Summary
Denna analys använder musembryonala stamceller differentierade i embryoidkroppar odlade i 3D-kollagengel för att analysera de biologiska processerna som styr spirande angiogenes in vitro. Tekniken kan användas för att testa läkemedel, modellera sjukdomar och för att studera specifika gener i samband med deletioner som är embryoniskt dödliga.
Abstract
De senaste framstegen inom inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och genredigeringsteknik möjliggör utveckling av nya humana cellbaserade sjukdomsmodeller för fenotypiska läkemedelsupptäcktsprogram (PDD). Även om dessa nya produkter skulle kunna förutsäga säkerheten och effekten av prövningsläkemedel hos människor mer exakt, är deras utveckling till kliniken fortfarande starkt beroende av däggdjursdata, särskilt användningen av mussjukdomsmodeller. Parallellt med humana organoid- eller organ-på-chip-sjukdomsmodeller är utvecklingen av relevanta in vitro-musmodeller därför ett ouppfyllt behov av att utvärdera direkta läkemedelseffektivitets- och säkerhetsjämförelser mellan arter och in vivo- och in vitro-förhållanden. Här beskrivs en vaskulär groddanalys som använder musembryonala stamceller differentierade i embryoidkroppar (EB). Vaskulariserade EBs odlade på 3D-kollagengel utvecklar nya blodkärl som expanderar, en process som kallas spirande angiogenes. Denna modell rekapitulerar viktiga funktioner i in vivo spirande angiogenesbildning av blodkärl från ett befintligt vaskulärt nätverk - inklusive endotelspetscellval, endotelcellmigration och proliferation, cellvägledning, rörbildning och väggcellsrekrytering. Det är mottagligt för screening för läkemedel och gener som modulerar angiogenes och visar likheter med nyligen beskrivna tredimensionella (3D) vaskulära analyser baserade på human iPSC-teknik.
Introduction
Under de senaste tre decennierna har målbaserad läkemedelsupptäckt (TDD) använts i stor utsträckning vid läkemedelsupptäckt av läkemedelsindustrin. TDD innehåller ett definierat molekylärt mål som spelar en viktig roll i en sjukdom och bygger på utvecklingen av relativt enkla cellodlingssystem och avläsningar för läkemedelsscreening1. De flesta typiska sjukdomsmodeller som används i TDD-program inkluderar traditionella cellodlingsmetoder som cancerceller eller odödliga cellinjer odlade inom konstgjorda miljöer och icke-fysiologiska substrat. Även om många av dessa modeller har gett livskraftiga verktyg för att identifiera framgångsrika läkemedelskandidater, kan användningen av sådana system vara tveksam på grund av deras dåliga sjukdomsrelevans2.
För de flesta sjukdomar är de underliggande mekanismerna verkligen komplexa och olika celltyper, oberoende signalvägar och flera uppsättningar gener visar sig ofta bidra till en specifik sjukdomsfenotyp. Detta gäller även för ärftliga sjukdomar där den primära orsaken är en mutation i en enda gen. Med den senaste tillkomsten av humaninducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) och genredigeringsverktyg är det nu möjligt att generera 3D-organoider och organ-on-chip-sjukdomsmodeller som bättre kan rekapitulera in vivo mänsklig komplexitet 3,4. Utvecklingen av sådan teknik är förknippad med ett återupplivat intresse för fenotypiska läkemedelsupptäcktsprogram (PDD)1. PDD kan jämföras med empirisk screening, eftersom de inte förlitar sig på kunskap om identiteten hos ett specifikt läkemedelsmål eller en hypotes om dess roll i sjukdom. PDD-metoden erkänns nu alltmer för att starkt bidra till upptäckten av förstklassiga läkemedel5. Eftersom utvecklingen av human organoid- och organ-on-chip-teknik fortfarande är i sin linda förväntas iPSC-modeller (kompletterade med innovativa bild- och maskininlärningsverktyg6,7) inom en snar framtid tillhandahålla flera nya komplexa cellbaserade sjukdomsmodeller för läkemedelsscreening och tillhörande PDD-program för att övervinna den dåliga produktiviteten hos TDD-metoden8, 9.
Medan humana organoid- och organ-on-chip-modeller kan ge viktiga insikter om sjukdomskomplexitet och identifiering av nya läkemedel, är läkemedelsföring i ny klinisk praxis också starkt beroende av data från djurmodeller för att bedöma deras effektivitet och säkerhet. Bland dem är genetiskt modifierade möss verkligen de mest föredragna däggdjursmodellerna. De har många fördelar eftersom de har en relativt kort generationstid för däggdjur, har många liknande fenotyper som mänskliga sjukdomar och lätt kan manipuleras genetiskt. De används därför i stor utsträckning i program för läkemedelsupptäckt10. Att överbrygga klyftan mellan möss och människor är dock fortfarande en viktig utmaning11. Utvecklingen av in vitro-musmodeller som motsvarar humana organoid- och organ-on-chip-modeller skulle åtminstone delvis kunna fylla denna lucka, eftersom det kommer att möjliggöra direkta jämförelser av läkemedelseffektivitet och säkerhet mellan in vivo-data från möss och in vitro-data från människa.
Här beskrivs en vaskulär groddanalys i musembryoidkroppar (EB). Blodkärl består av endotelceller (inre beklädnad av kärlväggar), väggmålningar (vaskulära glattmuskelceller och pericyter)12. Detta protokoll är baserat på differentiering av musembryonala stamceller (mESC) till vaskulariserade EB med hjälp av hängande droppar som rekapitulerar de novo endotelcell- och väggcellsdifferentiering13,14. Mus ESC kan lätt etableras i kultur från isolerad dag 3.5 musblastocyster med olika genetisk bakgrund15. De ger också möjligheter till klonanalys, härstamningsspårning och kan enkelt manipuleras genetiskt för att generera sjukdomsmodeller13,16.
Eftersom blodkärlen ger näring åt alla organ är det inte förvånande att många sjukdomar, om inte alla, är förknippade med förändringar i mikrovaskulaturen. Vid patologiska tillstånd kan endotelceller anta ett aktiverat tillstånd eller kan bli dysfunktionellt vilket resulterar i väggcellsdöd eller migration bort från blodkärlen. Dessa kan resultera i överdriven angiogenes eller i kärlsällsynthet, kan inducera onormalt blodflöde och defekt blodkärlsbarriär som leder till extravasering av immunceller och inflammation12,17,18,19. Forskningen för utveckling av läkemedel som modulerar blodkärl är därför hög, och flera molekylära aktörer och koncept har redan identifierats för terapeutisk inriktning. I detta sammanhang är det beskrivna protokollet särskilt lämpligt för att bygga sjukdomsmodeller och för läkemedelstestning eftersom det rekapitulerar viktiga egenskaper hos in vivo-spirande angiogenes, inklusive endotelspets och stjälkcellsval, endotelcellsmigration och proliferation, endotelcellsvägledning, rörbildning och väggcellsrekrytering. Det visar också likheter med nyligen beskrivna 3D-vaskulära analyser baserade på human iPSC-teknik20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medieberedning och kultur av mESC
- Förbered konditionerat medium +/- (CM +/-) med tillägget 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium med 10% (vol / vol) värmeinaktiverat Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanol, 1x icke-essentiella aminosyror (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin och 1 mM natriumpyruvat.
- Förbered konditionerat medium +/+ (CM +/+) med tillägget CM +/- medium med leukemihämmande faktor (LIF) (1,500 U / ml) och 0,1 mM β-merkaptoetanol.
- Bered konditionerat medium +/+ i närvaro av två hämmare (CM+/+ 2i) med hjälp av tillägget CM+/+ medium med 1 μM PD0325901 och 3 μM CHIR99021.
- Förbered 0,1% gelatinlösning genom att blanda 25 ml förvärmd 2% gelatinlösning i 500 ml fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (DPBS).
- Förbered 10x trypsin versenfosfat (TVP 10x) buffert genom att blanda trypsin (2,5%) med TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% kycklingserum, 0,01% trypsin (2,5%) iH2O) (1:10 förhållande, vol / vol).
OBS: Filtrera alla lösningar genom ett 0,22 μm porfilter. Förvara odlingsmediet vid -20 °C under lång tid och förvara andra reagenser vid 4 °C i upp till 3 veckor (se Materialförteckning). - Belägg två 12-brunns cellodlingsplattor med 0,1% gelatinlösning (500 μL per brunn) och inkubera dem i 30 minuter i en CO 2-inkubator (37 °C, 5% CO2, fuktig atmosfär).
- Tvätta de gelatinbelagda plattorna med PBS och tillsätt 500 μL CM+/- medium.
- Tina två injektionsflaskor med 1 x 106 kryokonserverade bestrålade embryonala fibroblaster på mus (MEF) vid 37 °C och överför cellsuspensionen till ett koniskt rör med 5 ml CM+/- medium.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT). Aspirera mediet och resuspendera försiktigt cellpelleten i 12 ml CM+/- medium i en koncentration av 1,67 x 105 celler per ml.
- Så 500 μL MEF-suspension i en cellodlingsplatta med 12 brunnar (2,4 x 105 celler percm2) och inkubera plattan över natten (o/n) i en CO2-inkubator .
- Tina en injektionsflaska med kryokonserverade mESC (1 x 106) i CM+/+ 2i medium.
- Frö mESC-suspensionen på en förtvättad platta med 12 brunnar med MEF i 1 ml CM+/+ 2i-medium och överför plattan till en CO2-inkubator . Uppdatera mediet dagligen.
- Vid 70% sammanflöde, tvätta mESC-kolonierna med DPBS. Tillsätt 150 μL varm 10x TVP-buffert och inkubera vid RT i 30 s för att initiera enzymatisk dissociation.
- Ta försiktigt bort TVP-bufferten, suspendera cellerna igen i 1 ml CM+/+ 2i-medium och dissociera kolonierna till enskilda celler genom försiktig pipettering.
- Passera cellerna genom att överföra dem till en ny 12-brunns cellodlingsplatta med MEF (delningsförhållande: 1: 3-1: 5). Blanda försiktigt för att fördela cellerna och inkubera i en CO2-inkubator .
- Uppdatera odlingsmediet (2-3 ml) och observera celltillväxten/morfologin dagligen. Upprepa seriell passaging vid 70% sammanflöde var 2: e dag. Byt till CM +/+ medium för två passager innan celldifferentiering påbörjas.
2. EB-bildning i hängande droppe
- Bered färskt mesodermdifferentieringsmedium genom att komplettera CM+/- mediet med grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) (50 ng · ml-1) och med benmorfogenetiskt protein 4 (BMP-4) (5 ng · ml-1) och håll det vid 4 ° C tills användning.
- Belägg en brunn av 6-brunnscellodlingsplattan med 500 μL 0,1% gelatinlösning och placera den i en CO2-inkubator i 30 minuter.
- Tvätta de gelatinbelagda plattorna med PBS och tillsätt 500 μL CM+/- medium.
- För att erhålla en ren population av mESC, trypsinisera cellodlingsplattan med 10x TVP-buffert i 30 s vid RT, resuspendera cellerna i 1 ml mesodermdifferentieringsmedium och överför dem sedan till den gelatinbelagda 6-brunnsplattan i 30 minuter så att MEF kan fästa medan mESC förblir i suspension.
- Samla cellsuspensionen i ett 50 ml koniskt rör och räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-hemocytometer och Trypan-blått färgämne för uteslutning av levande / döda celler.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i mesodermdifferentieringsmediet för att nå 4,55 x 104 celler per ml.
- Fyll botten av 94 mm polystyrenskålar med låg fastsättning med 15 ml sterilt vatten.
OBS: Fyra rätter som innehåller hängande droppar (1,6 x 105 celler i 3,52 ml medium) kommer att krävas för att testa ett visst tillstånd med användning av 3D-spirande angiogenesanalys. - Överför cellsuspensionen till en steril plastbehållare och fyll fyra positioner på en flerkanalig pipett med 22 μL cellsuspension per kanal (1 x 103 celler per 22 μL droppe).
- Lyft och vänd upp och ned locket på 94 mm-skålen och placera den på flödesskåpets rena yta med insidan uppåt.
- Avsätt 40 droppar av cellsuspensionen på insidan av varje lock. Vänd försiktigt locket utan störningar och lägg tillbaka det på skålen så att dropparna vetter mot vattnet.
- Inkubera diskarna i en CO2-inkubator . Betrakta detta som differentiering dag 0. Håll plattorna i 4 dagar för att bilda EB.
3. Konkurrensanalys för spetscellens position
- Odla en fluorescerande och en icke-fluorescerande mESC-linje enligt tidigare beskrivits13. Som ett exempel används 7ACS/EYFP mESC märkta med gult och R1 mESC.
- Förbered mosaik EB genom att blanda lika stora mängder av de två mESC-linjerna (förhållandet 1: 1) och inkubera de hängande droppskålarna i en CO 2-inkubator enligt beskrivningen i steg2 .
4. Flytande EB-kultur för vaskulär differentiering
- Innan du samlar EB från de hängande dropparna, förbered följande.
- Bered 5 % agarlösning iH2Ooch sterilisera den i autoklav (20 min vid 120 °C).
- Använd den varma 5% agarlösningen för att förbereda G-MEM BHK-21-medium innehållande 1% agar och häll snabbt 3 ml i en av 60 mm polystyrenskålarna. Låt agarn stelna i 1 timme vid rumstemperatur. Förvara disken vid 4 °C tills den används.
- Bered färskt 2x vaskulärt differentieringsmedium genom att komplettera CM+/- mediet med bFGF (100 ng·ml-1) och VEGF-A (50 ng·ml-1). Förvara mediet vid 4 °C tills det används.
- Samla de hängande dropparna i ett 15 ml koniskt rör med en P1000-pipett och ta bort supernatanten efter några minuters EB-sedimentering.
- Resuspendera EB i 3 ml 2x vaskulärt differentieringsmedium, överför EB-suspensionen till en agardragerad skål och fördela EB homogent för att undvika aggregering.
- Inkubera disken i CO2-inkubatorn och uppdatera mediet varannan dag fram till dag 9 med 1x vaskulärt differentieringsmedium i närvaro av bFGF (50 ng·ml-1) och VEGF-A (25 ng·ml-1).
- Alternativt kan du tillsätta trombocythärledd tillväxtfaktor-BB (PDGF-BB) (10 ng·ml-1 dag 4 och 5 ng·ml-1 dag 6 och dag 8) till det vaskulära differentieringsmediet för att främja mural celldifferentiering.
5. Analys av flödescytometri
- Samla de 9 dagar gamla EB: erna i ett 15 ml koniskt rör med en P1000-pipett och tvätta dem en gång med varm PBS.
- Tillsätt 1 ml G-MEM BHK-21-medium innehållande 0,2 mg·ml-1 kollagenas A och inkubera cellerna i en CO2-inkubator i 5 minuter.
- Separera EB: erna genom att försiktigt pipettera upp och ner med en P1000-pipett.
- Stoppa kollagenasaktiviteten genom att tillsätta 1 ml kallt G-MEM BHK-21-medium med 10% FBS.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna i 500 μL PBS med 2% FBS.
- Räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-hemocytometer.
- Resuspendera 400 000 celler i 100 μL PBS med 2% FBS per färgningstillstånd.
- Inkubera cellerna i 45 minuter vid 4 °C med följande antikroppar: APC-konjugerad antimusanti-musantikropp mot mus PECAM-1 (klon MEC13.3) och FITC-konjugerad råttantimus CD45 (klon 30-F11) eller kontrollantikroppar av isotyp.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 ml PBS innehållande 2% FBS.
- Resuspendera cellerna för att nå en slutlig koncentration av 5 x 106 celler per ml.
- Filtrera cellerna med ett teströr av rund bottenpolystyren med ett snäpplock med en cellsil.
- Analysera 20 000 PECAM-1 (+)-händelser med flödescytometri.
6.3D grodd angiogenesanalys och immunofluorescensfärgning
- Vid dag 9, bereda ett groddmedium genom att tillsätta 10% FBS (vol / vol), bFGF (50 ng · ml-1), VEGF-A (25 ng · ml-1), humant rekombinant erytropoietin (hEPO) (20 ng · ml-1), humant interleukin-6 (IL-6) (10 ng · ml-1), 0,05 mM β-merkaptoetanol, NEAA (1x), L-glutamin (1x), natriumpyruvat (1x), typ I råttsvanskollagen (1,25 mg · ml-1), och NaOH (3,1 mM) till GMEM BHK-1-medium.
- För att undvika kollagengelering, behåll groddmediet på is tills det används.
- För att utvärdera effekten av pro/antiangiogena molekyler, tillsätt det valda läkemedlet eller vehikeln till groddmediet vid den valda koncentrationen.
- Samla 9 dagar gamla EB från en 60 mm agarskål i ett 15 ml koniskt rör (motsvarande ett tillstånd) och ta bort supernatanten efter några minuters sedimentering.
- Täck botten av en 35 mm odlingsskål med 1 ml groddmedium och inkubera vid 37 °C i 5 minuter för att inducera gelering.
- Resuspendera EB i 2 ml kallt groddmedium.
- Överför suspensionen till 35 mm odlingsskålen belagd med det första lagret av groddmedium.
- Fördela EB: erna över hela plattan och se till att de är på lika avstånd från varandra. Inkubera skålen i en CO2-inkubator . Den första groddbildningen sker inom 24-48 h.
- Vid dag 12 överförs kollagengelen som innehåller EBs försiktigt till en glasskiva (75 x 26 mm) med hjälp av en spatel.
- Ta bort överskottsvätskan med en pipett (P1000) och torka ut gelen genom att placera ett gasbindark av nylonlinne och absorberande filterkort (gelpapper) ovanpå gelén. Tryck på genom att placera en vikt (250 g) i 2 minuter. Ta försiktigt bort nylon-/filterpapperen och låt glasen lufttorka i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna tre gånger med PBS i 5 minuter vid RT.
- Fixera EB med zinklösning (se materialtabell) o/n vid 4 °C. Alternativt kan du fixera mosaikfluorescerande EB med paraformaldehyd (PFA) (4%) o / n vid 4 ° C i mörkret.
- Ta bort fixativet. Tvätta bilderna fem gånger med PBS i 5 min vid RT.
- Permeabilisera EBs i PBS innehållande 0,1% Triton-X100 i 15 minuter vid RT.
- Ta bort permeabiliseringslösningen. Tvätta bilderna fem gånger med PBS i 5 min.
- Inkubera EB i den blockerande bufferten (PBS med 2 % bovint serumalbumin, BSA) i 1 timme vid rumstemperatur.
- För att färga endotelgroddarna, använd en primär anti-PECAM-1-antiantikropp mot mus (spädning 1:100) för att blockera buffert o/n vid 4 °C.
- Tvätta bilderna fem gånger med PBS i 5 min.
- Inkubera objektglasen med getanti-råtta Alexa 555 sekundär antikropp i blockerande buffert (1:250 utspädning) och vid behov med FITC-konjugerad anti-α-SMA-antikropp i blockerande buffert (1:250 utspädning) för att färga väggmålningar i 2 timmar vid RT i mörkret.
- Tvätta glasen tre gånger med PBS i 5 minuter och en gång med H20 innan du monterar dem.
7. Konfokal avbildning, morfometrisk och kvantitativ analys av EB-endotelgroddar
- Skaffa högupplösta bilder av immunfärgade EB genom sammanslagning av fokalplan (z-stapling) med hjälp av ett konfokalmikroskop. Använd 10x förstoringsmål för att avbilda hela EB.
- Analysera de bilder som förvärvats med hjälp av ImageJ för att utvärdera morfologin och kvantifiera egenskaperna hos PECAM-1-positiva endotelgroddar enligt etablerade kvantifieringsmetoder13,14,21.
- Beräkna det genomsnittliga antalet endotelgroddar per EB genom att manuellt räkna det totala groddantalet per enskild EB.
- Mät de enskilda groddlängderna med ritverktyget ImageJ. Definiera basen av endotelspiran med början vid EB-kärnområdet och rita manuellt en linje tills groddspetsen slutar.
- Beräkna det genomsnittliga antalet spetsceller per grodd genom att manuellt räkna antalet spetsceller per enskild grodd och beräkna sedan medelvärdet per EB.
- Beräkna filopodiorienteringen genom att manuellt bestämma axeln på moderspiran och mäta den spetsiga vinkeln mellan dem med hjälp av ImageJ-programvaruvinkelverktyget. Beräkna antalet groddar med en orientering >50° och dela det med det totala antalet groddar av EB av intresse.
OBS: Vinklarna varierade alltid från 0° till 90°.
- Skaffa högupplösta bilder av immunfärgade EB med hjälp av ett konfokalmikroskop. Använd 40x förstoringsmål för att realisera högupplösta bilder av enstaka endotelspiror.
- Kvantifiera kärltäckningen av PECAM-1-positiva EC-groddar omgivna av α-SMA-positiva MCs med hjälp av ImageJ-programvaran.
- Dela upp de sammanfogade bilderna i separata röda och gröna kanaler.
- Konvertera bilderna till dess binära form.
- Mät den totala cellulära ytan av spiran upptaget separat av PECAM-1 (endotelceller märkta i rött) och med α-SMA (väggceller märkta i gröna) positiva celler.
- Generera den sammanfogade bilden med bildkalkylatorfunktionen och operatorn OCH. Mät bildens totala cellulära yta. För att beräkna täckningen, dela området för den samlokaliserade bilden med området för PECAM-1 binär bild.
- För att analysera cellkonkurrensen om endotelspets / stjälkcellposition hos groddar som utvecklats av mosaik EB, poängsätt manuellt antalet spetsceller och markera deras genotypiska ursprung baserat på fluorescenssignalen. Beräkna medelvärdena per EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollöversikten för analysen av blodkärlspiring visas i figur 1. Niodagar gamla EB härledda från tre oberoende 129/Ola mESC-linjer (Z/Red, R1 och E14) dissocierades enzymatiskt till enstaka celler med användning av kollagenas A. Celler färgades för PECAM-1 och analyserades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) enligt beskrivningen. Alla cellinjer uppvisade robust endoteldifferentiering, och inga skillnader i deras förmåga att differentiera till endotelceller observerades. Alla cellinjer producerade cirka 10,5% ± 1,3% av endotelcellerna (figur 2A). De relativa uttrycksnivåerna av PAN-endoteliella cellmarkörer i PECAM-1 (+)-cellpopulationerna kvantifierades också. MRNA-uttrycksnivåerna för alla analyserade markörer (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 och Cdh5) var jämförbara mellan cellinjerna och experimenten, vilket bekräftade robustheten hos differentieringsprotokollet (figur 2B). PECAM-1 (+) cellpopulationer uttryckte endast mycket låga mRNA-nivåer av arteriella (Notch1 och Efnb2) eller venösa (Couptf2 och Ephb4) markörer som stöder det relativt omogna tillståndet hos endotelcellerna som genererades av protokollet (figur 2C).
Därefter demonstrerades förmågan hos den vaskulära spirande EB-modellen att screena för läkemedel som modulerar angiogenes (figur 3). DC101 och DAPT (N-[N-(3,5-difluorfenacetyl)-Lalanyl]-S-fenylglycin t-butylester) testades. Dessa föreningar används ofta hos möss för att respektive blockera angiogenes genom att hämma VEGFR2-aktivitet eller för att främja endotelial spetscelldifferentiering och bildandet av en tät vaskulär plexus genom att rikta in sig på Notch-signalering (figur 3A). Både VEGF- och Notch-signalvägar är viktiga regulatorer för spirande angiogenes in vivo. Effekterna av olika koncentrationer av DC101 och DAPT i EBs pläterade i kollagen I utvärderades. Höga doser av DC101 från 6-30 mg· L-1 hämmade både antalet och längden på kärlspirorna medan DAPT hade motsatta effekter vid dosen 1 μmol· L-1 (figur 3B-C). Bilder med hög förstoring av kärlgroddar färgade för PECAM-1 av EB odlade i närvaro av DAPT tillhandahålls också (figur 3D). DAPT även vid låga doser från 0,5-1 μmol· L-1 ökade kraftigt antalet endotelspetsceller med kärlspiror som hade en missvisande fenotyp (figur 3D-F). Hög dos DAPT ledde också till kärlkoalescens och bildandet av stora och platta endotelcellområden utan organisation (figur 3A). Resultaten bekräftade modellens förmåga att testa läkemedel som antingen främjar eller hämmar angiogenes.
För att bekräfta att denna modell är lämplig för att efterlikna kärlsjukdomar tillhandahålls konfokala bilder av EBs härledda från Acvrl1+/- mESC. Acvrl1-genen kodar för ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), en receptor som specifikt uttrycks i endotelceller som om den muteras är ansvarig för utvecklingen av en vaskulär sällsynt sjukdom med angiodysplasi som heter Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT). En hög förstoringsbild av Acvrl1+/- endotelgroddarna avslöjade att de hade fler endotelspetsceller och fler grenar per grodd som var i slumpmässiga vinklar i förhållande till moderkärlen. Dessa bekräftade in vitro en missvisande fenotyp som observerats hos HHT-möss (figur 4).
Genom att bilda chimära EB som innehåller differentierad mESC fluorescerande märkt och mESC av en viss genotyp ingår ett alternativt protokoll för att studera processen för val av endotelspets (figur 5A-C). En konfokal bild av PECAM-1-märkta kärlgroddar identifierade det genotypiska ursprunget för de ledande endotelspetscellerna (figur 5B). Blandningar av en vildtyp YFP (gulfluorescerande protein) mESC-linje i förhållandet 1: 1 med en omärkt mESC-vildtyplinje ledde konsekvent till lika bidrag från varje population till de ledande endotelspetscellerna (figur 5C).
Detta protokoll är också lämpligt för kvantifiering av väggcellstäckning av kärlspiran. EB som genomgår angiogenes fixerades och färgades för PECAM-1 (endotelceller, röda) och för α-glatt muskelaktin (α-SMA) (väggceller, gröna) (figur 5D). En bild med hög förstoring avslöjade hur ett enskilt kärl grodde omgavs av väggmålningar (figur 5E, vänster). Binär transformation utfördes efter färgkanalseparation (figur F-G) för att kvantifiera förhållandet mellan PECAM-1 (+) kärl täckt av α-SMA (+) väggmålningar med hjälp av ImageJ-programvaran (figur 5H).
Bild 1: Tidslinje för protokollprocedurerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av ECs härledda från mESC vaskulär differentiering inuti EBs. (A) Flödescytometrisk analys av CD31-uttryck från 9-dagars EB och kvantifiering av procentandelen Pecam-1 (+) celler. (BD) mRNA-uttrycksnivåer av Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 och EphB4 i sorterade endotelceller från 9-dagars gamla EB. Felstaplar representerar medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: 3D-groningsangiogenesanalys för drogtestning. (A) Konfokala bilder av tre representativa EB färgade för Pecam-1 (vita, endotelceller) behandlade med enbart vehikel, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) eller DC101 (3 mg· L-1, 6 mg· L-1, 30 mg· L-1). (B) Kvantifiering av antalet groddar per EB. C) Kvantifiering av groddlängden. (D) På den övre vänstra panelen, hög förstoring av endotelgroddar som visar nätverkets komplexitet och grenpunkten räknat på två olika lager från samma EB, på den nedre vänstra panelen en schematisk illustration som representerar mätmetoden för endotelspirans orientering. På den övre högra panelen, hög förstoring av endotelgroddar från fordonet ensam och på den nedre högra panelen, hög förstoring av endotelgroddar från DAPT (0,5 μmol · L-1) skick. E) Kvantifiering av antalet spetsceller per grodd. F) Kvantifiering av procentandelen filopodier inom vinkeln >50°. Alla staplar representerar medelvärde ± SEM och p-värden från oparade, enkelriktade ANOVA-test. ns = icke-signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 och ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Defekt kärlspiring i ärftliga hemorragiska telangiektasi EB. På den övre panelen, konfokala bilder av representativa 12 dagar gamla EB från Acvrl1+/+ och Acvrl1+/- genotyper färgade för Pecam-1 (vita, endotelceller). På den nedre panelen, hög förstoring av Acvrl1 +/- endotelgroddar (vit ruta från övre panelen) som visar många spetsceller (röda pilar), endotelgrenpunkter (blå prickar) och spirande missvisande fenotyp (gröna pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Studie av spets-/stjälkcellposition och kärlmognad med hjälp av 3D-groddningsanalysen. (A) Konfokalbild av en representativ 12 dagar gammal chimär EB tillverkad av R1 vildtypcellinje blandad 1: 1 med 7ACS / EYFP vildtypcellinje färgad för Pecam-1 (röda, endotelceller). Röda pilar indikerar spetsceller från R1-cellinjen och gröna pilar indikerar spetsceller från 7ACS / EYFP-cellinjen. (B) Hög förstoring av en endotelgrodd som visar fördelningen av R1 och 7ACS/EYFP endotelceller längs grodden. c) Kvantifiering av de relativa genotypningsspetscellerna från representativa EB av vildtyp. (D) Konfokalbild av en representativ 12 dagar gammal EB färgad för Pecam-1 (röda, endotelceller) och α-SMA (gröna, väggceller). (E) Hög förstoring av en endotelgrodd (vit rektangulär prickad ruta från D) som visar väggmålning/endotelcellinteraktion. (F-G) Bilder av den färgade endotelspiran och deras associerade binära transformerade bilder. (H) Binär bild av samlokaliserad Pecam-1 och α-SMA-färgning. Förhållandet mellan endotelcellspiror täckta av väggceller. Alla staplar representerar medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en opartisk, robust och reproducerbar 3D EB-baserad vaskulär groddanalys som är mottaglig för screening för läkemedel och gener som modulerar angiogenes. Denna metod erbjuder fördelar jämfört med många allmänt använda tvådimensionella (2D) analyser som använder endotelcellkulturer såsom humana navelvenendotelceller (HUVEC) för att övervaka migration (lateral scratch assay eller Boyden chamber assay)22,23 eller proliferation (räkning av cellantal, detektion av DNA-syntes, detektion av proliferationsmarkörer eller metaboliska analyser)24 genom att det unikt möjliggör studier av både endotelial och väggcellsdifferentiering och deras organisation i ett vaskulärt nätverk som efterliknar viktiga steg för spirande angiogenes. Dessa steg inkluderar endotelspetscellval, proliferation av stjälkcellerna, rumslig orientering och migration av kärlspiran och rekrytering av väggceller till det framväxande blodkärlet25. Det erbjuder också fördelar för många 3D-angiogenesmodeller. Fibrinpärlan 26,27 eller kollagengelanalysen28,29,30 som efterliknar tubulogenesen använder vanligtvis HUVECs eller Endothelial Colony Forming Cells derived Endothelial Cells (ECFC-EC) eftersom de har en hög proliferativ hastighet men inte är lämpliga för primära endotelceller från möss som är svåra att upprätthålla i odling. Ex vivo retina explant31 eller vaskulariserad mikroorgananalys32 kan rekapitulera väl alla blodkärlsbildningssteg, men de har komplexa experimentella procedurer och är inte lämpliga för läkemedels- eller genetisk screening med hög kapacitet. Detta gäller även ex vivo-aorta-ringanalys 33,34 och många in vivo-analyser såsom tumör implanterad i möss eller studier av funktionsförlust hos möss som ofta har höga kostnader och svårigheter att erhålla stora mängder data 35. Detta protokoll kompletterar också liknande in vitro-angiogenesanalyser med humana iPSC, vilket möjliggör jämförelser mellan mus- och humandata. Även om det är viktigt att notera att humana iPSC-härledda endotelceller visar mindre förmåga att gro än muscellerna36,37.
Metoden som utvecklas här har också vissa begränsningar. Det kan inte utvärdera effekterna av vätskeflöde på blodkärlens mognad, kärlpermeabilitet och producerar inte begynnande blodkärl i en specifik vävnadsmiljö jämfört med nyligen mikrofabricerade enheter som är under utveckling. Faktum är att organ-on-chip-teknik som kombinerar mikrofluidik med vävnadsteknik kan ge odlade endotelceller en mikromiljö som liknar den in vivo38,39. Mikrofluidiska system innehåller rätt extracellulär matrissammansättning och är utformade för att producera mekaniska signaler såsom skjuvspänning. Vissa är utformade för att införliva väggmålningar och andra stödjande celler i en given vävnad eller kan generera kemiska gradienter. De innehåller nätverk av vätskefyllda kanaler i mikronskala som är lika stora och strukturella som blodkapillärerna. Organ-on-chip-teknologierna möjliggör också kvantifiering av specifika vaskulära funktioner, inklusive permeabiliteten och det transendoteliala elektriska motståndet. Även om organ-on-chip-teknik erbjuder löfte, är de så långt bortom forskningsexpertisen hos de flesta biologiska laboratorier, behöver fortfarande korrekt standardisering och kräver specialiserade tillverkningstekniker. Kommersialiseringen av organ-on-chip-tekniktillverkning har bara börjat, och dessa system anses vara kostnads- och tidsoöverkomliga för läkemedelsföretag för närvarande40,41.
Det finns flera kritiska steg som bör beaktas. Använd högkvalitativa celler som robust uttrycker väl accepterade markörer (Nanog, Oct4, Sox2 och SSEA-1) för det pluripotenta tillståndet. Det är viktigt att noggrant övervaka deras tillväxt, mES-cellform och storleken och morfologin hos mES-kolonier. Eftersom karyotypisk stabilitet är stokastisk i odlade celler är det viktigt att omvärdera den efter omfattande passage. Det rekommenderas att använda produkter som redan testats för mESC-odling och testa MEF-matare, fosterkalvserum och alla kemiska föreningar i flera passager för att detektera om mESC bibehåller sina cellulära egenskaper eller om de differentierar eller förvärvar en epiblastisk fenotyp. Mediet bör uppdateras dagligen och mESC-kolonier bör inte tillåtas bli för stora och täta. Slutligen måste mESC odlas åtminstone för två passager utan 2i före differentiering för att säkerställa bästa utbyte av endotelceller.
Endoteldifferentieringen innefattar två viktiga steg: bildandet av EB med användning av hängande droppmetoden och deras kultur under flytande förhållanden i närvaro av vaskulärt differentieringsmedium13,14. Förflyttning av hängande droppskålar bör minimeras för att uppnå enhetlig cellaggregering. Antalet mESC som används för att bilda ett aggregat varierar i de flesta fall mellan 800-1000 celler, men det kan behöva optimeras om mESC har en annan genetisk bakgrund än 129 / ola för att säkerställa en optimal differentiering till vaskulariserade EB. När de odlas under flytande förhållanden måste EB fördelas noggrant och undvika rörelse som gynnar EB-klumpning.
EBs odlas slutligen i kollagen I-gel för att bilda kärlspiror. Angiogent medium bör vara nyberedd och när det blandas med kollagen måste jag hållas på is för att undvika spontan gelering. Vid drogtestning tillsätts läkemedel i den kalla blandningen i rätt koncentration under detta steg. Justering av pH med NaOH innan EB återsuspenderas är avgörande, annars kommer kollagensyra att orsaka celltoxicitet. Slutligen bör EB spridas på lika avstånd från varandra för att säkerställa reproducerbara resultat.
Sammanfattningsvis introducerar denna metod en 3D-vaskulär groddanalys baserad på mESC som har den robusthet och skalbarhet som krävs för att användas för genetisk screening som nyligen beskrivits av Elling U. et al. som genererade en stor haplobank av hemi/homozygot mutant mESC16 och för fenotypiskt läkemedelsupptäcktsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND och av Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
- Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
- Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
- Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
- Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
- Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
- Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
- Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G.
- Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
- Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
- van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
- Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
- Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
- Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
- Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
- Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
- Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
- Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
- Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17 (2020).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
