Summary
Her præsenterer vi en protokol til mærkning blodplade lysat-afledte ekstracellulære vesikler til at overvåge deres migration og optagelse i brusk explants bruges som model for slidgigt.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (elbiler) bruges i forskellige undersøgelser for at bevise deres potentiale som en cellefri behandling på grund af deres last afledt af deres cellulære kilde, såsom blodplade lysat (PL). Når det bruges som behandling, forventes elbiler at komme ind i målcellerne og påvirke et svar fra disse. I denne forskning er PL-afledte elbiler blevet undersøgt som en cellefri behandling for slidgigt (OA). Der blev således oprettet en metode til at mærke elbiler og teste deres optagelse på brusk explants. PL-afledte elbiler er mærket med lipophilic farvestof PKH26, vaskes to gange gennem en kolonne, og derefter testet i en in vitro inflammation-drevet OA model for 5 timer efter partikel kvantificering af nanopartikler tracking analyse (NTA). Hver time, brusk explants er faste, paraffineret, skåret i 6 μm sektioner til at montere på dias, og observeret under en konfokal mikroskop. Dette gør det muligt at kontrollere, om elbiler kommer ind i målcellerne (chondrocytter) i denne periode og analyserer deres direkte virkning.
Introduction
Slidgigt (OA) er en leddelt degenerativ sygdom, der indebærer en progressiv og irreversibel betændelse og ødelæggelse af den ekstracellulære matrix af ledbrusk1. Selv om forskellige former for gigt har mange behandlinger2,3,4, disse er begrænset af deres bivirkninger og begrænset effekt. Vævsteknikker ved hjælp af autolog chondrocyt implantation anvendes rutinemæssigt til regenerativ behandling af skadet brusk i begyndelsen af OA brusklæsioner4. Cellebaserede behandlinger er begrænset primært på grund af det begrænsede antal fænotypisk stabile chondrocytter eller chondroprogenitors i stand til effektivt at reparere brusk3. Derfor er udviklingen af nye terapeutiske strategier til forebyggelse af sygdomsprogression og regenerere store brusklæsioner af afgørende betydning.
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er blevet foreslået som en behandling for OA af forskellige forfattere5,6. Elbiler er membranøse organer udskilles af de fleste celletyper, er involveret i intercellulær signalering og har vist sig at udøve stamcellers terapeutiske virkninger7,8,9, som de for nylig har fremkaldt interesse for regenerativ medicin10. Elbiler, der stammer fra mesenkymale stromalceller (MSC'er), er de vigtigste terapeutiske elbiler, der undersøges for OA, selv om andre ledrelaterede celler er blevet anvendt som EV-kilder, f.eks. chondroprogenitors eller immunceller11,12.
Blodpladekoncentrater, såsom blodplade lysater (PLs), bruges til at forbedre sårheling i forskellige skader, såsom hornhindesår13,14,15 eller i senevæv regenerering16, på grund af hypotesen om, at EV komponent af blodplade koncentrater kan være ansvarlig for disse virkninger17 . Nogle undersøgelser vedrørende ledrelaterede sygdomme anvender blodplade-afledte elbiler (PL-elbiler) som en behandling for at forbedre osteoarthritiske tilstande. PL-elbiler forbedrer spredningen af chondrocyt og cellemigration ved at aktivere Wnt/β-cateninvej18, fremme ekspressionen af chondrogenic markører i osteoarthritiske chondrocytter19eller vise højere niveauer af chondrogenice proteiner og færre tissular abnormiteter hos osteoarthritiske kaniner behandlet med PL-EVs18.
Elbiler indeholder proteiner, lipider og nukleinsyrer, der frigøres til målcellen, og etablerer celle-til-celle kommunikation, som er det vigtigste træk relateret til deres terapeutiske anvendelser20. Virkningerne af elbiler afhænger af, om de når celler og efterfølgende lastudslip. Denne effekt kan bekræftes indirekte af ændringer forårsaget i celler, såsom metabolisk aktivitet eller genekspression modifikation. Disse metoder tillader dog ikke visualisering af, hvordan elbiler når celler for at udøve deres funktion. Således, dette papir præsenterer en metode til at mærke disse PL-afledte elbiler, der skal anvendes som en behandling for betændelse-drevet OA brusk explants. Konfokalmikroskopi blev brugt til at overvåge EV-optagelse og progression til de chondrocytter, der var til stede i explanterne i en time-lapse på 5 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Brusk explants blev opnået fra IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer efter etisk godkendelse af projektet af CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Søjleforberedelse
- Ekvilibrere kolonner efter fabrikantens anvisninger eller som følger:
- Fjern kolonnehætten, og ekvilibrere kolonnen. Fjern lagerbufferen ved at elution.
- Kolonnen vaskes 3 gange med 2,5 mL fosfatbufferet saltvand (PBS). Under hver vask skal du vente på, at kolonnen absorberer hele lydstyrken.
BEMÆRK: Lad ikke kolonnen tørre. - Dæk kolonnen med hætten efter den sidste vask og indtil prøveforberedelse.
2. EV mærkning
BEMÆRK: Denne EV-mærkningsprotokol bruger en PL-EV-prøve, der tidligere var isoleret ved størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) med tidligere beskrevne betingelser21,22. Alle EV-prøver fra enhver kilde kan dog anvendes sammen med denne protokol.
- Koncentrer EV-prøven og styringen (PBS) ved hjælp af et koncentrerende rør.
- Prøverne anbringes i et 15 mL- eller 500 μL-koncentreret rør, afhængigt af startmængden af EV-prøven. Centrifuge rørene i henhold til producentens anvisninger, indtil der er opnået en næsten tør prøve.
BEMÆRK: Kontrolprøven er nødvendig for at kontrollere, om der er farvestofbaggrund. Selvom denne metode ikke kræver nogen specifik indledende volumen, bør det overvejes, at omkring 10% af partiklerne vil gå tabt under rensningstrin.
- Prøverne anbringes i et 15 mL- eller 500 μL-koncentreret rør, afhængigt af startmængden af EV-prøven. Centrifuge rørene i henhold til producentens anvisninger, indtil der er opnået en næsten tør prøve.
- De koncentrerede prøver med fortyndingsstoffer C. Resuspend EV-prøver med 200 μL og kontrolgruppen med 100 μL og overfør dem til nye 1,5 mL centrifugrør.
- Ev-prøven adskilles i to aliquots på 100 μL. Marker en med farvestof og brug den som behandling (PKH-PL-EV); lad den anden være umærket, men behandl den (NTA-PL-EV) som EV-prøven og bruge den til at kvantificere EV-koncentrationen ved hjælp af NTA.
- Tilbered 2x farveopløsning, hvilket resulterer i 8 μM PKH26 opløsning i fortyndingsmiddel C.
- Bland 1 μL på 1 mM PKH26 linker pr. 125 μL fortyndings C i prøven. Forbered en diskenhed, der kræves for at føje til prøverne i et 1:1-forhold.
- Der tilsættes 2x farveopløsning til PKH-PL-EV og kontrolprøver i et 1:1-forhold for at opnå 1x farvekoncentration og 4 μM PKH26 koncentration. Tilsæt den samme mængde PBS til NTA-PL-EV-prøven. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5% kvæg serum albumin-PBS opløsning til prøverne i et 1:1-forhold og sørg for, at det endelige volumen er ~ 400 μL.
BEMÆRK: Dette trin gør det muligt at fjerne uspecifikke farveinteraktioner eller ubundet farvestof. - Fortsæt med at adskille de mærkede elbiler fra farvestoffets ubundne farvestof og uspecifikke interaktioner med kolonnen.
3. Mærket EV isolation
- Fjern hætten fra kolonnen, tilsæt 400 μL af prøven (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV eller kontrol), og kassér al udvundet væske.
- Vent på, at eksemplet kommer helt ind i kolonnen, før du går videre til næste trin. Der tilsættes 600 μL PBS, og kassér al eluted væske.
- Vent på, at PBS'en kommer helt ind i kolonnen, før du går videre til næste trin. Der tilsættes 600 μL PBS, og der opsamles en brøkdel af 600 μL i en 1,5. mL centrifugerør (elbiler eller kontrol).
BEMÆRK: Disse trin er nødvendige for at fjerne det overskydende farvestof fra prøverne. En anden adskillelse efter kolonne er nødvendig for at opnå renere elbiler. Følgende trin skal således udføres i en ny ekvilibreret kolonne (trin 4.1.) eller den samme kolonne efter et indledende vasketrin (trin 4.2). - Forbered kolonnen til et nyt EV-adskillelsestrin for at få renere elbiler. Hvis det er en ny kolonne, skal du gentage trin 2.1. og 2.2. Hvis det er den samme kolonne, skal du vaske kolonnen med 2,5 mL på 20% isopropanol og derefter gentage trin 2.1 og 2.2.
- Der tilsættes 600 μL tidligere eluterede elbiler, der blev anskaffet i trin 2.5, til kolonnen, og den eluterede diskenhed kasseres. Vent på, at væsken kommer helt ind i kolonnen, før du går videre til næste trin.
- Der tilsættes 400 μL PBS, og kassér al eluted volumen. Vent på, at væsken kommer helt ind i kolonnen, før du går videre til næste trin.
- Der tilsættes 600 μL PBS, og der opsamles en brøkdel af 600 μL i et 1,5 mL centrifugerør. Brug elbilerne og kontrolprøverne til yderligere analyser, eller opbevar dem natten over ved 4 oC.
- Gem de brugte kolonner til fremtidig brug.
- Vask kolonnen med 25 mL 20% isopropanol og kassér den eluterede volumen. Kolonnen vaskes 3 gange med 2,5 mL PBS.
- Tilføj den lagerbuffer, der blev fjernet i trin 1.1.1, og vent på, at bufferen kommer ind i kolonnen. Dæk kolonnen med hætten og opbevar ved 4 oC indtil senere brug.
4. Ev kvantificering
- Der fremstilles 1:1.000 fortyndinger af NTA-PL-EV-prøven og den første PL-EV-prøve som beskrevet i følgende to trin.
- Der fremstilles 1 mL på 1:10 fortyndet NTA-PL-EV og 1 mL på 1:10 fortyndet indledende PL-EV med PBS filtreret gennem et 0,2 μm filter.
- Der fremstilles 1 mL af en fortynding på 1:100 af de tidligere fortyndede prøver med PBS filtreret gennem et 0,2 μm filter.
- 1:1.000 fortyndet NTA-PL-EV-prøve eller den første PL-EV-prøve med en steril sprøjte i NTA-pumpen. Følg producentens anvisninger og anbefalinger til partikelkoncentration og størrelsesfordelingsbestemmelse.
BEMÆRK: Da EV-koncentrationen afhænger af prøvestartervolumenet, kan det være nødvendigt at aflæse mellemvandinger og foretage justeringer for at opnå en korrekt NTA-bestemmelse.
5. Elbiler, der anvendes som behandling for inflammationsdrevet OA
- Vask brusk to gange med PBS og punktafgifter det ved hjælp af en 3 mm diameter biopsi punch under sterile forhold.
BEMÆRK: Udfør proceduren fra trin 5.1 til 5.6 i en cellekulturhætte. - Anbring explants i 96-brønd kultur plader med DMEM-F12 medium suppleret med 1% penicillin-streptomycin ved 37 oC, 5% CO2, og 80% fugtighed.
- For at etablere en inflammation-drevet OA model, supplere cellekultur medium med 10 ng/mL oncostatin M og 2 ng/mL tumor nekrose faktor-alpha (TNFα).
- Forkæl explants med 1 × 109 partikler/brønd af mærkede elbiler (PKH-PL-EV) eller kontrol i cellekulturmedie suppleret med oncostatin M og TNFα.
BEMÆRK: Prøvens volumen, der indeholder 1 × 109 partikler/brønd, måles, og brug samme volumen til styringen. - Fjern mediet fra de 96-brønd cellekulturplader, der indeholder brusk explants. Der tilsættes 200 μL af det cellekulturmedie, der er beskrevet i trin 5.3, til hver brønd.
BEMÆRK: Hvis 96-brøndspladerne har været i kontakt med fosterkvægsserum (FBS), skal du vaske hver brønd tre gange med 200 μL PBS for at fjerne alle elbiler fra FBS. - Stop in vitro-analysen på forskellige tidspunkter: 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timer.
- Vask cellekulturens brønde, der indeholder brusk explants to gange med 200 μL PBS.
- Der tilsættes 100 μL 4% paraformaldehyd (PFA) til vævet for at fastgøre det i 3 timer ved 4 oC.
BEMÆRK: Trin, der involverer PFA, skal udføres i en røghætte i 1980'ernes anbefalinger. - Fjern PFA, tilsæt 100 μL PBS, fast væv opbevares ved 4 °C, og prøverne behandles inden for 48 timer.
6. Mikroskopi forberedelse og visualisering
BEMÆRK: Denne histologiske procedure består af dehydrering, paraffin indlejring og rehydreringstrin. Disse trin kan reducere den samlede farvestof fluorescens (en begrænsning, der er nævnt i dataarket for PKH26). Derfor kan andre procedurer, såsom frossen sektion, være mere egnet til EV visualisering ved konfokal mikroskopi.
- Integrer det faste væv i paraffinblokke. Skær vævet i 6 μm-tykke sektioner.
- Deparaffinere væv sektioner.
BEMÆRK: Alle trin med xylen skal udføres i en røghætte.- Sænk vævssektionerne i xylen i 30 min, 100% ethanol i 2 min, 96% ethanol i 2 min, 75% ethanol i 1 min, og endelig i destilleret vand i 30 s.
- Permeabilize væv sektioner.
- Forbered en 0,1% Triton-0,1% natriumcitratopløsning for at gennemtrænge vævet. Tilsæt en 20 μL dråbe til hver vævssektion og inkuber i 10 min ved stuetemperatur. Vask hver sektion to gange med 20 μL PBS.
- På en mikroskopisk dias, tilføje en dråbe montering medium, der indeholder 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) med en vandig montering medium til at bevare fluorescens. Rutsjebanen med 3 vævssektioner fra trin 6.3.1.
- Inkuber dias natten over ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Opbevares ved 4 °C, beskyttet mod lys indtil konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der vises en skematisk oversigt over EV-mærkning og optagelsesovervågning i figur 1. Partikelkoncentrationen og EV-størrelsen, der er registreret af NTA i tabel 1, viser, at EV-koncentrationen falder under processen på grund af det rensningstrin, der udføres to gange efter mærkning med kolonnen. Den opnåede mængde er imidlertid i det optimale interval af antallet af partikler, der skal bruges til behandling. Denne partikelkoncentration bruges til at beregne mængden af PKH-PL-EV og kontrol, der bruges til behandling af osteoarthritisk brusk explants.
Når brusk explants behandles med elbiler eller kontrolgruppen, de er fastsat for forskellige perioder: 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timer. Hver gruppe paraffineres, skæres og tilberedes til konfokal mikroskopi med et monteringsmedium, der indeholder DAPI. Repræsentative billeder for hver gruppe på hvert tidspunkt præsenteres i figur 2, der viser, hvordan elbiler kommer ind i vævet, indtil de når chondrocytterne og indtaster dem over tid.
Som det ses i figur 2, er mærkede elbiler allerede lokaliseret omkring chondrocytter (vist med blåt med DAPI farvning) efter 1 h inkubation (vist med rødt med PKH26 farvestof). Nogle baggrund på grund af rest farvestof kan observeres for kontrolgruppen, som ikke har elbiler, men behandles efter samme protokol som EV prøve. Disse resultater bekræfter succesen af protokollen til at mærke elbiler, som kan bruges til at overvåge deres migration gennem væv i in vitro-analyser, som vist her, og i in vivo eksperimenter.
Figur 1: Skematisk oversigt over EV-mærkning og optagelsesovervågningsprotokol. Forkortelser: PBS = fosfat-buffered saltvand; EV = ekstracellulær vesikel; RT = stuetemperatur; BSA = albumin til kvægserum; NTA = analyse af sporing af nanopartikler; OA = slidgigt; TNFα = tumor nekrose faktor-alpha; PL = blodpladelys; PFA = paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af ev optagelse på forskellige tidspunkter. Confocal repræsentative billeder taget efter 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timers osteoarthritic brusk explants inkuberet med PKH-mærket elbiler eller med en kontrolgruppe. Billeder blev taget på 400x. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: OA = slidgigt; PL = blodpladelys; EV = ekstracellulær vesikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Koncentration (partikler/mL) | Partikelstørrelse (nm) | |
| PL-elbiler (oprindeligt) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| NTA-PL-elbiler uden PKH26 (efter protokollen) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
Tabel 1: Karakterisering ved nanopartikler tracking analyse. Forkortelser: OA = slidgigt; PL = blodpladelys; EV = ekstracellulær vesikel; NTA = nanopartikler tracking analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV imaging hjælper med at forstå EV egenskaber, såsom deres frigivelse og optagelse mekanismer. Deres billeddannelse gør det muligt at overvåge deres biodistribution og karakteriseringen af deres farmakokinetiske egenskaber som lægemiddelkøretøjer. Ev-billeddannelse og sporing kan dog være vanskelig på grund af deres små størrelser, selvom mange billedbehandlingsenheder og mærkningsteknikker er blevet udviklet for at hjælpe forskere med at overvåge elbiler under in vitro- og in vivo-forhold 23,24,25.
Der er to muligheder, når du sporer elbiler ved optisk mikroskopi: bioluminescens og fluorescensbilleddannelse. Begge bruges til at detektere elbiler inden for det synlige lysspektrum (390-700 nm). Bioluminescens er en type chemiluminescens, der produceres efter en luciferase katalyserer oxidationen af dets substrat. Selvom dette signal kræver et ultrasensitivt opladningskoblet enhedskamera (CCD) til detektion, har det et højt signal-til-støj-forhold, da signalet ikke kræver en ekstern lyskilde26.
Fluorescensbilleddannelse bruger proteiner eller organiske farvestoffer, der udsender signaler efter excitation fra en ekstern lyskilde. Sammenlignet med bioluminescens er fluorescens lettere at registrere af et CCD-kamera. Desuden bør substrattoksicitet og halveringstid af substratets bioluminescens overvejes til realtids ev tracking27,28i bioluminescens .
I modsætning hertil er fluorescerende protein- og organisk farvestofbaseret mærkning blevet brugt med fremragende opløsning i optisk mikroskopi. Selvom fluorescensintensiteten afhænger af EV-proteinudtryksniveauer, giver effektiviteten af EV-mærkning på membrandomæner og excitationslyskilden, fluorescensfarvestoffer stabile og stærke signaler til EV-billeddannelse25. De fleste organiske fluorescerende farvestoffer blev oprindeligt brugt til cellemembranbilleddannelse. Disse farvestoffer kombinerer generelt fluorophorer, der mærker lipid-bilayeren eller proteiner af interesse på elbiler via forskellige funktionelle grupper29.
En organisk fluorescerende farvestof familie er lipophilic PKH farvestof familie bestående af fluorophores med en lipophilic carbocyanin, der ankre i lipid bilayer for fluorescens imaging30,31. PKH-farvestoffer er blevet anvendt til in vitro- og in vivo-studier, da deres in vivo halveringstid spænder fra 5 til >100 dage. Således kan persistensen af farvestoffet in vivo føre til vildledende resultater i undersøgelser af kortere varighed end farvestoffets halveringstid. Men PKH farvestoffer er nyttige som sporstoffer til at vise EV migration32.
PKH26 er medlem af denne PKH lipophilic fluorophore familie, findes i det røde spektrum med et højdepunkt af excitation på 551 nm og emission på 567 nm. Dette gør det kompatibelt med andre detektionskanaler, såsom rhodamin, phycoerythrin eller DAPI33, hvilket gør det muligt at registrere, i dette tilfælde, migration af elbiler markeret med PKH26 mod chondrocytter markeret med DAPI. Det er vigtigt at bemærke, at selv om PL blev brugt som ev-kilde her, kan denne protokol bruges med elbiler fra andre kilder og til andre formål, for eksempel til at spore mærket in vivo-distribution af elbiler.
Denne protokol har nogle begrænsninger. for eksempel er der nogle bekymringer for, at PKH26 øger EV størrelse, som kan påvirke deres biodistribution og cellulære optagelse. I sådanne tilfælde, hvor EV-størrelsen blev forøget med PKH26, var mærkningsproceduren imidlertid forskellig fra den, der er beskrevet i denne protokol34. Disse forskere omfattede ikke vaske- og rensningstrinene, hvilket førte til højere niveauer af frit farvestof, hvilket kunne forårsage den større EV-størrelse. Desuden overvinder den nuværende protokol dette problem ved at udføre en parallel EV rensning med og uden PKH26. Dette gør det muligt at karakterisere en umærket EV-prøve, som blev behandlet ens som den mærkede. En vildledende kvantificering som følge af forvirrende uspecifikt mærkede partikler (lipoprotein- eller proteinprøveforuren) eller ved tilstedeværelsen af ikke-EV-partikler i mærkningsblandingen kan således undgås, som tidligere påvist35,36.
I dette papir, to cyklusser af rensning blev udført af størrelse udelukkelse kromatografi ved hjælp af kolonner. Den første kan erstattes af saccharose gradient centrifugering. Alle EV-populationer blev imidlertid indsamlet i samme eluted aliquot med denne kolonne og ikke udsat for høje g kræfter, der blev stødt på i højhastighedscentrifugering. Men, undgå centrifugering kan føre til en langsommere proces, især hvis kolonne vasker er nødvendige mellem separation cykler. En anden begrænsning af denne protokol er behovet for prøvekoncentration, før mærkningsprocessen påbegyndes på grund af kolonnens begrænsede volumen. Dette handicap kan overvindes ved hjælp af kolonner med højere lasteevne.
Andre protokoller for ev-mærkning beskriver brugen af forskellige farvestoffer; Deres brug af ultracentrifugeringstrin kan dog skade EV-integriteten37. Protokollen beskrevet her har tilladt overvågning af EV migration og optagelse i brusk explants let med en konfokal mikroskop uden nogen særlig funktion. Desuden kan dette ekstrapoleres til andre væv og lipidiske prøver eller tilstande, såsom en in vivo-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansieret af ESF's Europæiske Socialfond og EFRU's Europæiske Fond for Regionaludvikling (MS16/00124; CP16/00124); af PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansieret af den bæredygtige turismeafgift på De Baleariske Øer; af Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); af FOLIUM's postdoctorale program (FOLIUM 17/01) inden for FUTURMed, finansieret med 50% af den bæredygtige turismeafgift på De Baleariske Øer og med 50% af ESF; og af Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
