास फेनोटाइपिक दवा खोज (पीडीडी) कार्यक्रमों में रुचि में पुनरुत्थान के साथ जुड़ा हुआ है। पीडीडी की तुलना अनुभवजन्य स्क्रीनिंग से की जा सकती है, क्योंकि वे एक विशिष्ट दवा लक्ष्य की पहचान के ज्ञान या बीमारी में इसकी भूमिका के बारे में एक परिकल्पना पर भरोसा नहीं करते हैं। पीडीडी दृष्टिकोण अब पहली श्रेणीकी दवाओं की खोज में दृढ़ता से योगदान करने के लिए तेजी से मान्यता प्राप्त है। क्योंकि मानव ऑर्गनॉइड और ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियों का विकास अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, यह उम्मीद की जाती है कि आईपीएससी मॉडल (अभिनव इमेजिंग और मशीन-लर्निंग टूल 6,7 के साथ पूरक) निकट भविष्य में, दवा स्क्रीनिंग के लिए कई नए जटिल सेल-आधारित रोग मॉडल और टीडीडीदृष्टिकोण 8 की खराब उत्पादकता को दूर करने के लिए संबंधित पीडीडी कार्यक्रम प्रदान करेंगे। 9.

जबकि मानव ऑर्गनॉइड और ऑर्गन-ऑन-चिप मॉडल रोग जटिलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं और नई दवाओं की पहचान कर सकते हैं, दवाओं को नए नैदानिक अभ्यास में लाना भी उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा का आकलन करने के लिए पशु मॉडल के डेटा पर दृढ़ता से निर्भर करता है। उनमें से, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहे निश्चित रूप से सबसे पसंदीदा स्तनधारी मॉडल हैं। उनके पास कई फायदे हैं क्योंकि उनके पास स्तनधारियों के लिए अपेक्षाकृत कम पीढ़ी का समय है, मानव रोगों के समान कई फेनोटाइप हैं, और आसानी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। इसलिए वे दवा खोज कार्यक्रमों10 में बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, चूहों और मनुष्यों के बीच की खाई को पाटना एकमहत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है। मानव ऑर्गनॉइड और ऑर्गन-ऑन-चिप मॉडल के बराबर इन विट्रो माउस मॉडल का विकास कम से कम आंशिक रूप से इस अंतर को भर सकता है क्योंकि यह विवो माउस और इन विट्रो मानव डेटा के बीच प्रत्यक्ष दवा प्रभावकारिता और सुरक्षा तुलना की अनुमति देगा।

यहां, माउस भ्रूण निकायों (ईबी) में एक संवहनी अंकुरण परख का वर्णन किया गया है। रक्त वाहिकाएं एंडोथेलियल कोशिकाओं (पोत की दीवारों की आंतरिक परत), भित्ति कोशिकाओं (संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और पेरिसाइट) से बनी होती हैं। यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एमईएससी) को संवहनी ईबी में विभेदन पर आधारित है, जिसमें लटकती बूंदों का उपयोग किया जाता है जो डे नोवो एंडोथेलियल सेल और म्यूरल सेल भेदभाव13,14 को पुन: उत्पन्न करते हैं। माउस ईएससी को अलग-अलग दिन 3.5 माउस ब्लास्टोसिस्ट से संस्कृति में आसानी से स्थापित किया जा सकता है जिसमें अलग-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि होतीहै। वे क्लोनल विश्लेषण, वंश अनुरेखण के लिए संभावनाएं भी प्रदान करते हैं, और रोग मॉडल13,16 उत्पन्न करने के लिए आसानी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है।

चूंकि रक्त वाहिकाएं सभी अंगों का पोषण करती हैं, इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई बीमारियां यदि सभी नहीं, तो माइक्रोवास्कुलचर में परिवर्तन से जुड़ी होती हैं। पैथोलॉजिकल स्थितियों में, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक सक्रिय स्थिति को अपना सकती हैं या निष्क्रिय हो सकती हैं जिसके परिणामस्वरूप भित्ति कोशिका मृत्यु या रक्त वाहिकाओं से दूर प्रवास हो सकता है। इनके परिणामस्वरूप अत्यधिक एंजियोजेनेसिस या वाहिका दुर्लभता हो सकती है, असामान्य रक्त प्रवाह और दोषपूर्ण रक्त वाहिका बाधा को प्रेरित कर सकती है जिससे प्रतिरक्षा कोशिका बहिर्वाह और सूजन 12,17,18,19 हो सकती है। रक्त वाहिकाओं को संशोधित करने वाली दवाओं के विकास के लिए अनुसंधान, इसलिए उच्च है, और चिकित्सीय लक्ष्यीकरण के लिए कई आणविक खिलाड़ियों और अवधारणाओं की पहचान पहले से ही की जा चुकी है। इस संदर्भ में, वर्णित प्रोटोकॉल रोग मॉडल के निर्माण और दवा परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है क्योंकि यह एंडोथेलियल टिप और डंठल सेल चयन, एंडोथेलियल सेल माइग्रेशन और प्रसार, एंडोथेलियल सेल मार्गदर्शन, ट्यूब गठन और भित्ति सेल भर्ती सहित विवो स्प्राउटिंग एंजियोजेनेसिस की प्रमुख विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करता है। यह मानव आईपीएससी प्रौद्योगिकियों20 के आधार पर हाल ही में वर्णित 3 डी संवहनी परख के साथ समानताएं भी दिखाता है।

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Protocol

1. मीडिया तैयारी और एमईएससी की संस्कृति

  1. 10% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) हीट-इनएक्टिवेटेड फीटल बोवाइन सीरम (एफबीएस), 0.05 एमएम β-मर्कैप्टोइथेनॉल, 1एक्स गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए 1एक्स), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरक 1 x ग्लासगो एमईएम (जी-एमईएम बीएचके -21) माध्यम का उपयोग करके वातानुकूलित माध्यम +/- (सीएम +/-) तैयार करें।
  2. ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ) (1,500 यू / एमएल) और 0.1 एमएम β-मर्कैप्टोइथेनॉल के साथ पूरक सीएम + / - माध्यम का उपयोग करके वातानुकूलित माध्यम + / + (सीएम + / +) तैयार करें।
  3. 1 μM PD0325901 और 3 μM CHIR99021 के साथ पूरक CM+/+ माध्यम का उपयोग करके दो अवरोधकों (CM+/+ 2i) की उपस्थिति में वातानुकूलित माध्यम +/+ तैयार करें।
  4. कैल्शियम और मैग्नीशियम (डीपीबीएस) के बिना फॉस्फेट-बफर्ड खारा के 500 मिलीलीटर में 25 मिलीलीटर पूर्व-गर्म 2% जिलेटिन घोल मिलाकर 0.1% जिलेटिन समाधान तैयार करें।
  5. ट्रिप्सिन (2.5%) को टीवीपी 1एक्स (9.5% 10x डीपीबीएस, 1 एमएम ईडीटीए, 0.01% चिकन सीरम, एच 2 ओ में 0.01% ट्रिप्सिन (2.5%) के साथ मिलाकर 10x ट्रिप्सिन वर्सेन फॉस्फेट (टीवीपी 10x) बफर तैयार करें (1: 10 अनुपात, वॉल्यूम / वॉल्यूम)।
    नोट: 0.22 μm छिद्र फ़िल्टर के माध्यम से सभी समाधानों को फ़िल्टर करें। संस्कृति माध्यम को लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और अन्य अभिकर्मकों को 3 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. 0.1% जिलेटिन समाधान (500 μL प्रति कुएं) के साथ दो 12-वेल सेल कल्चर प्लेटों को कोट करें और उन्हें सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, आर्द्र वातावरण) में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. जिलेटिन-लेपित प्लेटों को पीबीएस के साथ धो लें और सीएम + / - माध्यम के 500 μL जोड़ें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 x 106 क्रायोसंरक्षित माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) की दो शीशियों को पिघलाएं और सेल निलंबन को 5 एमएल सीएम + / - माध्यम के साथ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। माध्यम को एस्पिरेट करें और धीरे से 1.67 x 105 सेल प्रति एमएल की एकाग्रता पर सीएम + / - माध्यम के 12 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  10. 12-वेल सेल कल्चर प्लेट (2.4 x 105 सेल प्रति सेमी 2) में एमईएफ सस्पेंशन के 500 μL बीज करें और सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर (ओ / एन) प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  11. सीएम +/+ 2आई माध्यम में क्रायोप्रिजर्व्ड एमईएससी (1 x 106) की एक शीशी को पिघलाएं।
  12. एमईएससी सस्पेंशन को पहले से धोए गए 12 वेल प्लेट पर एमईएफ के साथ 1 एमएल सीएम + / + 2 आई माध्यम में बीज दें और प्लेट को सीओ2 इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। माध्यम को दैनिक रूप से ताज़ा करें।
  13. 70% कंफ्लुएंसी पर, डीपीबीएस के साथ एमईएससी कॉलोनियों को धोएं। गर्म 10x टीवीपी बफर के 150 μL जोड़ें और एंजाइमेटिक पृथक्करण शुरू करने के लिए 30 सेकंड के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  14. टीवीपी बफर को सावधानीपूर्वक हटा दें, सीएम + / + 2 आई माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और कोमल पाइपिंग द्वारा कॉलोनियों को एकल कोशिकाओं में अलग करें।
  15. एमईएफ (विभाजन अनुपात: 1: 3-1: 5) के साथ एक नई 12-वेल सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करके कोशिकाओं को पारित करें। कोशिकाओं को वितरित करने के लिए धीरे से मिलाएं और सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  16. संस्कृति माध्यम (2-3 एमएल) को ताज़ा करें और दैनिक सेल वृद्धि / आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें। हर 2 दिनों में 70% कॉन्फ्लुएंसी पर सीरियल पासिंग दोहराएं। सेल भेदभाव शुरू करने से पहले दो मार्गों के लिए सीएम + / + माध्यम पर स्विच करें।

2. हैंगिंग ड्रॉप में ईबी का गठन

  1. बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) (50 एनजीएमएल -1) और बोन मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 (बीएमपी -4) (5 एनजीएमएल -1) के साथ सीएम + / - माध्यम को पूरक करके ताजा मेसोडर्म भेदभाव माध्यम तैयार करें और उपयोग तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. 0.1% जिलेटिन समाधान के 500 μL के साथ 6-वेल सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं को कोट करें और इसे 30 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. जिलेटिन-लेपित प्लेटों को पीबीएस के साथ धो लें और सीएम + / - माध्यम के 500 μL जोड़ें।
  4. एमईएससी की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए, आरटी पर 30 सेकंड के लिए 10एक्स टीवीपी बफर के साथ सेल कल्चर प्लेट को ट्रिप्सिनाइज्ड करें, 1 एमएल मेसोडर्म भेदभाव माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और फिर उन्हें 30 मिनट के लिए जिलेटिन-लेपित 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, जिससे एमईएफ को संलग्न करने की अनुमति मिलती है।
  5. सेल निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें और जीवित / मृत सेल बहिष्करण के लिए न्यूबॉयर हेमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू डाई का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 4.55 x 104 सेल प्रति एमएल तक पहुंचने के लिए मेसोडर्म भेदभाव माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. 15 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ 94 मिमी कम लगाव पॉलीस्टाइनिन व्यंजनों के तल को भरें।
    नोट: 3 डी स्प्राउटिंग एंजियोजेनेसिस परख का उपयोग करके एक विशेष स्थिति का परीक्षण करने के लिए लटकती बूंदों (3.52 एमएल माध्यम में 1.6 x 105 कोशिकाओं) वाले चार व्यंजनों की आवश्यकता होगी।
  8. सेल निलंबन को एक बाँझ प्लास्टिक जलाशय में स्थानांतरित करें और प्रति चैनल सेल निलंबन के 22 μL के साथ एक मल्टीचैनल पिपेट के चार पदों को लोड करें (1 x 103 सेल प्रति 22 μL ड्रॉप)।
  9. 94 मिमी डिश के ढक्कन को उठाएं और उलटा करें और इसे प्रवाह कैबिनेट की साफ सतह पर रखें, जिसमें आंतरिक पक्ष ऊपर की ओर है।
  10. प्रत्येक ढक्कन की आंतरिक सतह पर सेल निलंबन की 40 बूंदें जमा करें। सावधानी से बिना किसी गड़बड़ी के ढक्कन को उल्टा करें और इसे पकवान पर वापस रखें, ताकि बूंदें पानी का सामना करें।
  11. सीओ2 इनक्यूबेटर में व्यंजनों को इनक्यूबेट करें। इसे भेदभाव दिवस 0 के रूप में मानें। ईबी बनाने के लिए प्लेटों को 4 दिनों तक बनाए रखें।

3. टिप सेल स्थिति के लिए प्रतियोगिता परख

  1. कल्चर एक फ्लोरोसेंट और एक गैर-फ्लोरोसेंट एमईएससी लाइन जैसा कि पहले वर्णितहै 13. एक उदाहरण के रूप में, पीले और आर 1 एमईएससी में लेबल किए गए 7एसीएस / ईवाईएफपी एमईएससी का उपयोग किया जाता है।
  2. दो एमईएससी लाइनों (1: 1 अनुपात) की समान मात्रा को मिलाकर मोज़ेक ईबी तैयार करें और चरण 2 में वर्णित सीओ2 इनक्यूबेटर में लटकते ड्रॉप व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।

4. संवहनी भेदभाव के लिए फ्लोटिंग ईबी संस्कृति।

  1. लटकती बूंदों से ईबी एकत्र करने से पहले, निम्नलिखित तैयार करें।
    1. एच2ओ में 5% आगर घोल तैयार करें और इसे ऑटोक्लेविंग (120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट) द्वारा निष्फल करें।
    2. जी-एमईएम बीएचके -21 माध्यम तैयार करने के लिए गर्म 5% एगर समाधान का उपयोग करें जिसमें 1% आगर हो और जल्दी से 60 मिमी पॉलीस्टाइनिन व्यंजनों में से एक में 3 एमएल डालें। आरटी पर 1 घंटे के लिए आगर को जमने दें। उपयोग तक व्यंजन ों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बीएफजीएफ (100 एनजीएमएल -1) और वीईजीएफ-ए (50 एनजीएमएल -1) के साथ सीएम + / - माध्यम को पूरक करके ताजा 2 x संवहनी भेदभाव माध्यम तैयार करें। उपयोग तक माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में लटकती बूंदों को इकट्ठा करें और ईबी अवसादन के कुछ मिनटों के बाद सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  4. 2x संवहनी भेदभाव माध्यम के 3 मिलीलीटर में ईबी को फिर से निलंबित करें, ईबी निलंबन को एक एगर-लेपित डिश में स्थानांतरित करें और एकत्रीकरण से बचने के लिए ईबी को समरूप रूप से वितरित करें।
  5. सीओ 2 इनक्यूबेटर में व्यंजनों को इनक्यूबेट करें और बीएफजीएफ (50 एनजीएमएल -1) और वीईजीएफ-ए (25 एनजीएमएल -1) की उपस्थिति में 1 x संवहनी भेदभाव माध्यम का उपयोग करके दिन 9 तक हर2 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें।
  6. वैकल्पिक रूप से, म्यूरल सेल भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए संवहनी भेदभाव माध्यम में प्लेटलेट व्युत्पन्न विकास कारक-बीबी (पीडीजीएफ-बीबी) (दिन 4 पर 10 एनजीएमएल -1 और दिन 6 और दिन 8 पर 5 एनजीएमएल -1) जोड़ें।

5. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

  1. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 9 दिन पुराने ईबी को इकट्ठा करें और उन्हें गर्म पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  2. जी-एमईएम बीएचके -21 माध्यम के 1 एमएल जोड़ें जिसमें 0.2 मिलीग्राम एमएल -1 कोलेजनेस ए होता है और कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  3. पी 1000 पिपेट के साथ धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके ईबी को अलग करें।
  4. 10% एफबीएस के साथ 1 एमएल ठंडा जी-एमईएम बीएचके -21 माध्यम जोड़कर कोलेजनेस गतिविधि को रोकें।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. 2% एफबीएस के साथ पीबीएस के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  7. न्यूबॉयर हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  8. पीबीएस के 100 μL में 400,000 कोशिकाओं को 2% FBS प्रति धुंधला स्थिति के साथ पुन: निलंबित करें।
  9. निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें: एपीसी संयुग्मित चूहे एंटी-माउस पीईसीएएम -1 एंटीबॉडी (क्लोन एमईसी 13.3) और एफआईटीसी संयुग्मित चूहा एंटी-माउस सीडी 45 (क्लोन 30-एफ 11) या आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी।
  10. 2% एफबीएस युक्त पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  11. 5 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  12. सेल स्ट्रेनर स्नैप कैप के साथ, एक गोल तल पॉलीस्टाइनिन टेस्ट ट्यूब का उपयोग करके कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  13. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा 20,000 पीईसीएएम -1 (+) घटनाओं का विश्लेषण करें।

6.3D अंकुरित एंजियोजेनेसिस परख और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. 9 वें दिन, 10% एफबीएस (वॉल्यूम / वॉल्यूम), बीएफजीएफ (50 एनजीएमएल -1), वीईजीएफ-ए (25 एनजीएमएल -1), मानव पुनः संयोजक एरिथ्रोपोइटिन (एचईपीओ) (20 एनजीएमएल -1), मानव इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6) (10 एनजीएमएल -1), 0.05 एमएम β-मर्कैप्टोथेनॉल, एनईएए (1एक्स), एल-ग्लूटामाइन (1एक्स), सोडियम पाइरूवेट (1एक्स) को जोड़कर एक अंकुरित माध्यम तैयार करें। और एनएओएच (3.1 एमएम) से जीएमईएम बीएचके -1 माध्यम।
  2. कोलेजन गेलेशन से बचने के लिए, उपयोग तक बर्फ पर अंकुरित माध्यम बनाए रखें।
  3. एंटी-एंजियोजेनिक अणुओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, चयनित एकाग्रता पर अंकुरित माध्यम में चयनित दवा या वाहन जोड़ें।
  4. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (एक स्थिति के बराबर) में एक 60 मिमी एगर डिश से 9 दिन पुराने ईबी एकत्र करें और अवसादन के कुछ मिनटों के बाद सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  5. अंकुरित माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ 35 मिमी कल्चर डिश के तल को कवर करें और गेलेशन को प्रेरित करने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 2 मिलीलीटर ठंडे अंकुरित माध्यम में ईबी को फिर से निलंबित करें।
  7. निलंबन को अंकुरित माध्यम की पहली परत के साथ लेपित 35 मिमी कल्चर डिश में स्थानांतरित करें।
  8. ईबी को प्लेट पर वितरित करें और सुनिश्चित करें कि वे एक दूसरे से समान दूरी पर हैं। पकवान को सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। पहला अंकुर गठन 24-48 घंटे के भीतर होता है।
  9. दिन 12 पर, ईबी युक्त कोलेजन जेल को स्पैटुला का उपयोग करके ग्लास स्लाइड (75 x 26 मिमी) में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित किया जाता है।
  10. पिपेट (पी 1000) का उपयोग करके अतिरिक्त तरल को हटा दें और जेल के शीर्ष पर नायलॉन लिनन और शोषक फिल्टर कार्ड (जेल ब्लॉटिंग पेपर) की धुंध शीट रखकर जेल को निर्जलित करें। 2 मिनट के लिए वजन (250 ग्राम) रखकर दबाव लागू करें। फिल्टर पेपर को ध्यान से हटा दें और स्लाइड को आरटी पर 30 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
  11. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड को तीन बार धोएं।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर जस्ता समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ईबी को ठीक करें। वैकल्पिक रूप से, मोज़ेक फ्लोरोसेंट ईबी को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) (4%) ओ / एन के साथ ठीक करें।
  13. फिक्सेटिव को हटा दें। आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड को पांच बार धोएं।
  14. पीबीएस में ईबी को आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 युक्त करें।
  15. परमेबिलाइजेशन समाधान को हटा दें। 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड ्स को पांच बार धोएं।
  16. आरटी में 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग बफर (2% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन, बीएसए के साथ पीबीएस) में ईबी को इनक्यूबेट करें।
  17. एंडोथेलियल स्प्राउट्स को दागने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर ओ / एन को अवरुद्ध करने में एक चूहा एंटी-माउस एंटी-पीईसीएएम -1 प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 100 कमजोर पड़ने) का उपयोग करें।
  18. 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड ्स को पांच बार धोएं।
  19. बकरी एंटी-रैट एलेक्सा 555 सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ बफर (1:250 कमजोर पड़ने) में और जब आवश्यक हो, तो अंधेरे में आरटी पर 2 घंटे के लिए भित्ति कोशिकाओं को दागने के लिए बफर (1:250 कमजोर पड़ने) को अवरुद्ध करने में एफआईटीसी-संयुग्मित एंटी-α-एसएमए एंटीबॉडी के साथ स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें।
  20. स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और उन्हें माउंट करने से पहले एच20 के साथ एक बार।

7. ईबी एंडोथेलियल स्प्राउट्स के कॉन्फोकल इमेजिंग, मॉर्फोमेट्रिक और मात्रात्मक विश्लेषण

  1. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फोकल प्लेन मर्जिंग (जेड-स्टैकिंग) द्वारा इम्यूनोस्टेन्ड ईबी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्राप्त करें। पूरे ईबी को चित्रित करने के लिए 10x आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करें।
  2. आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने और स्थापित परिमाणीकरण विधियों13,14,21 के अनुसार पीईसीएएम -1 पॉजिटिव एंडोथेलियल स्प्राउट्स की विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए इमेजजे का उपयोग करके प्राप्त छवियों का विश्लेषण करें।
    1. प्रति ईबी कुल अंकुर संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर प्रति ईबी एंडोथेलियल स्प्राउट्स की औसत संख्या की गणना करें।
    2. इमेजजे ड्राइंग टूल का उपयोग करके व्यक्तिगत अंकुरित लंबाई को मापें। ईबी कोर क्षेत्र से शुरू होने वाले एंडोथेलियल स्प्राउट के आधार को परिभाषित करें और स्प्राउट टिप समाप्त होने तक मैन्युअल रूप से एक रेखा खींचें।
    3. प्रति व्यक्तिगत स्प्राउट में टिप कोशिकाओं की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर प्रति स्प्राउट टिप कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना करें और फिर प्रति ईबी औसत की गणना करें।
    4. मूल स्प्राउट की धुरी को मैन्युअल रूप से निर्धारित करके फिलोपोडिया अभिविन्यास की गणना करें और इमेजजे सॉफ्टवेयर कोण उपकरण का उपयोग करके उनके बीच तीव्र कोण को मापें। एक अभिविन्यास >50° के साथ स्प्राउट्स की संख्या की गणना करें और इसे ब्याज के ईबी के स्प्राउट्स की कुल संख्या से विभाजित करें।
      नोट: कोण हमेशा 0 ° से 90 ° तक होते हैं।
  3. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन्ड ईबी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्राप्त करें। एकल एंडोथेलियल स्प्राउट्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का एहसास करने के लिए 40x आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके α-एसएमए पॉजिटिव एमसी से घिरे पीईसीएएम -1 पॉजिटिव ईसी स्प्राउट्स के पोत कवरेज की मात्रा निर्धारित करें।
    1. विलय की गई छवियों को अलग-अलग लाल और हरे चैनलों में विभाजित करें।
    2. छवियों को उसके बाइनरी रूप में परिवर्तित करें।
    3. पीईसीएएम -1 (लाल रंग में लेबल एंडोथेलियल कोशिकाएं) और α-एसएमए (हरे रंग में लेबल की गई भित्ति कोशिकाएं) सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा अलग-अलग कब्जा किए गए स्प्राउट के कुल सेलुलर क्षेत्र को मापें।
    4. छवि कैलकुलेटर फ़ंक्शन और एएनडी ऑपरेटर का उपयोग करके मर्ज की गई छवि उत्पन्न करें। छवि के कुल सेलुलर क्षेत्र को मापें। कवरेज की गणना करने के लिए, कोलोकाइज्ड छवि के क्षेत्र को पीईसीएएम -1 बाइनरी छवि के क्षेत्र से विभाजित करें।
  5. मोज़ेक ईबी द्वारा विकसित स्प्राउट्स की एंडोथेलियल टिप / डंठल सेल स्थिति के लिए सेल प्रतियोगिता का विश्लेषण करने के लिए, मैन्युअल रूप से टिप कोशिकाओं की संख्या को स्कोर करें और प्रतिदीप्ति संकेत के आधार पर उनके जीनोटाइपिक मूल को चिह्नित करें। प्रति ईबी औसत मूल्यों की गणना करें।

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Representative Results

रक्त वाहिका अंकुरण परख का प्रोटोकॉल अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। तीन स्वतंत्र 129/ओला एमईएससी लाइनों (जेड/रेड, आर1 और ई14) से प्राप्त नौ दिन पुराने ईबी को कोलेजनेस ए का उपयोग करके एकल कोशिकाओं में एंजाइमेटिक रूप से अलग किया गया था। सभी सेल लाइनों ने मजबूत एंडोथेलियल भेदभाव का प्रदर्शन किया, और एंडोथेलियल कोशिकाओं में अंतर करने की उनकी क्षमता में कोई अंतर नहीं देखा गया। सभी सेल लाइनों ने एंडोथेलियल कोशिकाओं के लगभग 10.5% ± 1.3% का उत्पादन किया (चित्रा 2 ए)। पीईसीएएम -1 (+) सेल आबादी में पैन-एंडोटेलियल सेल मार्करों के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर भी निर्धारित किए गए थे। सभी विश्लेषण किए गए मार्करों (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, और Cdh5) के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर सेल लाइनों और प्रयोगों के बीच तुलनीय थे, जो भेदभाव प्रोटोकॉल (चित्रा 2 बी) की मजबूती की पुष्टि करते हैं। पीईसीएएम -1 (+) सेल आबादी ने केवल धमनी (नॉच 1 और ईएफएनबी 2) या शिरापरक (कूपटीएफ 2 और एएफबी 4) मार्करों के बहुत कम एमआरएनए स्तर व्यक्त किए जो प्रोटोकॉल (चित्रा 2 सी) द्वारा उत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं की अपेक्षाकृत अपरिपक्व स्थिति का समर्थन करते हैं।

एंजियोजेनेसिस को संशोधित करने वाली दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए संवहनी अंकुरित ईबी मॉडल की क्षमता तब प्रदर्शित की गई थी (चित्रा 3)। डीसी 101 और डीएपीटी (एन-[एन-(3,5-डिफ्लोरोफेनेसिटाइल)-लानिल]-एस-फेनिलग्लाइसिन टी-ब्यूटाइलस्टर) का परीक्षण किया गया था। इन यौगिकों का व्यापक रूप से चूहों में उपयोग किया जाता है ताकि क्रमशः वीईजीएफआर 2 गतिविधि को रोककर एंजियोजेनेसिस को अवरुद्ध किया जा सके या एंडोथेलियल टिप सेल भेदभाव को बढ़ावा दिया जा सके और नॉच सिग्नलिंग (चित्रा 3 ए) को लक्षित करके घने संवहनी जाल के गठन को बढ़ावा दिया जा सके। वीईजीएफ और नॉच सिग्नलिंग मार्ग दोनों विवो में अंकुरित एंजियोजेनेसिस के प्रमुख नियामक हैं। कोलेजन I में चढ़ाए गए ईबी में डीसी 101 और डीएपीटी की विभिन्न सांद्रता के प्रभावों का मूल्यांकन किया गया था। डीसी 101 की उच्च खुराक 6-30 मिलीग्राम से लेकर · एल -1 ने पोत स्प्राउट्स की संख्या और लंबाई दोनों को रोक दिया, जबकि डीएपीटी का 1 μmol की खुराक पर विपरीत प्रभाव पड़ा। एल -1 (चित्रा 3 बी-सी)। डीएपीटी की उपस्थिति में संवर्धित ईबी के पीईसीएएम -1 के लिए दाग वाले पोत स्प्राउट्स के उच्च आवर्धन चित्र भी प्रदान किए गए हैं (चित्रा 3 डी)। 0.5-1 μmol से कम खुराक पर भी DAPT · एल -1 ने पोत स्प्राउट्स के साथ एंडोथेलियल टिप कोशिकाओं की संख्या में दृढ़ता से वृद्धि की, जिसमें एक गलत मार्गदर्शन फेनोटाइप था (चित्रा 3 डी-एफ)। डीएपीटी की उच्च खुराक ने पोत सहवास और संगठन के बिना बड़े और सपाट एंडोथेलियल सेल क्षेत्रों के गठन को भी जन्म दिया (चित्रा 3 ए)। परिणामों ने दवाओं का परीक्षण करने के लिए मॉडल की क्षमता की पुष्टि की जो एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं या रोकते हैं।

यह पुष्टि करने के लिए कि यह मॉडल संवहनी रोगों की नकल करने के लिए उपयुक्त है, Acvrl1 + / - MESCs से प्राप्त ईबी की कॉन्फोकल छवियां प्रदान की जाती हैं। एसीवीआरएल 1 जीन एएलके 1 (एक्टिविन रिसेप्टर-जैसे किनेज 1) के लिए एन्कोड करता है, एक रिसेप्टर जो विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है जो यदि उत्परिवर्तित होता है तो वंशानुगत रक्तस्रावी टेलेंजिक्टेसिया (एचएचटी) नामक एंजियोडिस्प्लासिया के साथ एक संवहनी दुर्लभ बीमारी के विकास के लिए जिम्मेदार होता है। एंडोथेलियल स्प्राउट्स की एक उच्च आवर्धन तस्वीर से पता चला है कि उनके पास अधिक एंडोथेलियल टिप कोशिकाएं और प्रति स्प्राउट अधिक शाखाएं थीं जो मूल वाहिकाओं के सापेक्ष यादृच्छिक कोणों पर थीं। इनने एचएचटी चूहों (चित्रा 4) में देखे गए इन विट्रो में एक गलत मार्गदर्शन फेनोटाइप की पुष्टि की।

एक विशेष जीनोटाइप के विभेदित एमईएससी फ्लोरोसेंटली-लेबल और एमईएससी वाले चिमेरिक ईबी का गठन करके, एंडोथेलियल टिप चयन की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल शामिल है (चित्रा 5 ए-सी)। पीईसीएएम -1 लेबल पोत स्प्राउट्स की एक कॉन्फोकल छवि ने अग्रणी एंडोथेलियल टिप कोशिकाओं (चित्रा 5 बी) की जीनोटाइपिक उत्पत्ति की पहचान की। एक गैर-लेबल एमईएससी वाइल्ड-टाइप लाइन के साथ 1: 1 अनुपात में एक जंगली-प्रकार वाईएफपी (पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन) एमईएससी लाइन के मिश्रण ने लगातार अग्रणी एंडोथेलियल टिप कोशिकाओं (चित्रा 5 सी) में प्रत्येक आबादी के समान योगदान का नेतृत्व किया।

यह प्रोटोकॉल पोत स्प्राउट के भित्ति सेल कवरेज को निर्धारित करने के लिए भी उपयुक्त है। एंजियोजेनेसिस से गुजरने वाले ईबी को पीईसीएएम -1 (एंडोथेलियल कोशिकाओं, लाल) और α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (α-एसएमए) (भित्ति कोशिकाओं, हरे) (चित्रा 5 डी) के लिए तय और दाग दिया गया था। एक उच्च आवर्धन छवि से पता चला कि कैसे एक व्यक्तिगत पोत अंकुर भित्ति कोशिकाओं से घिरा हुआ था (चित्रा 5 ई, बाएं)। इमेजजे सॉफ्टवेयर (चित्रा 5 एच) का उपयोग करके α-एसएमए (+) भित्ति कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए पीईसीएएम -1 (+) पोत के अनुपात को निर्धारित करने के लिए रंग चैनल पृथक्करण (चित्रा एफ-जी) के बाद द्विआधारी परिवर्तन किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं की समयरेखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ईबी के अंदर एमईएससी संवहनी भेदभाव से प्राप्त ईसीएस का लक्षण वर्णन। (ए) 9-दिन पुराने ईबी से सीडी 31 अभिव्यक्ति का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण और पेकैम -1 (+) कोशिकाओं के प्रतिशत का परिमाणीकरण। (बी-डी) 9 दिन पुराने ईबी से क्रमबद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं में पेकैम -1, एफएलके 1, एफएलटी 1, एफएलटी 4, इंग, टाई 2, सीडीएच 5, नॉच 1, ईएफएनबी 2, कूपटीएफ 2 और एएफबी 4 के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की माध्य ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दवा परीक्षण के लिए 3 डी अंकुरित एंजियोजेनेसिस परख। (ए) पेकैम -1 (सफेद, एंडोथेलियल कोशिकाओं) के लिए दाग वाले तीन प्रतिनिधि ईबी की कॉन्फोकल छवियां अकेले वाहन के साथ इलाज की जाती हैं, डीएपीटी (0.5 μmol· L-1, 1.0 μmol · L-1, 5.0 μmol · एल -1) या डीसी 101 (3 मिलीग्राम · एल -1, 6 मिलीग्राम · एल -1, 30 मिलीग्राम · एल -1)। (बी) प्रति ईबी स्प्राउट्स की संख्या का परिमाणीकरण। (ग) अंकुरित लंबाई का परिमाणन। (डी) ऊपरी-बाएं पैनल पर, एंडोथेलियल स्प्राउट का उच्च आवर्धन नेटवर्क जटिलता और एक ही ईबी से दो अलग-अलग परतों पर शाखा बिंदु गिनती को दर्शाता है, नीचे-बाएं पैनल पर एंडोथेलियल स्प्राउट अभिविन्यास की माप विधि का प्रतिनिधित्व करने वाला एक योजनाबद्ध चित्रण। ऊपरी-दाएं पैनल पर, अकेले वाहन से एंडोथेलियल स्प्राउट्स का उच्च आवर्धन और नीचे-दाएं पैनल पर, डीएपीटी से एंडोथेलियल स्प्राउट्स का उच्च आवर्धन (0.5 μmol· एल -1) शर्त। (ई) प्रति अंकुर टिप कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। (च) कोण >50° के भीतर फिलोपोडिया के प्रतिशत का परिमाणीकरण। सभी सलाखों अप्रकाशित, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण से औसत ± एसईएम और पी मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं। एनएस = गैर-महत्वपूर्ण, * पी < 0.05, ** पी < 0.01, ***पी < 0.001, और ****पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वंशानुगत रक्तस्रावी टेलेंजिक्टसिया ईबी में दोषपूर्ण पोत अंकुरित होना। शीर्ष पैनल पर, Acvrl1+/+ और Acvrl1+/- जीनोटाइप के प्रतिनिधि 12-दिन पुराने ईबी की कॉन्फोकल छवियां पेकैम -1 (सफेद, एंडोथेलियल कोशिकाओं) के लिए दागदार हैं। नीचे के पैनल पर, Acvrl1+/- एंडोथेलियल स्प्राउट्स (शीर्ष पैनल से सफेद बॉक्स) का उच्च आवर्धन कई टिप कोशिकाओं (लाल तीर), एंडोथेलियल शाखा बिंदुओं (नीले बिंदु) और अंकुरित गलत मार्गदर्शन फेनोटाइप (हरे तीर) को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 3 डी अंकुरण परख का उपयोग करके टिप / डंठल सेल की स्थिति और पोत परिपक्वता का अध्ययन। (ए) आर 1 वाइल्ड-टाइप सेल लाइन से बने एक प्रतिनिधि 12-दिवसीय चिमेरिक ईबी की कॉन्फोकल छवि को पेकैम -1 (लाल, एंडोथेलियल कोशिकाओं) के लिए सना हुआ 7एसीएस / ईवाईएफपी जंगली-प्रकार की सेल लाइन के साथ 1: 1 मिलाया गया। लाल तीर आर 1 सेल लाइन से टिप कोशिकाओं को इंगित करते हैं और हरे तीर 7एसीएस / ईवाईएफपी सेल लाइन से टिप कोशिकाओं को इंगित करते हैं। (बी) एक एंडोथेलियल स्प्राउट का उच्च आवर्धन अंकुरित के साथ आर 1 और 7 एसीएस / ईवाईएफपी एंडोथेलियल सेल के वितरण को दर्शाता है। (सी) प्रतिनिधि जंगली प्रकार के ईबी से सापेक्ष जीनोटाइपिंग टिप कोशिकाओं का परिमाणीकरण। (डी) पेकैम -1 (लाल, एंडोथेलियल कोशिकाओं) और α-एसएमए (हरे, भित्ति कोशिकाओं) के लिए सना हुआ एक प्रतिनिधि 12-दिवसीय ईबी की कॉन्फोकल छवि। (ई) एक एंडोथेलियल स्प्राउट (डी से सफेद आयताकार बिंदीदार बॉक्स) का उच्च आवर्धन जो भित्ति / एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन को दर्शाता है। (F-G) रंगीन एंडोथेलियल स्प्राउट और उनके संबंधित द्विआधारी रूपांतरित छवियों की छवियां। (एच) सह-स्थानीयकृत पेकैम -1 और α-एसएमए धुंधला होने की द्विआधारी छवि। भित्ति कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए एंडोथेलियल सेल स्प्राउट्स का अनुपात। सभी पट्टियाँ SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एक निष्पक्ष, मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 3 डी ईबी-आधारित संवहनी अंकुरण परख का वर्णन करता है जो एंजियोजेनेसिस को संशोधित करने वाली दवाओं और जीन ों के लिए स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है। यह विधि माइग्रेशन (पार्श्व खरोंच परख या बॉयडेन चैंबर परख) 22,23 या प्रसार (सेल नंबर की गिनती, डीएनए संश्लेषण का पता लगाने, प्रसार मार्करों का पता लगाने, या चयापचय परख) की निगरानी के लिए मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) जैसे एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों का उपयोग करके कई व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले दो आयामी (2 डी) परखों पर लाभ प्रदान करती है। इसमें यह विशिष्ट रूप से एंडोथेलियल और भित्ति कोशिका भेदभाव और उनके संगठन दोनों के अध्ययन की अनुमति देता है जो एंजियोजेनेसिस को अंकुरित करने के प्रमुख चरणों की नकल करता है। इन चरणों में एंडोथेलियल टिप सेल चयन, डंठल कोशिकाओं का प्रसार, स्थानिक अभिविन्यास और पोत स्प्राउट का प्रवास, और नवजात रक्त वाहिका25 में भित्ति कोशिकाओं की भर्ती शामिल है। यह कई 3 डी एंजियोजेनेसिस मॉडल के लिए भी फायदे प्रदान करता है। फाइब्रिन बीड26,27 या कोलेजन जेल परख28,29,30 टुबुलोजेनेसिस की नकल करते हुए आमतौर पर एचयूवीईसी या एंडोथेलियल कॉलोनी फॉर्मिंग सेल व्युत्पन्न एंडोथेलियल सेल (ईसीएफसी-ईसी) का उपयोग करते हैं क्योंकि उनके पास उच्च प्रोलिफेरेटिव दर होती है लेकिन माउस प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं जिन्हें संस्कृति में बनाए रखना मुश्किल होता है। एक्स विवो रेटिना एक्सप्लेंट31 या संवहनी सूक्ष्म-अंग परख32 सभी रक्त वाहिका गठन चरणों को अच्छी तरह से पुन: उत्पन्न कर सकता है लेकिन उनके पास जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं हैं और उच्च थ्रूपुट दवा या आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यह पूर्व विवो महाधमनी रिंग परख33,34 के लिए भी सच है और विवो परख में कई लोगों के लिए जैसे कि चूहों में प्रत्यारोपित ट्यूमर या चूहों में फ़ंक्शन अध्ययन का नुकसान जो अक्सर उच्च लागत और बड़ी मात्रामें डेटा प्राप्त करने में कठिनाइयों का सामना करते हैं। यह प्रोटोकॉल मानव आईपीएससी का उपयोग करके समान इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परख ों को भी अच्छी तरह से पूरक करता है जो माउस और मानव डेटा के बीच तुलना की अनुमति देता है। हालांकि यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाएं माउस कोशिकाओं36,37 की तुलना में अंकुरित होने की कम क्षमता दिखाती हैं।

यहां विकसित विधि की भी कुछ सीमाएं हैं। यह रक्त वाहिका परिपक्वता, पोत पारगम्यता पर द्रव प्रवाह के प्रभावों का मूल्यांकन नहीं कर सकता है और हाल ही में विकास के अधीन माइक्रोफैब्रिकेटेड उपकरणों की तुलना में एक विशिष्ट ऊतक वातावरण में नवजात रक्त वाहिका का उत्पादन नहीं करता है। दरअसल, ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियां जो ऊतक इंजीनियरिंग के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स को जोड़ती हैं, विवो 38,39 के समान माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रदान कर सकती हैं। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में सही बाह्य मैट्रिक्स संरचना होती है और इसे यांत्रिक संकेतों जैसे कतरनी तनाव का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कुछ को भित्ति कोशिकाओं और किसी दिए गए ऊतक की अन्य सहायक कोशिकाओं को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है या रासायनिक ग्रेडिएंट उत्पन्न कर सकते हैं। उनमें माइक्रोन-स्केल द्रव से भरे चैनलों के नेटवर्क होते हैं जो आकार में और रक्त केशिकाओं की संरचना में समान होते हैं। ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियां विशिष्ट संवहनी कार्यों की मात्रा का ठहराव भी सक्षम करती हैं, जिसमें पारगम्यता और ट्रांस एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध शामिल हैं। यद्यपि अंग-पर-चिप प्रौद्योगिकियां वादा करती हैं, वे अधिकांश जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं की अनुसंधान विशेषज्ञता से परे हैं, फिर भी उचित मानकीकरण की आवश्यकता है, और विशेष निर्माण तकनीकों की आवश्यकता है। ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकी निर्माण का व्यावसायीकरण केवल शुरुआत है, और इन प्रणालियों को वर्तमान मेंदवा कंपनियों के लिए लागत-और-समय निषेधात्मक माना जाता है।

कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। उच्च गुणवत्ता वाली कोशिकाओं का उपयोग करें जो प्लुरिपोटेंट अवस्था के अच्छी तरह से स्वीकृत मार्करों (नैनोग, अक्टूबर 4, सॉक्स 2, और एसएसईए -1) को मजबूती से व्यक्त करते हैं। उनकी वृद्धि, एमईएस सेल आकार और एमईएस कॉलोनियों के आकार और आकृति विज्ञान की सावधानीपूर्वक निगरानी करना आवश्यक है। चूंकि सुसंस्कृत कोशिकाओं में कैरियोटाइपिक स्थिरता स्टोकेस्टिक है, इसलिए व्यापक पासिंग के बाद इसका पुनर्मूल्यांकन आवश्यक है। एमईएससी संस्कृति के लिए पहले से ही परीक्षण किए गए उत्पादों का उपयोग करने और एमईएफ फीडर, भ्रूण बछड़ा सीरम और सभी रासायनिक यौगिकों का कई मार्गों के लिए परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है ताकि यह पता लगाया जा सके कि क्या एमईएससी अपने सेलुलर गुणों को बनाए रखते हैं या क्या वे एपिब्लास्टिक फेनोटाइप को अलग या प्राप्त करते हैं। माध्यम को दैनिक रूप से ताज़ा किया जाना चाहिए और एमईएससी कॉलोनियों को बहुत बड़ा और घना नहीं होने दिया जाना चाहिए। अंत में, एंडोथेलियल कोशिकाओं की सर्वोत्तम उपज सुनिश्चित करने के लिए भेदभाव से पहले एमईएससी को 2 आई के बिना कम से कम दो मार्गों के लिए सुसंस्कृत करने की आवश्यकता होती है।

एंडोथेलियल भेदभाव में दो महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं: हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करके ईबी का गठन और संवहनी भेदभाव माध्यम13,14 की उपस्थिति में फ्लोटिंग स्थितियों के तहत उनकी संस्कृति। समान सेल एकत्रीकरण प्राप्त करने के लिए लटकते हुए ड्रॉप व्यंजनों की गति को कम से कम किया जाना चाहिए। ज्यादातर मामलों में एक समग्र बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एमईएससी की संख्या 800-1,000 कोशिकाओं के बीच होती है, लेकिन इसे अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है यदि एमईएससी में संवहनी ईबी में इष्टतम भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए 129 / ओला की तुलना में एक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि है। जब फ्लोटिंग परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है, तो ईबी को सावधानीपूर्वक वितरित करने और ईबी क्लंपिंग के पक्ष में आंदोलन से बचने की आवश्यकता होती है।

ईबी को अंततः पोत स्प्राउट्स बनाने के लिए कोलेजन आई जेल में सुसंस्कृत किया जाता है। एंजियोजेनिक माध्यम को ताजा तैयार किया जाना चाहिए और एक बार कोलेजन के साथ मिश्रित होने के बाद मुझे सहज गेलेशन से बचने के लिए बर्फ पर बनाए रखा जाना चाहिए। दवा परीक्षण के मामले में, इस चरण के दौरान दवाओं को सही एकाग्रता पर ठंडे मिश्रण में जोड़ा जाता है। ईबी को निलंबित करने से पहले एनएओएच के साथ पीएच को समायोजित करना महत्वपूर्ण है, अन्यथा कोलेजन अम्लता सेल विषाक्तता का कारण बनेगी। अंत में, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए ईबी को एक दूसरे से समान दूरी पर फैलाया जाना चाहिए।

अंत में, यह विधि एमईएससी पर आधारित एक 3 डी संवहनी अंकुरण परख का परिचय देती है जिसमें आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक मजबूती और स्केलेबिलिटी है जैसा कि हाल ही में एलिंग यू एट अल द्वारा वर्णित है। होमोजीगस उत्परिवर्ती एमईएससी16 और फेनोटाइपिक दवा खोज कार्यक्रम के लिए हेमी / होमोजीगस उत्परिवर्ती का एक बड़ा हैप्लोबैंक उत्पन्न किया।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेडरलैंड्स ऑर्गनाइजेशन वूर गेज़ोन्डहाइडोंडरज़ोक एन ज़ोर्गिनोवटी (ज़ोनएमडब्ल्यू 446002501), हेल्थ हॉलैंड (एलएसएचएम 19057-एच040), लीडिंग फेलो प्रोग्राम मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी कॉफंड और एसोसिएशन मलाडी डी रेंडू-ओस्लर (एएमआरओ) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Milipore, Merck 805740 Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble Difco, BD Pharmigen 214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG Life technologies A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95) BD Biosciences 553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) Peprotech 450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R Beckman Coulter 392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) Telstar 133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm Marienfeld 640211
Cell culture dishes 60 x 15mm Corning 353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm Corning 353801
Cell culture plates 12-well Corning 3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Biorad 1855196
Chicken serum Sigma-Aldrich C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl Selleckchem S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg Corning 354249
Collagenase A Roche 10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm Vwr 631-0146
DAPT γ?secretase inhibitor Sigma Aldrich D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone BioXcell BP0060
DC101 isotype rat IgG1 BioXcell BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438-5X Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Gibco, Thermofisher scientific 14200067
EDTA 40 mM Gibco, Thermofisher scientific 15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum Gibco, Thermofisher scientific 16141-079 Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R Eppendorf AG  Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) Roche 11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL) Milipore, Merck ESG1107
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-0ne 227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 Greiner Bio-One 739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 Greiner Bio-One 771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 Greiner Bio-One 740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) Sigma Aldrich F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) Biolegend 400605
Fluorscent mounting media DAKO S3023
Gascompress Cutisoft 45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm Bsn Medical 45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003 Whatman WHA10547922
Gelatin solution, type B Sigma-Aldrich G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM) Gibco, Thermofisher scientific 21710082
IHC Zinc Fixative BD Pharmigen 550523
IncuSafe CO2 Incubator PHCBi MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6) Roche 11138600001
L-Glutamine 200 mM Gibco, Thermofisher scientific 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco, Thermofisher scientific 11140035
Microscope slide box Kartell Labware 278
Microscope slide, Starfrost Knittel glass VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M) Gibco, Thermofisher scientific A24903 Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) ATCC SCRC-1033 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14 Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) ATCC SCRC-1011 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-1000
PD0325901 Selleckchem S1036
PDGF-BB, Recombinant Human Peprotech 100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse BD Biosciences 550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) Gibco, Thermofisher scientific 15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile Greiner Bio-One 633181
Pipetboy acu 2 Integra-Biosciences 155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G Gilson F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G Gilson F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP
RNeasy Plus mini Kit QIAGEN 74134
Serological pipettes, 10 mL Greiner Bio-One 607 180
Serological pipettes, 25 mL Greiner Bio-One 760 180
Serological pipettes, 5 mL Greiner Bio-One 606 180
Sodium hydroxide (NaOH) Merck 106498
Sodium pyruvate 100 mM Gibco, Thermofisher scientific 11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap Corning 352235
Thermal cycler, T100 Biorad 1861096
Triton X-100 (BioXtra) Sigma Aldrich T9284
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher scientific 15250061
Trypsin (2.5%) Gibco, Thermofisher scientific 15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL Corning 430758
VEGFA165 , recombinant murine Peprotech 450-32
Water, Sterile Fresenius-Kabi B230531
Waterbath, Lab-Line Digital Thermo Fischer Scientific 18052A

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References

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<em>इन विट्रो</em> संवहनी रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण के लिए माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस की त्रि-आयामी अंकुरण परख
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Galaris, G., Thalgott, J. H., Teston, E., Lebrin, F. P. G. In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing. J. Vis. Exp. (171), e62554, doi:10.3791/62554 (2021).

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