Summary
Detta manuskript beskriver intravesical administration av uropathogenic bakterier med en lux operon att inducera en urinvägsinfektion hos möss och efterföljande longitudinella in vivo analys av bakteriell belastning med hjälp av bioluminescens imaging.
Abstract
Urinvägsinfektioner (UTI) rankas bland de vanligaste bakteriella infektionerna hos människor och behandlas rutinmässigt med empiriska antibiotika. På grund av ökad mikrobiell resistens har dock effekten av de mest använda antibiotika minskat. För att hitta alternativa behandlingsalternativ finns det ett stort behov av en bättre förståelse för UTI-patogenesen och de mekanismer som bestämmer UTI-mottaglighet. För att undersöka detta i en djurmodell är en reproducerbar, icke-invasiv analys för att studera UTI:s förlopp oumbärlig.
I åratal har guldstandarden för uppräkning av bakteriebelastning varit bestämning av kolonibildande enheter (CFU) för en viss provvolym. Denna teknik kräver post-mortem organ homogenater och seriella utspädningar, begränsa datautmatning och reproducerbarhet. Som ett alternativ blir bioluminescensavbildning (BLI) populär för att bestämma bakteriebelastningen. Märkning av patogener med lux operon möjliggör känslig detektion och kvantifiering på ett icke-invasivt sätt, vilket möjliggör longitudinell uppföljning. Hittills är antagandet av BLI i UTI-forskning fortfarande begränsat.
Detta manuskript beskriver den praktiska implementeringen av BLI i en mus urinvägsinfektion modell. Här finns en steg-för-steg-guide för odling av bakterier, intravesisk instillation och avbildning. In vivo-korrelationen med CFU undersöks och ett proof-of-concept tillhandahålls genom att jämföra bakteriebelastningen hos obehandlade infekterade djur med antibiotikabehandlade djur. Dessutom diskuteras de fördelar, begränsningar och överväganden som är specifika för genomförandet av BLI i en in vivo UTI-modell. Genomförandet av BLI inom UTI-forskningsområdet kommer i hög grad att underlätta forskning om patogenesen vid UTI och upptäckten av nya sätt att förebygga och behandla UTI.
Introduction
Urinvägsinfektioner (UTI) är bland de vanligaste bakteriella infektionerna hos människor. Nästan hälften av alla kvinnor kommer att uppleva en symptomatisk UTI under sin livstid1. Infektioner som är begränsade till urinblåsan kan ge upphov till urinvägssymtom såsom ökning av urinfrekvens, brådskande, hematuri, inkontinens och smärta. När infektionen stiger upp till övre urinvägarna utvecklar patienter pyelonefrit, med sjukdom, feber, frossa och ryggsmärta. Dessutom lider upp till 20% av patienterna med UTI av återkommande infektioner som resulterar i en dramatisk minskning avantibiotikakänsligheten 2,3,4. Under de senaste åren har det funnits ett växande intresse för nya terapier för behandling och förebyggande av återkommande UTI. Trots en bättre förståelse för den medfödda och adaptiva immuniteten hos nedre urinvägarna och av de bakteriella virulensfaktorer som är nödvändiga för invasion och kolonisering, har inga radikala förändringar i behandlingssystemet översatts till den dagliga urologiska praktiken2. För att studera UTI-patogenes och mottaglighet in vivoär en reproducerbar och icke-invasiv analys oumbärlig.
Flera djur UTI-modeller har beskrivits allt från nematoder till primater, men murinmodellen används främst5,6. Denna modell består av transuretral kateterisering av (kvinnliga) möss och efterföljande instillation av en bakteriell suspension, oftast uropathogen escherichia coli (UPEC), direkt i urinblåsan lumen7. Efter inokulering har bakteriebelastningen traditionellt kvantifierats genom att bestämma kolonibildande enheter (CFU). Denna teknik kräver att man offrar djur för att erhålla homogenater och seriella utspädningar efter döden, vilket begränsar datautmatningen och reproducerbarheten. Dessutom är longitudinell uppföljning av bakteriebelastningen hos enskilda djur inte möjlig med denna teknik.
År 1995 föreslog Contag et al. användningen av bioluminescerande taggade patogener för att övervaka sjukdomsprocesser hos levande djur8,9. Sedan dess har bioluminescensavbildning (BLI) tillämpats på många infektionsmodeller som hjärnhinneinflammation, endokardit, osteomyelit, hud- och mjukvävnadsinfektioner etc.10,11,12. I murine UTI-modellen kan en UPEC-stam med komplett lux operon (luxCDABE) från Photorhabdus luminescens användas13. En enzymatisk reaktion katalyseras av bakteriell luciferas som är beroende av oxidation av långkedjiga aldehyder som reagerar med reducerad flavinmonukleotid i närvaro av syre, vilket ger den oxiderade flavinen, en långkedjig fettsyra och ljus12. Lux operon kodar för luciferas och andra enzymer som krävs för syntesen av substraten. Därför kommer alla metaboliskt aktiva bakterier kontinuerligt att avge blått grönt (490 nm) ljus utan att behöva injicera ett exogent substrat12. Fotoner som avges av lux-märktabakterier kan fångas med hjälp av mycket känsliga, kylda laddningskopplade enhetskameror (CCD).
Användningen av bioluminescerande bakterier i en modell för UTI möjliggör longitudinell, icke-invasiv kvantifiering av bakteriebelastningen, vilket utelämnar behovet av att offra djur vid fasta tidpunkter under uppföljningen för CFU-bestämning. Trots det stora utbudet av möjligheter, som samlar bevis för robustheten hos denna BLI-teknik inom andra områden och dess fördelar jämfört med klassiska modeller av UTI, har den inte genomförts i stor utsträckning i UTI-forskningen. Protokollet som presenteras här ger en detaljerad steg-för-steg-guide och belyser fördelarna med BLI för all framtida UTI-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Europeiska unionens råds råds riktlinjer och godkändes av KU Leuvens djuriska kommitté (P158/2018).
1. Odlingsbakterier (anpassade från7,13,14)
- Förberedelse
- Välj en självlysande UPEC-stam som bäst passar de experimentella behoven.
OBS: Här valdes den kliniska cystitisolatet, UTI89 (E. coli), på grund av dess uropatogena kapacitet hos både människor och gnagare, och dess vanliga användning i murin UTI-modeller5,7,15. Den bioluminescerande isogena stammen som bär hela lux operon(luxCDABE)kallas vidare UTI89-lux. Denna operon bär också kanamycinsulfat (Km) resistensgener. Därför kan Km användas för att välja bioluminescerande kolonier13. - Gör en korrelationskurva för CFU och optisk densitet vid 600 nanometer (OD 600 nm) för den valda bakteriestammen7.
- För att göra detta, odla bakterier (med hjälp av protokollet nedan) och göra 8 olika utspädningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mät OD vid 600 nm för alla dessa utspädningar och plätera dem på Luria-Bertani (LB) plattor för att bestämma CFU.
- Rita od 600 nm-värdena och CFU-värdena för att bestämma korrelationen och för att erhålla en standardkurva.
OBS: För framtida experiment, mät OD vid 600 nm och använd denna standardkurva för att få en omedelbar uppskattning av CFU i en bakterielösning.
VARNING: UPEC är patogena bakterier, se till att rummen är ordentligt utrustade och använd personlig skyddsutrustning.
- Välj en självlysande UPEC-stam som bäst passar de experimentella behoven.
- Tre dagar före instillationen
- Få enstaka kolonier genom att strimla ut glycerolbeståndet av bakterier, med hjälp av en inokuleringsslinga, på LB-plattor kompletterade med 50 μg/ml km och odla över natten vid 37 °C. Försegla dessa plattor med en paraffinfilm för att lagra vid 4 °C upp till 1 vecka.
- Två dagar före instillationen
- Fyll ett sterilt 14 ml polystyren runt bottenrör med dubbla snäpplock med 5 ml LB-buljong kompletterat med 50 μg/ml Km. Virvel i 10 s för att säkerställa korrekt blandning.
- Kultur statiskt med snäpplocket i öppet läge vid 37 °C över natten.
OBS: Statisk tillväxt av E. coli främjar uttrycket av typ 1-pili, som är avgörande för vidhäftning till och invasion av uriniska epitelceller. - Förbered en steril Erlenmeyer eller odlingskolv.
- En dag före instillationen
- Efter inkubationen virvlar du röret i 10 s för att säkerställa korrekt homogenisering av bakteriekulturen. Gör en subkultur i Erlenmeyer genom att tillsätta 25 μL av bakteriesuspensionen till 25 ml färsk LB-medium utan antibiotika.
- Stäng Erlenmeyer och kultur statiskt vid 37 °C över natten.
- På instillationsdagen
- Virvel Erlenmeyer i 10 s för att säkerställa korrekt blandning.
- Häll kulturen från Erlenmeyer i ett 50 ml odlingsrör och centrifug vid 3 000 x g och 4 °C i 5 minuter. Dekantera supernatanten och återanvänd bakteriepelleten i 10 ml steril PBS och virvel igen i 10 s.
- Välj den experimentella koncentrationen av inokulat (CFU) och använd standardkurvan som erhålls i steg 1.1.2 för att bestämma motsvarande OD 600 nm.
- Tillsätt 1 ml av den återanvända bakteriekulturen i 9 ml steril PBS och kontrollera OD vid 600 nm. Justera ytterligare genom att tillsätta antingen steril PBS eller koncentrerad bakterielösning tills önskad OD 600 nm harnåtts 7.
OBS: För UTI89-lux justera till exempel kulturen genom att tillsätta PBS tills OD 600 nm når 0,45, vilket motsvarar 2 x 107 CFU/50 μL. För att kontrollera antalet livskraftiga CFUs, gör 10-faldiga seriella utspädningar och platta 50 μL av den femte och sjätte 10-faldiga utspädningen på LB-plattor i tre exemplar för att erhålla mindre än 300 kolonier. Räkna de erhållna kolonierna nästa dag efter inkubation över natten vid 37 °C. OD 600 nm ger en omedelbar avläsning men använd CFU som kvalitetskontroll.
2. Inokulering av djuren (anpassad från7,16)
- Beredning av djuren
- Välj önskad musstam(er) beroende på forskningsfrågan och tillgängligheten av knockoutlinjer, experimentella detaljer och skillnader i UTI-känslighet5,17. Tänk på att transuretral kateterisering är lättare hos honmöss. Använd inte djur yngre än 8 veckor, eftersom de är immunologiskt omogna. Här användes 12 veckor gamla kvinnliga C57Bl/6J möss.
- Beställ djur i god tid och låt dem acklimatisera sig, helst i 7 dagar. Grupphusdjur i individuellt ventilerade burar, under standard 12 h ljusa /mörka förhållanden.
- Raka djurens bukregion för att begränsa signalförlusten. Använd inte hårborttagningskräm, eftersom det kan bränna djurens hud snabbt. Håll fast djuret genom att tätt hålla scruff och bakbenen med den icke-dominerande handen medan du rakar med den dominerande handen. Alternativt, raka under isofluranbedövning.
OBS: Djur rakades 2 dagar före avbildning, med tanke på att djuren kommer att grooma det rakade området ännu mer. - Ge vatten och standardmat ad libitum under hela experimentet. Beröva dock djur från vatten 2 h före instillation för att minimera blåsvolymen under instillationen.
- Montera en steril 24 G angiokateterspets på en 100 μL spruta och fyll sprutan med bakterielösningen beredd i steg 1.5.3.
OBS: För att bestämma bakgrundsluminescensen, skaffa en baslinjebild före instillationen (se steg 3 nedan).
- Instillation av djuren
- Placera djuren i en induktionskammare och bedöva dem med inandning av isofluran med rent syre som bärgas (induktion vid 3% och underhåll vid 1,5%).
- Placera ett djur på en arbetsyta i supinläge och håll en stabil isofluranbedövning med en noskon under instillationen. Applicera ögonsalvan.
- Utvisa rest urinen genom att applicera mild komprimering och göra cirkulära rörelser på den suprapubiska regionen. Rengör underlivet med 70% etanol före instillation.
- Smörj kateterspetsen med normal saltlösning. Sätt pekfingret på den icke-dominerande handen på buken och tryck den försiktigt uppåt. Starta kateteriseringen av urinröret i 90° vinkel (vertikalt) och när motstånd påträffas, luta det horisontellt innan du sätter in det ytterligare (0,5 cm).
OBS: Tryck aldrig med kraft katetern, eftersom detta kommer att skada urinröret. Mjuka vridrörelser kan vara till hjälp vid kateterinsättning. Å andra sidan indikerar brist på motstånd vanligtvis felaktig insättning i slidan. - Utför en långsam (5 μL/s) instillation av 50 μL av bakteriell inokulat (2 x 107 CFU).
OBS: Högre volymer eller snabbare instillation kan orsaka reflux till njurarna. Under övningen av tekniken kan blått bläck användas för att utvärdera reflux. - Efter instillationen håller du sprutan och katetern på plats i ytterligare några sekunder och drar sedan långsamt tillbaka för att förhindra läckage. Registrera eventuella oegentligheter som en stor mängd läckage eller en blodig meatus och uteslut vid behov djur.
- Placera djuret i överläge vid bildkammarens noskon och upprepa de föregående stegen 2.1.1-2.1.6 för alla återstående djur. Använd en kateter per experimentell grupp. Se till att anestesin fortsätter och minimera tiden mellan det första och det sista djuret.
- Vid behov, administrera antibiotika eller experimentella läkemedel före eller efter avbildningen (steg 3). Till exempel, för att administrera enrofloxacin, tillsätt 40 μL av enrofloxacinlösningen (100 mg/ml) till 3,96 ml fysiologisk koksaltlösning för att erhålla en utspädning på 1/100. Injicera 100 μL/10 g subkutant vid 9 och 17 för att administrera 10 mg/kg enrofloxacin två gånger dagligen i 3 dagar.
3. Bioluminescensavbildning
- Förberedelse och val av bildparametrar
- Öppna BLI-anskaffningsprogrammet (se Tabell över material)och klicka på Initiera i bildåtergivningsenheten (se Tabell över material)för att testa kameran och scenstyrenhetssystemet och för att kyla CCD-kameran till -90 °C.
OBS: Under denna process är dörren låst och initieringens förlopp kan följas på kontrollpanelen. En grön lampa indikerar att temperaturen på -90 °C uppnås. En varning visas om avbildning görs innan initieringen är klar. - Kontrollera att data sparas automatiskt: Klicka på hämtning Spara automatiskt till och välj rätt mapp.
- Välj Luminiscens och Fotografi. Kontrollera standardinställningarna för luminiscens: Ställ in excitationsfiltret på Blockera och avgasfilter till Öppna.
- Ställ in exponeringstiden för Auto när du tar den första bilden, särskilt när du förväntar dig en dimsignal för att säkerställa ett tillräckligt antal fotonantal. För in vivo-mätningar och ljusa signaler ställer du in exponeringstiden på ~30 s. Om bilden är mättad visas en varning. Om detta händer, minska exponeringstiden.
- Välj medium Binning, F/stop 1 och välj rätt synfält (FOV) (D för 5 djur).
- Ställ in ämneshöjden på 1 cm vid avbildning av möss.
- Klicka på Lägg till tre gånger på kontrollpanelen för förvärv för att få en sekvens med tre bilder, som tekniska replikat.
- Öppna BLI-anskaffningsprogrammet (se Tabell över material)och klicka på Initiera i bildåtergivningsenheten (se Tabell över material)för att testa kameran och scenstyrenhetssystemet och för att kyla CCD-kameran till -90 °C.
- Imaging
- Placera möss i bildkammaren i supinläge och använd grenrörets noskon för att upprätthålla anestesi (isofluran 1,5%) under hela experimentet. Avbilda upp till 5 möss samtidigt och separera djuren med hjälp av ljusbaffeln för att förhindra reflektion.
- Stäng dörren och klicka på Hämta för att starta bildsekvensen.
- Fyll i detaljerad information om experimentet (vilda typ- och knockoutdjur, behandlingar, bilddag osv.). Bildinställningarna, till exempel exponeringstid, sparas automatiskt.
- Ta bort möss från bildkammaren och returnera dem till deras bur. Kontrollera fullständig återhämtning efter anestesi. Inom några minuter ska djuren vara helt vakna och utforskande. Ge inte analgesi eftersom detta kan störa UTI-kursen18.
- Sätt tillbaka burarna i de ventilerade racken till nästa bildcykel. Efter avslutad operation avliva djuren genom CO2 kvävning eller livmoderhalscancer förskjutning. Gör detta före återhämtning av isofluranbedövning för att minimera ångest.
- Analys av bilderna
- Starta bildprogrammet och läs in den experimentella filen genom att klicka på Bläddra.
- Använd Verktygspaletten för att justera bildens färgskala. Standardisera den visuella aspekten av resultaten genom att använda samma inställningar för alla bilder, dvs. använd en logaritmisk skala med minst 104 till högst 107 fotoner. Dessa justeringar påverkar inte rådata utan endast den grafiska presentationen.
- Använd ROI-verktygen för att rita en region av intresse (ROI) på bilden. Se till att AVKASTNINGEN är tillräckligt stor för att täcka hela området och använd samma dimensioner för alla bilder. Här placerades en kvadratisk ROI på 3,5 cm x 4,5 cm över underlivet.
- Klicka på ROI-mätning för att kvantifiera ljusintensiteten (antal eller totalt fotonflöde). Exportera dessa data och använd medelvärdet av de tekniska replikaten.
Obs: Antalet fotoner som upptäcks av kameran och bör endast användas för bildkvalitetskontrollen. Om du vill rapportera data använder du totalt fotonflöde. Totalt fotonflöde är mer fysiologiskt relevant eftersom det representerar det ljus som avges från ytan och det är en kalibrerad enhet, som korrigeras för exponeringstiden (per sekund).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo BLI korrelerar med CFU av inokulat vid instillation.
För att utvärdera detektionsgränsen för BLI in vivo och korrelationen med CFU av inokulat, infekterades möss med olika koncentrationer av UTI89-lux och PBS som en negativ kontroll. Före instillation skannades oinfekterade djur för att bestämma bakgrunden luminiscens. Efterföljande bilder erhölls omedelbart efter instillationen (figur 1A). Efter instillationen av UTI89-luxvar bioluminescens robust detekterbar över 2 x 104 CFU och en linjär korrelation mellan inokulats cfu och bioluminescensen fastställdes (figur 1B). Däremot var det totala fotonflödet jämförbart med bakgrundssignaler för djur som ingjutits med PBS och vid den lägsta bakteriekoncentrationen på 2 x 103 CFU.
BLI som verktyg för longitudinell uppföljning under behandling
För att avgöra om den botande effekten av en validerad antibiotikabehandling kan påvisas med longitudinell BLI, smittades 20 djur med ett inokulat på 2 x 107 CFU/50 μL, och 10 av dessa djur behandlades med enrofloxacin 10 mg/kg subkutant två gånger dagligen under de första 3 dagarna efter infektionen. Både den naturliga utvecklingen i den infekterade men obehandlade kontrollgruppen och effekten av antibiotikabehandling på infektionskinetiken i den behandlade gruppen kunde visualiseras i detalj (figur 2). En omedelbar minskning av bakteriebelastningen, mätt med totalt fotonflöde, sågs efter den första dosen enrofloxacin. Inget av de behandlade djuren hade en efterföljande ökning av bakteriebelastningen. Variabiliteten mellan ämnena i den infekterade men obehandlade kontrollgruppen var högre och minskningen av bakteriell belastning var långsammare. Dag 10 hade 8 av 10 djur i kontrollgruppen återvänt till en BLI-signal som var jämförbar med deras bakgrund före instillation. Den totala bakteriebelastningen för varje djur beräknades med hjälp av området under kurvan (AUC) av det logtransformerade totala fotonflödet. En signifikant skillnad observerades mellan djur som behandlats med enrofloxacin och obehandlade djur under loppet av 10 dagar. Dessa resultat visar att BLI är ett kraftfullt verktyg för att utvärdera effekten av en potentiell behandling på sjukdomsförloppet för en UTI.
Figur 1: In vivo BLI korrelerar med CFU i inokulat vid instillationen. (A) Representativa bilder erhållna med in vivo BLI av möss infekterade med ökande koncentrationer av inokulat (2 x 103-2 x 108 CFU) avbildade omedelbart efter bakteriell instillation i urinblåsan. CFU = Kolonibildande enheter. b)Kvantifiering av bioluminescens som släpps ut över blåsregionen (totalt fotonflöde) jämfört med koncentrationen av inokulat (CFU). BLI-signalen upptäcktes robust över 2 x 104 CFU (p = 0,0002 jämfört med bakgrund och p = 0,015 jämfört med PBS-kontrollen, opared t-test). Pearson korrelation för inoculi sträcker sig från 2 x 103-2 x 108 CFU var r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = bakgrund, PBS = Fosfatbuffrad saltlösning, CFU = kolonibildande enheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: BLI som ett verktyg för uppföljning längsgående under behandlingen. ( A) Individuella spår av det totala fotonflödet för djur infekterade med 2 x 107 CFU UTI89-lux och behandlade med enrofloxacin 10 mg/kg två gånger dagligen i 3 dagar (blå) jämfört med en obehandlad kontrollgrupp (svart), n = 10 per grupp. BG = bakgrund. b)Analys av spår från djur som visas i panel A och som rapporterar AUC av logtransformerat totalt fotonflöde för både enrofloxacin (blå) och kontrollgruppen (svart). N = 10 per grupp, medelvärde ± SD, oparat t-test p < 0,0001. AUC = Område under kurvan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelar med BLI jämfört med CFU-räkningar
Longitudinella data
En stor nackdel med den traditionella metoden att räkna CFU för att kvantifiera den mikrobiella bördan är kravet på homogenata organ efter slakt, vilket endast ger en tvärsnittsdatapunkt per djur. Omvänt möjliggör BLI icke-invasiv longitudinell uppföljning av infekterade djur. Djuren kan avbildas 2 till 3 gånger om dagen, vilket ger detaljerad inblick i infektionens kinetik. Dessutom minskar upprepade åtgärder av samma djur drastiskt antalet djur som behövs för tillräckligt drivna experiment. Dessutom kan forskare fokusera på den inter-individuella variabiliteten och innan de undersöker eller behandlar djur med ett nytt medel kan de välja djur med prespecificerade bakteriebelastningar med hjälp av realtidsdata. Å andra sidan, med hjälp av AUC av ett experiment gör det möjligt för forskare att fokusera på den totala bakteriebelastningen och inte på ett enda tvärsnittsvärde. Mervärdet av longitudinella data och realtidsdata i UTI-inställningen kan inte överskattas.
Identifiering av smittspridning
Den rumsliga upplösningen av de bilder som erhålls med BLI är tillräcklig för att identifiera andra platser som koloniseras av lux- eller FLuc-märktapatogener19. För UTI är stigande infektioner till njurarna eller spridning till blodet mycket relevanta resultat. I denna experimentella miljö observerades inte någon spridning av infektioner som induceras av UTI89-lux utöver de nedre urinvägarna. Detta förväntades med tanke på att denna stam främst orsakar cystit.
Data reproducerbarhet och jämförelse
Reproducerbarheten av experiment är högre vid användning av BLI jämfört med CFU-räkningar. Klassiskt är tre exemplar av seriella 10-faldiga utspädningar av homogenater pläterade och endast de plattor med 30 till 300 CFU räknas sedan för att beräkna det totala antalet CFU. Denna metod är besvärlig, benägen för hög variabilitet, resulterar i många meningslösa plattor och är extremt benägen för mänskliga fel. Dessutom finns det ingen konsensus om hur man rapporterar CFU, nämligen per gram urinblåsa vävnad, per urinblåsa, eller per 1 ml homogenat. Detta gör jämförelsen av resultaten från olika grupper extremt svår och kan förbättras med hjälp av BLI och totalt fotonflöde.
Överväganden och begränsningar av metoden
Förutom de klassiska övervägandena relaterade till BLI in vivo såsom absorption av fotoner av päls eller hemoglobin, finns det några överväganden att göra när bli och CFU räknas vid offertiden.
För det första uppstår skillnader mellan båda metoderna vid offertiden20, särskilt när antibiotikabehandlingar används. Korrelationen mellan BLI och CFU räknas vid offertillfället kan därför vara suboptimal och är inte nödvändigtvis relevant. För BLI kan det totala fotonflödet vara lägre än förväntat, eftersom utmanade bakterier kan omdirigera sin ämnesomsättning mot återhämtnings- och reparationsprocesser, snarare än ljusemission. Dessutom fångar BLI-mätningen en ögonblicksbild av bakterierna och deras metabolism i realtid in vivo, vilket resulterar i lägre BLI-signaler om bakterier är i vilande eller långsträckt tillstånd vid tidpunkten för avbildningen. Å andra sidan, för CFU-bestämning, reagerar läkemedelsutmanade bakterier på ett allt eller inget sätt efter att ha avlägsnats från deras smittsamma livsmiljö (dvs. en biofilm) och pläteras. När de är pläterade på agar kan de utmanade bakterierna vara oåterkalleligt skadade och oförmögna att utvecklas till observerbara kolonier, vilket resulterar i lägre CFU-räkningar21. Dessutom kan utmanade bakterier gå in i ett livskraftigt men icke-odlingsbart tillstånd (VBNC). De förblir metaboliskt aktiva och livskraftiga men är inte längre odlingsbara på vanliga laboratoriemedier. Bakterier som går in i VBNC-tillståndet eller som är organiserade i biofilmer kan enkelt detekteras med BLI, medan uppräkning av CFU kräver ytterligare bearbetning21,22,23. Sammanfattningsvis mäter bioluminescens och livskraftiga räkningar olika aspekter av cellfysiologin och ingen av dem bör betraktas som den slutgiltiga indikatorn för cellviabilitet21.
Dessutom är definitionen av bakteriebelastning mätt med BLI- eller CFU-antal annorlunda på grund av skillnader i provbehandling. Vid användning av CFU-räkningar ingår endast bakterier som finns i blåsväggen i homogenatet och räknas. Bli fångar däremot också fotoner som avges av bakterier i urinen och urinröret. Enligt vår mening är den senare en fysiologiskt mer korrekt representation av den totala bakteriebelastningen eftersom den innehåller alla anatomiskt relevanta fack (urinblåsa, urin och urinrör).
I motsats till CFU-räkningar kräver BLI generering av genetiskt modifierade luminescerande bakterier. Beroende på insättningsstället är det troligt att införandet av lux operon i genomet kan förändra bakteriestammens virulenspotential. Därför, när man utvecklar en ny bioluminescerande stam, bör dess virulens och tillväxtegenskaper jämföras med föräldrastammen10,13. De senaste framstegen inom genomredigering möjliggör dock effektiv och ärrlös märkning av alla större bakteriella patogener, vilket begränsar effekten på virulens eller behandlingssvar. Dessutom öppnar gentekniken möjligheter till villkorat uttryck av bioluminescensreportergener och därför in vivo-mätning av relevanta bakteriella subpopulationer, genuttrycketc. 24,25.
Slutligen kan tillgång till den avancerade bildåtergivningsenheten och förvärvsprogramvaran för in vivo BLI vara en begränsande faktor jämfört med den grundläggande utrustning som krävs för CFU-uppräkning. Samarbeten med bildkärnor kan dock minimera de kostnader och investeringar som krävs för BLI.
Överväganden som är specifika för genomförandet av BLI i en in vivo UTI-modell
Djurmodell
Fördelarna med en murin UTI-modell är trefaldiga: Det möjliggör övervakning av sjukdomsprogression i ett däggdjurs urinvägar, djuren och deras underhåll är relativt billiga och mutantlinjer finns tillgängliga. Å andra sidan innebär induktion av infektionen vanligtvis transuretral kateterisering och efterföljande instillation av en hög dos bakterier direkt i urinblåsan lumen, vilket kringgår den naturliga uppstigningsprocessen via urinröret5.
Djurhållning
Djur kan grupperas under experimentet. Vi har undersökt förekomsten av överföring mellan djur i samma bur genom att införa indikatordjur i burar med smittade djur. Inget av vaktdjuren hade en påvisbar bakteriebelastning, mätt med både CFU och BLI.
Blåsvolym
När man kombinerar murin UTI-modellen med BLI bör forskare ha blåsans unika anatomiska egenskaper i åtanke. Blåsan är ett ihåligt organ som innehåller en varierande mängd urin. Under UTI kan förekomsten av bakterieinfekterad urin teoretiskt påverka det totala fotonantalet beroende på graden av blåsfyllning. Standardisering av urinblåsans volym är dock opraktisk och kan ingripa med den experimentella designen. Dessutom, enligt vår erfarenhet, skillnader i urinblåsan volym resulterar inte i statistiskt signifikanta skillnader i totala foton flöde.
Provtemperatur
In vitro BLI (eller som ett enklare och billigare alternativ, mäta bioluminescens i en luminometer) kan också användas för att bestämma bakteriell belastning på homogenater, urin eller bakteriella suspensioner som innehåller UTI89-lux. Provets temperatur är dock viktig eftersom utsläppen av fotoner härrör från en enzymatisk reaktion och därmed kräver metabolisk aktivitet och närvaro av syre. Drastiska temperaturförändringar under organskörd bör undvikas genom att provet kan kalibreras på det uppvärmda (37 °C) steg 5 min före avbildning.
Potentiella tillämpningar och betydelse
Sammanfattningsvis begränsade den besvärliga metoden för uppräkning av CFU reproducerbarheten och effektiviteten av forskning inom UTI-området. Den experimentella installationen med BLI kommer att främja in vivo UTI-forskning om urinblåsans fysiologi, UTI-patogenes och mottaglighet genom att möjliggöra longitudinell uppföljning, samtidigt som antalet djur som behövs för dessa typer av studier minskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), KU Leuvens forskningråd (C1-TRPLe; T.V. och W.E.) och VIB (till T.V.). W.E. är en senior klinisk forskare vid Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen). Stammen UTI89-lux var en generös gåva från Prof. Seeds laboratorium13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
