Summary
Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.
Abstract
Los avances recientes en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y tecnologías de edición de genes permiten el desarrollo de nuevos modelos de enfermedades basadas en células humanas para programas de descubrimiento fenotípico de fármacos (PDD). Aunque estos nuevos dispositivos podrían predecir la seguridad y eficacia de los medicamentos en investigación en humanos con mayor precisión, su desarrollo a la clínica todavía depende en gran medida de los datos de mamíferos, especialmente el uso de modelos de enfermedades de ratón. Paralelamente a los modelos de enfermedades organoides u órganos en chip humanos, el desarrollo de modelos relevantes de ratón in vitro es, por lo tanto, una necesidad insatisfecha para evaluar la eficacia directa de los medicamentos y las comparaciones de seguridad entre especies y las condiciones in vivo e in vitro . Aquí, se describe un ensayo de germinación vascular que utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides (EB). Los EB vascularizados cultivados en gel de colágeno 3D desarrollan nuevos vasos sanguíneos que se expanden, un proceso llamado angiogénesis germinada. Este modelo recapitula las características clave de la angiogénesis germinada in vivo , la formación de vasos sanguíneos a partir de una red vascular preexistente, incluida la selección de células de la punta endotelial, la migración y proliferación de células endoteliales, la guía celular, la formación de tubos y el reclutamiento de células murales. Es susceptible de detección de fármacos y genes que modulan la angiogénesis y muestra similitudes con los ensayos vasculares tridimensionales (3D) recientemente descritos basados en tecnologías iPSC humanas.
Introduction
En las últimas tres décadas, el descubrimiento de fármacos basado en objetivos (TDD) ha sido ampliamente empleado en el descubrimiento de fármacos por la industria farmacéutica. TDD incorpora un objetivo molecular definido que desempeña un papel importante en una enfermedad y se basa en el desarrollo de sistemas de cultivo celular relativamente simples y lecturas para el cribado de fármacos1. Los modelos de enfermedad más típicos utilizados en los programas TDD incluyen métodos tradicionales de cultivo celular, como células cancerosas o líneas celulares inmortalizadas cultivadas en entornos artificiales y sustratos no fisiológicos. Aunque muchos de estos modelos han proporcionado herramientas viables para identificar candidatos a fármacos exitosos, el uso de tales sistemas puede ser cuestionable debido a su escasa relevancia de la enfermedad2.
Para la mayoría de las enfermedades, los mecanismos subyacentes son de hecho complejos y a menudo se encuentran varios tipos de células, vías de señalización independientes y múltiples conjuntos de genes que contribuyen a un fenotipo específico de la enfermedad. Esto también es cierto para las enfermedades hereditarias donde la causa principal es una mutación en un solo gen. Con el reciente advenimiento de las tecnologías de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y las herramientas de edición de genes, ahora es posible generar organoides 3D y modelos de enfermedades de órgano en chip que podrían recapitular mejor la complejidad humana in vivo 3,4. El desarrollo de tales tecnologías está asociado con un resurgimiento del interés en los programas de descubrimiento fenotípico de fármacos (PDD)1. El PDD se puede comparar con el cribado empírico, ya que no se basan en el conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico o en una hipótesis sobre su papel en la enfermedad. El enfoque PDD es ahora cada vez más reconocido por contribuir fuertemente al descubrimiento de fármacos de primera clase5. Debido a que el desarrollo de las tecnologías de organoides humanos y de órganos en chip aún está en su infancia, se espera que los modelos iPSC (complementados con herramientas innovadoras de imagen y aprendizaje automático6,7) proporcionen, en un futuro próximo, múltiples modelos novedosos de enfermedades complejas basadas en células para la detección de fármacos y programas de PDD asociados para superar la baja productividad del enfoque TDD8, 9.
Si bien los modelos de organoides humanos y órganos en chip pueden proporcionar información importante sobre la complejidad de la enfermedad y la identificación de nuevos fármacos, la incorporación de fármacos a la nueva práctica clínica también depende en gran medida de los datos de modelos animales para evaluar su eficacia y seguridad. Entre ellos, los ratones modificados genéticamente son sin duda los modelos de mamíferos más preferidos. Tienen muchas ventajas, ya que tienen un tiempo de generación relativamente corto para los mamíferos, tienen muchos fenotipos similares a las enfermedades humanas y pueden manipularse genéticamente fácilmente. Por lo tanto, son ampliamente utilizados en programas de descubrimiento de fármacos10. Sin embargo, cerrar la brecha entre ratones y humanos sigue siendo un desafío importante11. El desarrollo de modelos de ratón in vitro equivalentes a los modelos de organoides humanos y de órgano en chip podría llenar al menos parcialmente este vacío, ya que permitirá comparaciones directas de eficacia y seguridad de los medicamentos entre los datos in vivo de ratones y humanos in vitro .
Aquí, se describe un ensayo de germinación vascular en cuerpos embrioides (EB) de ratón. Los vasos sanguíneos están compuestos por células endoteliales (revestimiento interno de las paredes de los vasos), células murales (células del músculo liso vascular y pericitos)12. Este protocolo se basa en la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) en EBs vascularizadas utilizando gotitas colgantes que recapitulan la diferenciación de novo de células endoteliales y células murales13,14. Las ESCs de ratón pueden establecerse fácilmente en cultivo a partir de blastocistos de ratón aislados del día 3,5 con diferentes antecedentes genéticos15. También ofrecen posibilidades para el análisis clonal, el rastreo del linaje y pueden ser fácilmente manipulados genéticamente para generar modelos de enfermedades13,16.
Como los vasos sanguíneos nutren todos los órganos, no es sorprendente que muchas enfermedades, si no todas, estén asociadas con cambios en la microvasculatura. En condiciones patológicas, las células endoteliales pueden adoptar un estado activado o pueden volverse disfuncionales, lo que resulta en la muerte de las células murales o la migración lejos de los vasos sanguíneos. Estos pueden resultar en angiogénesis excesiva o en rarefacción de los vasos, pueden inducir un flujo sanguíneo anormal y una barrera de vasos sanguíneos defectuosa que conduce a la extravasación de células inmunes e inflamación12,17,18,19. La investigación para el desarrollo de fármacos moduladores de los vasos sanguíneos es, por lo tanto, alta, y ya se han identificado múltiples actores y conceptos moleculares para la orientación terapéutica. En este contexto, el protocolo descrito es particularmente adecuado para construir modelos de enfermedades y para pruebas de drogas, ya que recapitula las características clave de la angiogénesis germinada in vivo, incluida la selección de células de la punta endotelial y el tallo, la migración y proliferación de células endoteliales, la guía de células endoteliales, la formación de tubos y el reclutamiento de células murales. También muestra similitudes con ensayos vasculares 3D recientemente descritos basados en tecnologías iPSC humanas20.
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Protocol
1. Preparación de los medios de comunicación y cultura de mESC
- Prepare el medio acondicionado +/- (CM+/-) usando el suplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medio con 10% (vol/vol) de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS), 0.05 mM β-mercaptoetanol, 1x aminoácidos no esenciales (NEAA 1x), 2 mM L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio.
- Preparar medio acondicionado +/+ (CM+/+) usando el suplemento CM+/- medio con factor inhibidor de leucemia (LIF) (1,500 U/mL) y 0.1 mM β-mercaptoetanol.
- Preparar medio acondicionado +/+ en presencia de dos inhibidores (CM+/+ 2i) utilizando el suplemento CM+/+ medio con 1 μM PD0325901 y 3 μM CHIR99021.
- Prepare una solución de gelatina al 0,1% mezclando 25 ml de solución de gelatina al 2% precalentada en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (DPBS).
- Prepare 10x tampón de tripsina versene fosfato (TVP 10x) mezclando tripsina (2,5%) con TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% de suero de pollo, 0,01% de tripsina (2,5%) enH2O) (relación 1:10, vol/vol).
NOTA: Filtre todas las soluciones a través de un filtro de poros de 0,22 μm. Conservar el medio de cultivo a -20 °C durante un largo plazo y mantener otros reactivos a 4 °C durante un máximo de 3 semanas (ver Tabla de materiales). - Cubrir dos placas de cultivo celular de 12 pocillos con solución de gelatina al 0,1% (500 μL por pocillo) e incubarlas durante 30 min en una incubadora de CO2 (37 °C, 5%CO2, atmósfera húmeda).
- Lave las placas recubiertas de gelatina con PBS y agregue 500 μL de CM + / - medio.
- Descongele dos viales de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados criopreservados a 1 x 106 a 37 °C y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico con 5 ml de medio CM+/-.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar el medio y resuspender suavemente el pellet celular en 12 mL de CM+/- medio a una concentración de 1.67 x 105 células por mL.
- Sembrar 500 μL de suspensión de MEF en una placa de cultivo celular de 12 pocillos (2,4 x 105 células por cm2) e incubar la placa durante la noche (o/n) en una incubadora deCO2 .
- Descongele un vial de mESCs criopreservadas (1 x 106) en medio CM+/+ 2i.
- Sembrar la suspensión mESC en una placa prelavada de 12 pocillos con MEFs en 1 mL de medio CM+/+ 2i y transferir la placa a una incubadora deCO2 . Refresque el medio diariamente.
- Al 70% de confluencia, lavar las colonias mESC con DPBS. Añadir 150 μL de tampón TVP caliente 10x e incubar a RT durante 30 s para iniciar la disociación enzimática.
- Retire con cuidado el tampón TVP, resuspenda las células en 1 ml de medio CM+/+ 2i y disocie las colonias en células individuales mediante un pipeteo suave.
- Pasar las células transfiriéndolas a una nueva placa de cultivo celular de 12 pocillos con MEFs (relación de división: 1:3-1:5). Mezclar suavemente para distribuir las células e incubar en una incubadora deCO2 .
- Refresque el medio de cultivo (2-3 mL) y observe diariamente el crecimiento/morfología celular. Repita el paso en serie al 70% de confluencia cada 2 días. Cambie al medio CM+/+ durante dos pasajes antes de iniciar la diferenciación celular.
2. Formación de EB en gota colgante
- Preparar el medio fresco de diferenciación de mesodermo complementando el medio CM+/- con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (50 ng·mL-1) y con proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) y mantenerlo a 4 °C hasta su uso.
- Cubra un pocillo de la placa de cultivo celular de 6 pocillos con 500 μL de solución de gelatina al 0,1% y colóquelo en una incubadora deCO2 durante 30 minutos.
- Lave las placas recubiertas de gelatina con PBS y agregue 500 μL de CM + / - medio.
- Para obtener una población pura de mESCs, tripsinizar la placa de cultivo celular con tampón TVP 10x durante 30 s en RT, resuspender las células en medio de diferenciación de mesodermo de 1 ml y luego transferirlas a la placa de 6 pocillos recubierta de gelatina durante 30 minutos permitiendo que los MEFs se adhieran mientras los mESCs permanecen en suspensión.
- Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y cuente las células con un hemocitómetro Neubauer y un colorante azul de Trypan para una exclusión de células vivas / muertas.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a RT. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en medio de diferenciación del mesodermo para alcanzar 4,55 x 104 células por ml.
- Llene el fondo de los platos de poliestireno de baja fijación de 94 mm con 15 ml de agua estéril.
NOTA: Se necesitarán cuatro platos que contengan gotas colgantes (1.6 x 105 células en 3.52 ml de medio) para probar una condición particular utilizando el ensayo de angiogénesis de brotes 3D. - Transfiera la suspensión celular a un depósito de plástico estéril y cargue cuatro posiciones de una pipeta multicanal con 22 μL de suspensión celular por canal (1 x 103 células por gota de 22 μL).
- Levante e invierta la tapa del plato de 94 mm y colóquelo en la superficie limpia del armario de flujo con el lado interior hacia arriba.
- Deposite 40 gotas de la suspensión celular en la superficie interna de cada tapa. Invierta cuidadosamente la tapa sin molestias y colóquela de nuevo en el plato, de modo que las gotas miren hacia el agua.
- Incubar los platos en una incubadora deCO2 . Considere esto como diferenciación día 0. Mantenga las placas durante 4 días para formar EB.
3. Ensayo de competición para la posición de la celda de la punta
- Cultivar una línea mESC fluorescente y una no fluorescente como se describió anteriormente13. Como ejemplo, se utilizan mESCs 7ACS/EYFP etiquetados en amarillo y mESCs R1.
- Prepare EB mosaico mezclando cantidades iguales de las dos líneas mESC (relación 1:1) e incube los platos colgantes en una incubadora deCO2 como se describe en el paso 2.
4. Cultivo de EBs flotantes para diferenciación vascular
- Antes de recoger los EB de las gotas colgantes, prepare lo siguiente.
- Preparar la solución de agar al 5% enH2Oy esterilizarla en autoclave (20 min a 120 °C).
- Use la solución tibia de agar al 5% para preparar el medio G-MEM BHK-21 que contiene agar al 1% y vierta rápidamente 3 ml en uno de los platos de poliestireno de 60 mm. Dejar que el agar se solidifique durante 1 h en RT. Conservar los platos a 4 °C hasta su uso.
- Preparar medio fresco de diferenciación vascular 2x complementando el medio CM+/- con bFGF (100 ng·mL-1) y VEGF-A (50 ng·mL-1). Conservar el medio a 4 °C hasta su uso.
- Recoja las gotas colgantes en un tubo cónico de 15 ml con una pipeta P1000 y retire el sobrenadante después de unos minutos de sedimentación EB.
- Resuspender las EB en 3 mL de medio de diferenciación vascular 2x, transferir la suspensión EB a un plato recubierto de agar y distribuir las EB homogéneamente para evitar la agregación.
- Incubar los platos en incubadora deCO2 y refrescar el medio cada 2 días hasta el día 9 utilizando 1x medio de diferenciación vascular en presencia de bFGF (50 ng·mL-1) y VEGF-A (25 ng·mL-1).
- Alternativamente, agregue el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 el día 4 y 5 ng·mL-1 el día 6 y el día 8) al medio de diferenciación vascular para promover la diferenciación celular mural.
5. Análisis de citometría de flujo
- Recoja los EB de 9 días de edad en un tubo cónico de 15 ml con una pipeta P1000 y lávelos una vez con PBS caliente.
- Añadir 1 ml de G-MEM BHK-21 medio que contenga 0,2 mg·mL-1 de colagenasa A e incubar las células en una incubadora deCO2 durante 5 min.
- Disocie los EB pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000.
- Detenga la actividad de la colagenasa agregando 1 ml de medio frío G-MEM BHK-21 con 10% de FBS.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min en RT.
- Resuspender las células en 500 μL de PBS con 2% de FBS.
- Contar las células con un hemocitómetro Neubauer.
- Resuspender 400.000 células en 100 μL de PBS con 2% de FBS por condición de tinción.
- Incubar las células durante 45 min a 4 °C con los siguientes anticuerpos: anticuerpo PECAM-1 anti-ratón de rata conjugado APC (clon MEC13.3) y anticuerpos de control anti-ratón de rata conjugados FITC (clon 30-F11) o anticuerpos de control de isotipo.
- Lave las células dos veces con 1 ml de PBS que contenga 2% de FBS.
- Resuspender las células para alcanzar una concentración final de 5 x 106 células por ml.
- Filtre las células con un tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con una tapa de presión del filtro celular.
- Analizar 20.000 eventos PECAM-1 (+) mediante citometría de flujo.
6.3D ensayo de angiogénesis de brotes y tinción de inmunofluorescencia
- En el día 9, preparar un medio de germinación añadiendo 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoyetina humana recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleucina-6 humana (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoetanol, NEAA (1x), L-glutamina (1x), piruvato de sodio (1x), colágeno de cola de rata tipo I (1,25 mg·mL-1), y NaOH (3,1 mM) a medio GMEM BHK-1.
- Para evitar la gelificación del colágeno, mantenga el medio de germinación en hielo hasta su uso.
- Para evaluar el efecto de las moléculas pro/antiangiogénicas, agregue el fármaco o vehículo seleccionado al medio de germinación a la concentración seleccionada.
- Recoja EB de 9 días de edad de una placa de agar de 60 mm en un tubo cónico de 15 ml (equivalente a una condición) y retire el sobrenadante después de unos minutos de sedimentación.
- Cubrir el fondo de una placa de cultivo de 35 mm con 1 ml del medio de germinación e incubar a 37 °C durante 5 min para inducir la gelificación.
- Resuspender los EB en 2 ml de medio de germinación en frío.
- Transfiera la suspensión a la placa de cultivo de 35 mm recubierta con la primera capa de medio de brotación.
- Distribuya los EB por toda la placa y asegúrese de que estén a la misma distancia entre sí. Incubar el plato en una incubadora deCO2 . La primera formación de brotes ocurre dentro de las 24-48 h.
- En el día 12, el gel de colágeno que contiene EB se transfiere cuidadosamente a un portaobjetos de vidrio (75 x 26 mm) utilizando una espátula.
- Retire el exceso de líquido con una pipeta (P1000) y deshidrate el gel colocando una gasa de lino de nylon y tarjetas de filtro absorbentes (papel secante de gel) encima del gel. Aplicar presión colocando un peso (250 g) durante 2 min. Retire con cuidado los papeles de nylon/filtro y deje que las guías se sequen al aire durante 30 minutos en RT.
- Lave las diapositivas tres veces con PBS durante 5 minutos en RT.
- Fijar los EB con solución de zinc (ver Tabla de materiales) o/n a 4 °C. Alternativamente, fijar los EB fluorescentes en mosaico con paraformaldehído (PFA) (4%) o/n a 4 °C en la oscuridad.
- Retire el fijador. Lave las diapositivas cinco veces con PBS durante 5 minutos en RT.
- Permeabilizar los EBs en PBS que contienen 0,1% Triton-X100 durante 15 min a RT.
- Retire la solución de permeabilización. Lave las diapositivas cinco veces con PBS durante 5 minutos.
- Incubar los EB en el tampón de bloqueo (PBS con albúmina sérica bovina al 2%, BSA) durante 1 h a RT.
- Para teñir los brotes endoteliales, utilice un anticuerpo primario anti-PECAM-1 anti-ratón de rata (dilución 1:100) para bloquear el tampón o/n a 4 °C.
- Lave las diapositivas cinco veces con PBS durante 5 minutos.
- Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario Alexa 555 anti-rata de cabra en tampón de bloqueo (dilución 1:250) y, cuando sea necesario, con el anticuerpo anti-α-SMA conjugado con FITC en tampón de bloqueo (dilución 1:250) para teñir las células murales durante 2 h a RT en la oscuridad.
- Lave las diapositivas tres veces con PBS durante 5 minutos y una vez con H20 antes de montarlas.
7. Análisis confocal de imágenes, morfométrico y cuantitativo de brotes endoteliales de EB
- Adquiera imágenes de alta resolución de los EB inmunoteñidos mediante la fusión del plano focal (apilamiento z) utilizando un microscopio confocal. Utilice un objetivo de ampliación de 10x para obtener imágenes de EB completos.
- Analizar las imágenes adquiridas utilizando ImageJ para evaluar la morfología y cuantificar las características de los brotes endoteliales PECAM-1 positivos según los métodos de cuantificación establecidos13,14,21.
- Calcule el número medio de brotes endoteliales por EB contando manualmente el número total de brotes por EB individuales.
- Mida las longitudes de los brotes individuales con la herramienta de dibujo ImageJ. Defina la base del brote endotelial comenzando en el área central de EB y dibuje manualmente una línea hasta el final de la punta del brote.
- Calcule el número medio de células de punta por brote contando manualmente el número de células de punta por brote individual y luego calcule la media por EB.
- Calcule la orientación de los filopodios determinando manualmente el eje del brote padre y mida el ángulo agudo entre ellos utilizando la herramienta de ángulo del software ImageJ. Calcule el número de brotes con una orientación >50° y divídalo por el número total de brotes del EB de interés.
NOTA: Los ángulos siempre oscilaron entre 0° y 90°.
- Adquiera imágenes de alta resolución de los EB inmunoteñidos utilizando un microscopio confocal. Utilice un objetivo de aumento de 40x para obtener imágenes de alta resolución de brotes endoteliales individuales.
- Cuantifique la cobertura del recipiente de brotes EC positivos para PECAM-1 rodeados de MC positivos para α-SMA utilizando el software ImageJ.
- Divida las imágenes combinadas en canales rojos y verdes separados.
- Convierta las imágenes en su forma binaria.
- Mida el área celular total del brote ocupada por separado por PECAM-1 (células endoteliales marcadas en rojo) y por células positivas α-SMA (células murales marcadas en verde).
- Genere la imagen combinada utilizando la función de calculadora de imágenes y el operador AND. Mida el área celular total de la imagen. Para calcular la cobertura, divida el área de la imagen colocalizada por el área de la imagen binaria PECAM-1.
- Para analizar la competencia celular por la posición de las células de punta endotelial / tallo de los brotes desarrollados por EB en mosaico, puntúe manualmente el número de células de punta y marque su origen genotípico en función de la señal de fluorescencia. Calcular los valores medios por EB.
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Representative Results
La descripción general del protocolo del ensayo de germinación de vasos sanguíneos se muestra en la Figura 1. Los EB de nueve días de edad derivados de tres líneas independientes 129/Ola mESC (Z/Red, R1 y E14) se disociaron enzimáticamente en células individuales utilizando colagenasa A. Las células se tiñeron para PECAM-1 y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) como se describe. Todas las líneas celulares exhibieron una diferenciación endotelial robusta, y no se observaron diferencias en su capacidad para diferenciarse en células endoteliales. Todas las líneas celulares produjeron alrededor del 10,5% ± el 1,3% de las células endoteliales (Figura 2A). También se cuantificaron los niveles relativos de expresión de los marcadores celulares pan-endoteliales en las poblaciones celulares PECAM-1 (+). Los niveles de expresión de ARNm de todos los marcadores analizados (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 y Cdh5) fueron comparables entre las líneas celulares y los experimentos, confirmando la robustez del protocolo de diferenciación (Figura 2B). Las poblaciones de células PECAM-1 (+) solo expresaron niveles muy bajos de ARNm de marcadores arteriales (Notch1 y Efnb2) o venosos (Couptf2 y Ephb4) que respaldan el estado relativamente inmaduro de las células endoteliales que fueron generadas por el protocolo (Figura 2C).
A continuación, se demostró la capacidad del modelo de EB de germinación vascular para detectar fármacos que modulan la angiogénesis (Figura 3). Se probaron DC101 y DAPT (N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-Lalanyl]-S-phenylglycine t-butylester). Estos compuestos se utilizan ampliamente en ratones para bloquear respectivamente la angiogénesis mediante la inhibición de la actividad de VEGFR2 o para promover la diferenciación de las células de la punta endotelial y la formación de un plexo vascular denso mediante la señalización de Notch (Figura 3A). Tanto las vías de señalización VEGF como Notch son reguladores clave de la angiogénesis germinada in vivo. Se evaluaron los efectos de diversas concentraciones de DC101 y DAPT en EBs chapadas en colágeno I. Altas dosis de DC101 que van desde 6-30 mg· L-1 inhibió tanto el número como la longitud de los brotes del vaso, mientras que DAPT tuvo efectos opuestos a la dosis de 1 μmol· L-1 (Figura 3B-C). También se proporcionan imágenes de gran aumento de los brotes de los vasos teñidos para PECAM-1 de EB cultivados en presencia de DAPT (Figura 3D). DAPT incluso a dosis bajas que oscilan entre 0,5-1 μmol· L-1 aumentó fuertemente el número de células de la punta endotelial con brotes de vasos que tenían un fenotipo de desorientación (Figura 3D-F). Una dosis alta de DAPT también condujo a la coalescencia de los vasos y a la formación de áreas de células endoteliales grandes y planas sin organización (Figura 3A). Los resultados confirmaron la capacidad del modelo para probar fármacos que promueven o inhiben la angiogénesis.
Para confirmar que este modelo es adecuado para imitar enfermedades vasculares, se proporcionan las imágenes confocales de EB derivadas de Acvrl1+/- mESCs. El gen Acvrl1 codifica para ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), un receptor específicamente expresado en células endoteliales que si muta es responsable del desarrollo de una enfermedad vascular rara con angiodisplasia denominada Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT). Una imagen de gran aumento de los brotes endoteliales Acvrl1+/- reveló que tenían más células de la punta endotelial y más ramas por brote que estaban en ángulos aleatorios en relación con los vasos parentales. Estos confirmaron in vitro un fenotipo de desorientación como el observado en ratones HHT (Figura 4).
Al formar EBs quiméricos que contienen mESC diferenciadas marcadas con fluorescencia y mESC de un genotipo particular, se incluye un protocolo alternativo para estudiar el proceso de selección de la punta endotelial (Figura 5A-C). Una imagen confocal de brotes de vasos marcados con PECAM-1 identificó el origen genotípico de las principales células de la punta endotelial (Figura 5B). Las mezclas de una línea mESC YFP (proteína fluorescente amarilla) de tipo salvaje en una proporción de 1:1 con una línea mESC de tipo salvaje no marcada condujeron consistentemente a la contribución igual de cada población a las principales células de la punta endotelial (Figura 5C).
Este protocolo también es adecuado para cuantificar la cobertura de células murales del brote del vaso. Las EB que se sometieron a angiogénesis se fijaron y se tiñeron para PECAM-1 (células endoteliales, rojas) y para α-Actina del músculo liso (α-SMA) (células murales, verde) (Figura 5D). Una imagen de gran aumento reveló cómo un brote de vaso individual estaba rodeado por celdas murales (Figura 5E, izquierda). La transformación binaria se realizó después de la separación del canal de color (Figura F-G) para cuantificar la relación del vaso PECAM-1 (+) cubierto por células murales α-SMA (+) utilizando el software ImageJ (Figura 5H).
Figura 1: Cronología de los procedimientos de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de CE derivadas de la diferenciación vascular mESC dentro de EBs. (A) Análisis citométrico de flujo de la expresión de CD31 de EB de 9 días de edad y cuantificación del porcentaje de células Pecam-1 (+). (B-D) niveles de expresión de ARNm de Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 y EphB4 en células endoteliales clasificadas de EB de 9 días de edad. Las barras de error representan la media ± el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de angiogénesis de brotes 3D para pruebas de drogas. (A) Imágenes confocales de tres EBs representativas teñidas para Pecam-1 (células endoteliales blancas) tratadas con vehículo solo, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) o DC101 (3 mg· L-1, 6 mg· L-1, 30 mg· L-1). B) Cuantificación del número de brotes por EB. (C) Cuantificación de la longitud del brote. (D) En el panel superior izquierdo, gran aumento del brote endotelial que muestra la complejidad de la red y el punto de bifurcación contando con dos capas diferentes del mismo EB, en el panel inferior izquierdo una ilustración esquemática que representa el método de medición de la orientación del brote endotelial. En el panel superior derecho, gran aumento de los brotes endoteliales solo del vehículo y en el panel inferior derecho, gran aumento de los brotes endoteliales de DAPT (0,5 μmol· L-1) condición. (E) Cuantificación del número de células de punta por brote. (F) Cuantificación del porcentaje de filopodios dentro del ángulo >50°. Todas las barras representan la media ± los valores SEM y p de la prueba ANOVA unidireccional no pareada. ns = no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Brote de vasos defectuosos en las EE de telangiectasia hemorrágica hereditaria. En el panel superior, imágenes confocales de EBs representativas de 12 días de edad de los genotipos Acvrl1+/+ y Acvrl1+/- teñidas para Pecam-1 (células endoteliales blancas). En el panel inferior, gran aumento de brotes endoteliales Acvrl1+/- (cuadro blanco del panel superior) que muestra numerosas células de punta (flechas rojas), puntos de ramificación endotelial (puntos azules) y fenotipo de desorientación germinal (flechas verdes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estudio de la posición de la célula de punta/tallo y la maduración del vaso utilizando el ensayo de germinación 3D. (A) Imagen confocal de una EB quimérica representativa de 12 días de edad hecha de línea celular de tipo salvaje R1 mezclada 1: 1 con línea celular de tipo salvaje 7ACS / EYFP teñida para Pecam-1 (células endoteliales rojas). Las flechas rojas indican las celdas de punta de la línea celular R1 y las flechas verdes indican las celdas de punta de la línea celular 7ACS/EYFP. (B) Alto aumento de un brote endotelial que muestra la distribución de la célula endotelial R1 y 7ACS/EYFP a lo largo del brote. (C) Cuantificación de las células de punta de genotipado relativas de EB representativas de tipo salvaje. (D) Imagen confocal de una EB representativa de 12 días de edad teñida para Pecam-1 (células endoteliales rojas) y α-SMA (células murales verdes). (E) Gran aumento de un brote endotelial (cuadro punteado rectangular blanco de D) que muestra la interacción mural/célula endotelial. (F-G) Imágenes del brote endotelial coloreado y sus imágenes binarias transformadas asociadas. (H) Imagen binaria de tinción colocalizada de Pecam-1 y α-SMA. Proporción de brotes de células endoteliales cubiertas por células murales. Todas las barras representan la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un ensayo de germinación vascular basado en EB 3D imparcial, robusto y reproducible que es susceptible de detección de fármacos y genes que modulan la angiogénesis. Este método ofrece ventajas sobre muchos ensayos bidimensionales (2D) ampliamente utilizados que utilizan cultivos de células endoteliales como las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) para monitorear la migración (ensayo de rasguño lateral o el ensayo de cámara de Boyden)22,23 o proliferación (recuento de número de células, detección de síntesis de ADN, detección de marcadores de proliferación o ensayos metabólicos)24 ya que permite de manera única el estudio de la diferenciación celular endotelial y mural y su organización en una red vascular que imita los pasos clave de la angiogénesis germinada. Estos pasos incluyen la selección de células de la punta endotelial, la proliferación de las células del tallo, la orientación espacial y la migración del brote del vaso, y el reclutamiento de células murales para el vaso sanguíneonaciente 25. También ofrece ventajas a muchos modelos de angiogénesis 3D. La perla de fibrina26,27 o el ensayo de gel de colágeno28,29,30 que imitan la tubulogénesis comúnmente usan HUVECs o células endoteliales formadoras de colonias endoteliales derivadas de células (ECFC-EC) ya que tienen una alta tasa proliferativa pero no son adecuadas para células endoteliales primarias de ratón que son difíciles de mantener en cultivo. El explante de retina ex vivo 31 o el ensayo de microórganos vascularizados32 pueden recapitular bien todos los pasos de formación de vasos sanguíneos, pero tienen procedimientos experimentales complejos y no son adecuados para fármacos de alto rendimiento o cribado genético. Esto también es cierto para el ensayo de anillo aórtico ex vivo 33,34 y para muchos ensayos in vivo como el tumor implantado en ratones o los estudios de pérdida de función en ratones que a menudo tienen un alto costo y dificultades para obtener gran cantidad de datos 35. Este protocolo también complementa muy bien ensayos similares de angiogénesis in vitro utilizando iPSCs humanas que permiten comparaciones entre datos de ratones y humanos. Aunque es importante señalar que las células endoteliales humanas derivadas de iPSC muestran menos capacidad de brotar que las células de ratón36,37.
El método desarrollado aquí también tiene algunas limitaciones. No puede evaluar los efectos del flujo de líquido en la maduración de los vasos sanguíneos, la permeabilidad de los vasos y no produce vasos sanguíneos nacientes en un entorno tisular específico en comparación con los dispositivos microfabricados recientes que están en desarrollo. De hecho, las tecnologías de órgano en chip que combinan microfluídica con ingeniería tisular pueden proporcionar a las células endoteliales cultivadas un microambiente similar al in vivo38,39. Los sistemas microfluídicos contienen la composición correcta de la matriz extracelular y están diseñados para producir señales mecánicas como el esfuerzo cortante. Algunos están diseñados para incorporar células murales y otras células de soporte de un tejido dado o pueden generar gradientes químicos. Contienen redes de canales llenos de líquido a escala micrométrica que son similares en tamaño y estructura a los capilares sanguíneos. Las tecnologías de órgano en chip también permiten la cuantificación de funciones vasculares específicas, incluida la permeabilidad y la resistencia eléctrica transendotelial. Aunque las tecnologías de órgano en chip son prometedoras, están mucho más allá de la experiencia en investigación de la mayoría de los laboratorios de biología, aún necesitan una estandarización adecuada y requieren técnicas de fabricación especializadas. La comercialización de la fabricación de tecnología de órgano en chip apenas está comenzando, y estos sistemas se consideran prohibitivos en cuanto a costo y tiempo para las compañías farmacéuticas en la actualidad40,41.
Hay varios pasos críticos que deben tenerse en cuenta. Utilice células de alta calidad que expresen robustamente marcadores bien aceptados (Nanog, Oct4, Sox2 y SSEA-1) del estado pluripotente. Es esencial controlar cuidadosamente su crecimiento, la forma de las células mES y el tamaño y la morfología de las colonias mES. Como la estabilidad cariotípica es estocástica en células cultivadas, es esencial reevaluarla después de un paso extenso. Se recomienda utilizar productos ya probados para el cultivo de mESC y probar comederos MEF, suero fetal de ternera y todos los compuestos químicos durante varios pasajes para detectar si los mESCs mantienen sus propiedades celulares o si se diferencian o adquieren un fenotipo epiblástico. El medio debe actualizarse diariamente y no se debe permitir que las colonias mESC se vuelvan demasiado grandes y densas. Finalmente, las mESCs deben cultivarse al menos durante dos pasajes sin 2i antes de la diferenciación para garantizar el mejor rendimiento de las células endoteliales.
La diferenciación endotelial incluye dos pasos importantes: la formación de EBs utilizando el método de gota colgante y su cultivo en condiciones flotantes en presencia del medio de diferenciación vascular13,14. El movimiento de los platos colgantes debe minimizarse para lograr una agregación celular uniforme. El número de mESCs utilizadas para formar un agregado en la mayoría de los casos, oscila entre 800-1.000 células, pero puede ser necesario optimizarlo si las mESCs tienen un trasfondo genético diferente al 129/ola para asegurar una diferenciación óptima en EBs vascularizadas. Cuando se cultivan en condiciones flotantes, las EB deben distribuirse cuidadosamente y evitar movimientos que favorezcan la aglutinación de EB.
Los EB finalmente se cultivan en gel de colágeno I para formar brotes de vasos. El medio angiogénico debe estar recién preparado y una vez mezclado con colágeno I debe mantenerse en hielo para evitar la gelificación espontánea. En caso de pruebas de drogas, las drogas se agregan en la mezcla fría a la concentración correcta durante este paso. Ajustar el pH con NaOH antes de resuspender los EB es crucial, de lo contrario la acidez del colágeno causará toxicidad celular. Por último, las EB deben distribuirse a una distancia equitativa entre sí para garantizar resultados reproducibles.
En conclusión, este método introduce un ensayo de germinación vascular 3D basado en mESC que tiene la robustez y escalabilidad requeridas para ser utilizado para el cribado genético como lo describió recientemente Elling U. et al. que generó un gran haplobanco de mutantes hemi/homocigotos mESC16 y para el programa de descubrimiento de fármacos fenotípicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, y por la Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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