Summary
여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
세포 외 소포 (EV)는 혈소판 용해 (PL)와 같은 세포 공급원에서 파생 된 화물로 인해 세포없는 치료로서의 잠재력을 증명하기 위해 다른 연구에서 사용됩니다. 치료로 사용되는 경우, EV는 표적 세포를 입력하고 이들로부터의 반응에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이 연구에서, PL 유래 전기 는 골관절염에 대 한 세포 없는 치료로 공부 되었습니다 (OA). 따라서, 방법은 EV를 라벨과 연골 각질에 대한 그들의 섭취량을 테스트하도록 설정되었다. PL 유래 전기는 리포마이트 염료 PKH26로 표지되고, 컬럼을 통해 두 번 세척한 다음, 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 입자 정량화 후 5h에 대한 체외 염증 중심OA 모델에서 테스트한다. 시간당 연골 이출은 고정되고, 파라플료로 절단되어 6 μm 섹션으로 절단되어 슬라이드에 장착하고, 공초점 현미경으로 관찰됩니다. 이를 통해 이 기간 동안 EV가 대상 셀(연골세포)에 진입하는지 여부를 검증하고 직접적인 효과를 분석할 수 있습니다.
Introduction
골관절염(OA)은 관절 연골1의세포외 매트릭스의 점진적이고 돌이킬 수 없는 염증 및 파괴를 의미하는 관절 퇴행성 질환이다. 관절염의 다양한 형태는 수많은 치료를 가지고 있지만2,3,4,이들은 자신의 부작용과 제한된 효능에 의해 제한됩니다. 자가 연골성 이식을 이용한 조직 공학 기술은 조기 OA 연골 병변4에서부상당한 연골의 재생 치료를 위해 일상적으로 적용된다. 세포 기반 치료법은 주로 연골3을효과적으로 수리할 수 있는 페노전형안정연골세포 또는 연골로겐이터의 수가 제한되어 있기 때문에 제한된다. 따라서 질병 진행을 방지하고 큰 연골 병변을 재생하는 새로운 치료 전략의 개발이 가장 중요합니다.
세포 외 소포 (EV)는 다른저자에의해 OA에 대한 치료로 제안되었습니다5,6. 전기자동차는 대부분의 세포 유형에 의해 분비되는 암골체이며, 세포간 신호에 관여하며, 줄기세포의 치료 효과를 발휘하는 것으로 나타났으며,8,9,최근재생의학에대한 관심을 유도하고 있다. 중간엽 기질 세포(MSC)에서 유래된 전기는 OA를 위해 조사되는 주요 치료 용 전기자동차이지만, 다른 관절 관련 세포는 EV 소스, 예를 들어, 촌드롭로겐이터 또는 면역세포(11,12)로사용되어 왔다.
혈소판 용액(PLs)과 같은 혈소판 농축물들은 각막궤양(13,14,15) 또는 힘줄 조직 재생16과같은 상이한 부상에서 상처 치유를 향상시키는 데 사용되며, 혈소판 농축물의 EV 성분이 이러한 효과에 대한 책임이 있을 수 있다는 가설 로 인해17 . 관절 관련 질환과 관련된 일부 연구는 혈소판 유래 EV (PL-EV)를 관절 관절염 조건에 대한 치료로 사용합니다. PL-Ev는 Wnt/β-카테닌통로(18)를활성화하여 연골세포 증식 및 세포 이동을 개선, 골관절염분골19에서연골성 마커의 발현을 촉진하거나, 더 높은 수준의 연골관절염 단백질을 나타내거나, PL-E18로 치료된 골관절염 토끼의 더 적은 치창 이상을 보여준다.
전기자동차는 표적 세포로 해방되는 단백질, 지질 및 핵산을 함유하고 있으며, 세포 간 통신을 확립하여 치료 적용20과관련된 주요 특징이다. EV의 효과는 도달 셀과 후속 화물 방출에 따라 달라집니다. 이러한 효과는 대사 활동 또는 유전자 발현 수정과 같은 세포에 의한 변화에 의해 간접적으로 확인할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 EV가 세포에 도달하는 방법을 시각화하여 기능을 발휘하도록 허용하지 않습니다. 따라서, 본 논문은 염증 중심의 OA 연골 연골 경질 에 대한 치료제로 사용되는 이러한 PL 유래 전기자동차를 라벨링하는 방법을 제시한다. 공초점 현미경 검사는 5h의 시간 경과에 있는 소멸에 존재하는 연골세포에 EV uptake 및 진행을 감시하기 위하여 이용되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 이디스바 바이오뱅크(IB 1995/12 BIO)로부터 CEI-IB(IB 3656118 PI)의 프로젝트의 윤리적 승인 후 제도적 가이드라인에 따라 연골 이출을 획득했습니다.
1. 열 준비
- 제조업체의 지침에 따라 또는 다음과 같이 열을 평형화합니다.
- 열 캡을 제거하고 열을 상위화합니다. 용출하여 저장소 버퍼를 제거합니다.
- 인산염 완충식식염(PBS)의 2.5mL로 컬럼을 3회 세척한다. 각 세척 하는 동안, 전체 볼륨을 흡수 하는 열에 대 한 기다립니다.
참고: 열을 건조시키지 마십시오. - 마지막 세척 후 와 샘플 준비까지 캡으로 컬럼을 덮습니다.
2. EV 라벨링
참고: 이 EV 라벨링 프로토콜은 이전에 설명된조건(21,22)을가진 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 이전에 격리된 PL-EV 샘플을 사용합니다. 그러나 모든 소스의 모든 EV 샘플은 이 프로토콜과 함께 사용될 수 있습니다.
- 집중 튜브를 사용하여 EV 샘플 및 제어(PBS)를 농축합니다.
- EV 샘플 시작의 시작 부피에 따라 샘플을 15mL 또는 500 μL 집중 튜브에 배치합니다. 거의 건조한 시료를 얻을 때까지 제조업체의 지시에 따라 튜브를 원심 분리합니다.
참고: 제어 샘플은 염료 배경을 확인하는 데 필요합니다. 이 방법은 특정 초기 부피를 필요로하지 않지만, 정제 단계에서 입자의 약 10 %가 손실되는 것으로 간주되어야한다.
- EV 샘플 시작의 시작 부피에 따라 샘플을 15mL 또는 500 μL 집중 튜브에 배치합니다. 거의 건조한 시료를 얻을 때까지 제조업체의 지시에 따라 튜브를 원심 분리합니다.
- 희석 C. 200 μL및 100 μL의 대조군으로 EV 샘플을 다시 중단하고 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
- EV 샘플을 100 μL의 두 개의 알리쿼트로 분리하여 염료로 표시하고 치료(PKH-PL-EV)로 사용하십시오. 다른 표시되지 않은 상태로 두고 EV 샘플과 같이 (NTA-PL-EV)를 처리하고 NTA에 의해 EV 농도를 정량화하는 데 사용합니다.
- 2배 염료 용액을 준비하여 희석 C로 8μM PKH26 용액을 생성합니다.
- 샘플에 희석 C의 125 μL 당 1 mM PKH26 링커의 1 μL을 혼합합니다. 1:1 비율로 샘플에 추가하는 데 필요한 볼륨을 준비합니다.
- PKH-PL-EV에 2x 염료 용액을 추가하고 1:1 비율로 시료를 제어하여 1x 염료 농도와 4 μM PKH26 농도를 달성합니다. NTA-PL-EV 샘플에 동일한 양의 PBS를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 1:1 비율로 시료에 5% 소 세럼 알부민-PBS 용액을 추가하고 최종 부피가 ~400 μL인지 확인합니다.
참고: 이 단계를 사용하면 비특이적 염료 상호 작용 또는 무한염료를 제거할 수 있습니다. - 레이블이 지정된 EV를 언바운드 염료및 열과 염료의 비특이적 상호 작용에서 분리합니다.
3. 라벨이 붙은 EV 격리
- 컬럼에서 캡을 제거하고 시료의 400 μL(PKH-PL-EV, NTA-PL-EV 또는 제어)을 추가하고 모든 용출된 액체를 폐기합니다.
- 다음 단계로 진행하기 전에 샘플이 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS의 600 μL을 추가하고 모든 용출 된 액체를 폐기합니다.
- 다음 단계로 진행하기 전에 PBS가 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS의 600 μL을 추가하고 1.5에 600 μL의 일부를 수집합니다. mL 원심분리기 튜브(EV 또는 제어).
참고: 샘플에서 과도한 염료를 제거하기 위해 이러한 단계가 필요합니다. 더 순수한 전기 EV를 얻으려면 열별 또 다른 분리가 필요합니다. 따라서, 다음 단계는 초기 세척 단계(4.2단계) 후에 새로운 평형 컬럼(step 4.1.) 또는 동일한 컬럼에서 수행되어야 한다. - 새로운 EV 분리 단계에 대한 열을 준비하여 더 순수한 전기를 얻습니다. 새 열인 경우 2.1단계를 반복합니다. 및 2.2. 동일한 열인 경우 2.5mL의 2.5mL로 열을 세척한 다음 2.1 및 2.2 단계를 반복합니다.
- 2.5단계에서 얻은 이전에 용출된 전기 의 600 μL을 열에 넣고 용출된 부피를 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 액체가 열에 완전히 들어갈 때까지 기다립니다.
- PBS 의 400 μL을 추가하고 모든 용출 된 볼륨을 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 액체가 열에 완전히 들어갈 때까지 기다립니다.
- PBS의 600 μL을 추가하고 1.5mL 원심분리기 튜브에 600 μL의 일부를 수집합니다. 추가 분석을 위해 전기 및 제어 샘플을 사용하여 추가 분석을 하거나 4 oC에서 하룻밤 동안 저장합니다.
- 나중에 사용할 수 있는 사용 된 열을 저장합니다.
- 20% 이소프로판올의 25mL로 컬럼을 세척하고 용출된 부피를 폐기하십시오. PBS의 2.5 mL로 컬럼을 3번 세척합니다.
- 1.1.1 단계에서 제거된 저장소 버퍼를 추가하고 버퍼가 열에 들어갈 때까지 기다립니다. 캡으로 열을 덮고 후속 사용까지 4oC에 저장합니다.
4. EV 정량화
- 다음 두 단계에 의해 설명된 바와 같이 NTA-PL-EV 샘플 및 초기 PL-EV 샘플의 1:1,000 희석을 준비한다.
- 0.2 μm 필터를 통해 여과된 PBS를 통해 1:10 희석NTA-PL-EV 와 1:10 희석 초기 PL-EV의 1mL을 준비한다.
- 0.2 μm 필터를 통해 여과된 PBS로 이전 희석 시료의 1:100 희석1mL을 준비한다.
- NTA 펌프에 멸균 주사기를 사용하여 1:1,000 희석NTA-PL-EV 샘플 또는 초기 PL-EV 샘플을 주입한다. 입자 농도 및 크기 분포 결정에 대한 제조업체의 지침 및 권장 사항을 따르십시오.
참고: EV 농도는 샘플 스타터 볼륨에 따라 달라지므로 중간 희석을 읽고 올바른 NTA 판정을 얻기 위해 조정해야 할 수도 있습니다.
5. 염증 중심의 OA에 대한 치료로 사용되는 전기 자동차
- PBS로 연골을 두 번 세척하고 멸균 조건하에서 3mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 소비합니다.
참고: 세포 배양 후드에서 5.1단계에서 5.6단계부터 절차를 수행합니다. - 37 oC, 5 % CO2,80 % 습도에서 1 % 페니실린 - 연쇄 절제술로 보충 DMEM-F12 배지와 96 웰 문화 판에 이식을 배치합니다.
- 염증 중심OA 모델을 확립하려면 세포 배양 배지를 10 ng/mL 온코스타틴 M 및 2 ng/mL 종양 괴사 인자-알파(TNFα)로 보완한다.
- 1× 109 개의 입자 / 라벨이 붙은 전기 자동차 (PKH-PL-EV) 또는 온코사틴 M 및 TNFα로 보충 된 세포 배양 배지에서 제어하여 이물질을 처리합니다.
참고: 1× 109 입자/웰을 포함하는 샘플의 부피를 측정하고 컨트롤에 동일한 부피를 사용합니다. - 연골 이외에도 함유된 96웰 세포 배양 판에서 배지를 제거한다. 각 웰에 5.3 단계에서 설명된 세포 배양 배지의 200 μL을 추가합니다.
참고: 96웰 플레이트가 태아 소 혈청(FBS)과 접촉한 경우, FBS에서 전기를 제거하기 위해 200μL의 PBS로 각각 세 번 씻으세요. - 0, 1, 2, 3, 4 및 5 h : 다른 시간에 시험관 내 분석기를 중지합니다.
- 연골을 함유한 세포 배양 우물을 PBS 200 μL로 두 번 세척합니다.
- 4%의 파라포름알데히드(PFA)의 100μL을 조직에 추가하여 4oC에서 3시간 동안 고정합니다.
참고: PFA와 관련된 단계는 안전 데이터 시트 권장 사항에 따라 연기 후드에서 수행해야 합니다. - PFA를 제거하고, PBS의 100 μL을 추가하고, 고정 조직을 4°C에 저장하고, 48h 이내에 샘플을 처리한다.
6. 현미경 검사기 준비 및 시각화
참고: 이 조직학적 절차는 탈수, 파라핀 포함 및 재수화 단계로 구성됩니다. 이러한 단계는 전반적인 염료 형광을 줄일 수 있습니다(PKH26에 대한 데이터 시트에 언급된 제한). 따라서, 냉동 단면과 같은 다른 절차는 공초점 현미경검사법에 의한 EV 시각화에 더 적합할 수 있다.
- 파라핀 블록에 고정 된 조직을 포함. 조직을 6 μm 두께의 섹션으로 자른다.
- 조직 섹션을 분리합니다.
참고: 자일렌을 사용하는 모든 단계는 연기 후드로 수행해야 합니다.- 자일렌에 30분, 에탄올 100% 2분, 에탄올 96% 2분, 에탄올 75% 1분, 마지막으로 30초 증류수에 침수합니다.
- 조직 섹션을 과미화합니다.
- 조직을 과미화하기 위해 0.1% 트리톤-0.1% 구연산 나트륨 용액을 준비한다. 각 티슈 섹션에 20 μL 드롭을 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. PBS의 20 μL로 각 섹션을 두 번 세척합니다.
- 현미경 슬라이드에, 형광을 보존하기 위한 수성 장착 매체와 함께 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 장착 매체의 한 방울을 추가합니다. 6.3.1 단계에서 3개의 조직 단면을 포함하는 슬라이드를 덮습니다.
- 빛으로부터 보호되는 실온에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
- 4 °C에 저장, 공초점 현미경 검사까지 빛으로부터 보호.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1에EV 라벨링 및 업테이크 모니터링에 대한 회로도 개요가 표시됩니다. 표 1에서 NTA에 의해 검출된 입자 농도 및 EV 크기는 컬럼으로 라벨링한 후 두 번 수행된 정화 단계로 인해 공정 중에 EV 농도가 감소함을 보여준다. 그러나, 얻어진 양은 처리를 위해 사용하는 입자의 수의 최적 범위에 있다. 이러한 입자 농도는 골관절염 연골 경질을 치료하는 데 사용되는 PKH-PL-EV 및 제어의 부피를 계산하는 데 사용됩니다.
연골 이출이 EV 또는 대조군으로 처리되면 0, 1, 2, 3, 4 및 5 h의 다른 기간 동안 고정됩니다. 각 그룹은 DAPI를 포함하는 마운팅 배지를 가진 공초점 현미경 검사법을 위해 파라핀화, 슬라이스 및 준비됩니다. 각 시간 시점에서 각 그룹의 대표적인 이미지는 도 2에제시되며, EV가 연골세포에 도달하여 시간이 지남에 따라 입력할 때까지 조직에 어떻게 들어가는지 보여 주는 것입니다.
도 2에서볼 수 있듯이, 라벨이 부착된 전기는 이미 1h의 인큐베이션(PKH26 염료로 빨간색으로 표시됨) 후 연골세포(DAPI 염색과 함께 파란색으로 표시됨)를 중심으로 지역화되어 있다. 잔재염으로 인한 일부 배경은 EV가 없지만 EV 샘플과 동일한 프로토콜에 따라 처리되는 대조군에 대해 관찰될 수 있다. 이러한 결과는 여기에 표시된 바와 같이, 그리고 생체 내 실험에서 조직을 통해 그들의 이주를 감시하는 데 사용할 수 있는 EV를 라벨프로토콜의 성공을 확인합니다.
그림 1: EV 라벨링 및 업테이크 모니터링 프로토콜에 대한 회로도 개요입니다. 약어: PBS = 인산염 완충식식염; EV = 세포 외 소포; RT = 실온; BSA = 소 세럼 알부민; NTA = 나노 입자 추적 분석; OA = 골관절염; TNFα = 종양 괴사 인자-알파; PL = 혈소판 리자; PFA = 파라포름알데히드; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다른 시간에 EV 섭취량의 대표 이미지. PKH 라벨이 부착된 EV 또는 대조군으로 배양된 골관절염 연골 의 0, 1, 2, 3, 4 및 5 h 후 촬영한 공초점 대표적인 이미지. 이미지는 400x에서 촬영되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: OA = 골관절염; PL = 혈소판 리자; EV = 세포 외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 농도(입자/mL) | 입자 크기(nm) | |
| PL-EV(초기) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| PKH26이 없는 NTA-PL-EV(프로토콜 후) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
표 1: 나노입자 추적 해석에 의한 특성화. 약어: OA = 골관절염; PL = 혈소판 리자; EV = 세포 외 소포; NTA = 나노 입자 추적 분석.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV 이미징은 방출 및 섭취 메커니즘과 같은 EV 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다. 그들의 화상 진찰은 그들의 생체 분배의 감시 및 약동성 속성의 특성을 약 차량으로 허용합니다. 그러나, EV 이미징 및 추적은 그들의 작은 크기 때문에 어려울 수 있습니다, 많은 이미징 장치 및 라벨링 기술은 연구원이 체외및 생체 내 조건에서 전기를 모니터링하는 데 도움이 개발되었지만23,24,25.
광학 현미경 검사법에 의한 전기 를 추적할 때 두 가지 가능성이 존재합니다: 생체 발광 및 형광 화상 진찰. 둘 다 가시광선 스펙트럼(390-700 nm) 내에서 전기를 감지하는 데 사용됩니다. 생물 발광은 루시파아제 후 생성 된 화학 발광의 일종이다 기판의 산화를 촉매. 이 신호는 감지를 위해 초감도 충전 결합 장치(CCD) 카메라가 필요하지만 신호가 외부광원(26)을필요로 하지 않기 때문에 높은 신호 대 잡음 비율이 있다.
형광 화상 진찰은 외부 광원에서 흥분 한 후 신호를 방출하는 단백질 또는 유기 염료를 사용합니다. 생물 발광에 비해, 형광은 CCD 카메라에 의해 검출하기 쉽습니다. 더욱이, 생물발광에서 기판 독성 및 기판의 생체 발광의 반감기는 실시간 EV 추적27,28에대해 고려되어야 한다.
대조적으로, 형광 단백질 및 유기 염료 기지를 둔 라벨링은 광학 현미경 검사법에서 우수한 해상도로 사용되었습니다. 형광 강도는 EV 단백질 발현 수준에 따라 다르지만 멤브레인 도메인에서 EV 라벨링의 효율과 발산 광원, 형광 염료는 EV이미징(25)에안정적이고 강한 신호를 제공한다. 대부분의 유기 형광염염은 처음에 세포막 화상 진찰을 위해 이용되었습니다. 이러한 염료는 일반적으로 다른 기능성그룹(29)을통해 EV에 대한 지질 이중층 또는 관심 있는 단백질을 라벨링하는 형광을 결합한다.
하나의 유기 형광염 은형 이미징을 위한 지질 양성 환원 이중층에 고정하는 지성 카보시아닌을 가진 형광으로 구성된 지동성 PKH 염료가족이다 30,31. PKH 염료는 생체 외및 생체 내 연구에 사용되어 5에서 >100일까지의 생체 내 반감기 범위입니다. 따라서 생체 내에서 염료의 지속성은 염료의 반감기보다 더 짧은 기간의 연구에서 오해의 소지가 있는 결과로 이어질 수 있다. 그러나 PKH 염료는 EV 마이그레이션32를표시하는 트레이서로 유용합니다.
PKH26은 551 nm에서 흥분의 피크와 567 nm에서 방출의 피크와 빨간색 스펙트럼에서 발견 이 PKH 리포필성 형광가족의 일원입니다. 이로 인해 로다민, 피코에리스린 또는 DAPI33과같은 다른 검출 채널과 호환되므로 이 경우 PKH26로 표시된 EV를 DAPI로 표시된 연골세포로 의 검출할 수 있습니다. PL이 여기에서 EV 소스로 사용되었지만 이 프로토콜은 다른 소스의 EV와 함께 사용할 수 있으며, 예를 들어 다른 목적으로 는 EV의 생체 내 분포에 레이블이 지정된 추적을 할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, PKH26 그들의 생체 분포 및 세포 섭취에 영향을 미칠 수 있는 EV 크기를 증가 하는 몇 가지 우려가 있다. 그러나, PKH26에 의해 EV 크기가 증가한 경우, 라벨링 절차는 이프로토콜(34)에설명된 것과 달랐다. 이 연구원은 세척 및 정화 단계를 포함하지 않았기 때문에 더 큰 EV 크기를 일으킬 수있는 더 높은 수준의 무료 염료로 이어졌습니다. 더욱이, 본 프로토콜은 PKH26의 유무에 관계없이 병렬 EV 정제를 수행하여 이 문제를 극복한다. 이렇게 하면 레이블이 지정되지 않은 EV 샘플의 특성화가 레이블이 지정된 샘플과 동일하게 처리됩니다. 따라서, 비특이적 라벨이 붙은 입자(지단백 또는 단백질 샘플 오염물질)를 혼동하거나 라벨링 혼합물 내의 비EV 입자의 존재에 의한 오해의 소지가 있는 정량화를 피할 수 있다, 이전에 입증된 바와 같이35,36.
이 논문에서는 열을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 2주기의 정제를 수행하였다. 첫 번째 는 자당 그라데이션 원심분리에 의해 대체 될 수있다. 그러나 모든 EV 인구는 이 열과 동일한 용출된 알리쿼트로 수집되었으며 고속 원심분리에서 발생하는 높은 g의 힘을 받지 못했습니다. 그러나 원심분리를 피하면 특히 분리 주기 사이에 열 세동이 필요한 경우 프로세스가 느려질 수 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 제한사항은 컬럼의 제한된 부피로 인해 라벨링 프로세스를 시작하기 전에 샘플 농도가 필요하다는 것입니다. 이 핸디캡은 더 높은 로딩 용량을 가진 열을 사용하여 극복 될 수 있습니다.
다른 EV 라벨링 프로토콜은 다른 염료의 사용을 설명합니다. 그러나, 초원심분리 단계의 사용은 EV무결성(37)을손상시킬 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 기능없이 공초점 현미경으로 쉽게 연골 에서 EV 마이그레이션 및 섭취를 모니터링 할 수 있습니다. 더욱이, 이것은 생체 내 분석과 같은 다른 조직 및 립피딕 샘플 또는 조건에 추정될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124); PROGRAMA 주니어 델 프로이토 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (JUNIOR01/18), 발레 아레스 제도의 지속 가능한 관광 세금에 의해 자금; 디레치오 장군 디Investigació, 콘셀러디아 d'Investigació, 지배 발레아 (FPI/2046/2017); FUTURMed 내에서 FOLIUM 박사 후 프로그램 (FOLIUM 17/01)에 의해, 발레 아레스 제도의 지속 가능한 관광 세금에 의해 50 %와 ESF에 의해 50 %로 자금; 그리고 코미시오 데 도센시아 i Investigacio 데 라 Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
