Summary
ここでは、変形性関節症のモデルとして使用される軟骨外植の移動および取り込みをモニタリングするために、血小板リセート由来の細胞外小胞にラベルを付けるプロトコルを提示する。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、血小板リセート(PL)などの細胞源に由来する貨物による無細胞治療としての可能性を証明するために、異なる研究で使用されています。治療として使用すると、EVは標的細胞に入り、これらからの応答に影響を与える見込みです。本研究では、変形性関節症(OA)の無細胞治療としてPL由来のEVが研究されている。したがって、EVにラベルを付け、軟骨の外植木への取り込みをテストする方法を設定しました。PL誘導EVは、親油性色素PKH26で標識され、カラムを通して2回洗浄され、ナノ粒子追跡分析(NTA)による粒子定量後5時間 のインビトロ 炎症駆動OAモデルで試験される。毎時、軟骨の外植は固定され、パラフィングされ、6μmのセクションに切断されてスライドに取り付けられ、共焦点顕微鏡で観察されます。これにより、この期間中にEVが標的細胞(軟骨細胞)に入るかどうかの検証と、その直接的な効果の分析が可能になります。
Introduction
変形性関節症(OA)は、関節軟骨1の細胞外マトリックスの進行性および不可逆的な炎症および破壊を意味する関節変性疾患である。関節炎の様々な形態は、多数の治療法を持っていますが2,3,4,これらは、その副作用と限られた有効性によって制限されています.自家軟骨細胞移植を用いた組織工学技術は、OA初期の軟骨病変における負傷軟骨の再生治療のために日常的に適用される。細胞ベースの治療法は、主に、軟骨3を効果的に修復することができる限られた数の平種安定な軟骨細胞またはチョンドロゲニターのために制限される。したがって、疾患の進行を予防し、大きな軟骨病変を再生するための新しい治療戦略の開発が最も重要である。
細胞外小胞(EV)は、異なる著者5,6によってOAの治療法として提案されている。EVは、細胞型の大部分によって分泌される膜状体であり、細胞間シグナル伝達に関与しており、そして、それらは最近再生医療への関心を引き出した幹細胞の治療効果7、8、9を発揮することが示されている。間葉間質細胞(MSC)に由来するEVは、OAに関して調査された主な治療用EVであり、他の関節関連細胞はEV源として使用されているが、例えば、チョンドロゲニタまたは免疫細胞11、12。
血小板リサート(PLs)などの血小板濃縮物は、角膜潰瘍13、14、15、腱組織再生16などの異なる傷害における創傷治癒を増強するために使用され、血小板濃縮物のEV成分がこれらの効果に関与する可能性があるという仮説のため17 .関節関連疾患に関連するいくつかの研究は、骨関節炎の状態を改善するための治療法として血小板由来のEV(PL-EV)を使用しています。PL-EVは、Wnt/β-カテニン経路18を活性化することによって軟骨細胞増殖および細胞遊行を改善し、変形性関節症軟骨球19における軟骨形成マーカーの発現を促進し、または、軟骨原性タンパク質のより高いレベルを示し、PL-EV18で治療した骨関節症ウサギの骨関節異常を少なく示す。
EVは、標的細胞に遊離されるタンパク質、脂質、および核酸を含み、それらの治療用途20に関連する主な特徴である細胞間通信を確立する。EVの効果は、その到達セルとその後の貨物放出に依存します。この効果は、代謝活性や遺伝子発現修飾などの細胞内で引き起こされる変化によって間接的に確認することができる。ただし、これらのメソッドでは、EV がセルに到達する方法を視覚化して機能を発揮することはできません。このように、本論文は、これらのPL由来EVを、炎症駆動OA軟骨外植の治療薬として用いる方法を提示する。共焦点顕微鏡は、5時間のタイムラプスで、外植に存在する軟骨細胞へのEV取り込みおよび進行を監視するために使用された。
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Protocol
注意:軟骨外植は、CEI-IB(IB 3656118 PI)によるプロジェクトの倫理的承認後、機関ガイドラインに準拠したIdISBaバイオバンク(IB 1995/12 BIO)から取得されました。
1. カラムの準備
- 製造元の指示に従って、または次のように列を平衡化します。
- 列のキャップを取り外し、列を平衡にします。溶出によってストレージバッファを取り外します。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)の2.5mLでカラムを3回洗浄します。各洗浄中に、カラムが全容を吸収するのを待ちます。
メモ:カラムを乾かしてはなりません。 - 最後の洗浄後、サンプル調製まで、キャップでカラムを覆います。
2. EVラベリング
注: この EV ラベリング プロトコルは、以前に説明した条件21,22のサイズ除外クロマトグラフィー (SEC) によって分離された PL-EV サンプルを使用します。ただし、任意のソースからの EV サンプルは、このプロトコルで使用できます。
- 濃縮チューブを使用してEVサンプルとコントロール(PBS)を濃縮します。
- EVサンプル開始の開始量に応じて、サンプルを15mLまたは500 μLの濃縮チューブに入れます。ほとんど乾燥したサンプルが得られるまで、製造業者の指示に従ってチューブを遠心分離します。
メモ:制御サンプルは、色素の背景を確認するために必要です。この方法は特定の初期体積を必要としませんが、精製工程で粒子の約10%が失われると考えるべきです。
- EVサンプル開始の開始量に応じて、サンプルを15mLまたは500 μLの濃縮チューブに入れます。ほとんど乾燥したサンプルが得られるまで、製造業者の指示に従ってチューブを遠心分離します。
- 濃縮サンプルを希釈C.200 μLで再懸濁し、100 μLのコントロールグループを新しい1.5 mL遠心管に移します。
- EVサンプルを100 μLの2つのアリコートに分け、1つを染料でマークし、治療として使用します(PKH-PL-EV)。他のマークは無いままにしますが、それを処理します (NTA-PL-EV) EVサンプルのような EV サンプルとNTAによってEV濃度を定量化するためにそれを使用します。
- 2x色素溶液を調製し、8μM PKH26溶液を希釈Cに調製した。
- サンプル中の希釈液Cの125 μLあたり1 mM PKH26リンカーの1 μLを混ぜます。サンプルに追加するのに必要なボリュームを 1:1 の比率で準備します。
- PKH-PL-EVに2x色素溶液を加え、1:1比でサンプルを制御し、1x色素濃度と4μM PKH26濃度を達成します。同じ量のPBSをNTA-PL-EVサンプルに追加します。室温で5分間インキュベートします。
- 5%のウシ血清アルブミン-PBS溶液を1:1の比率でサンプルに加え、最終容積が〜400 μLであることを確認します。
注:このステップでは、非特異的な色素相互作用または非結合色素を除去することができます。 - ラベル付きの EV と、非バインド色素と非特異的な色素と列の相互作用を分離します。
3. ラベル付きEVアイソレーション
- カラムからキャップを取り出し、サンプル(PKH-PL-EV、NTA-PL-EV、またはコントロール)を400 μL加え、溶出した液体をすべて捨てます。
- 次の手順に進む前に、サンプルが列に完全に入るのを待ちます。600 μLのPBSを加え、溶出した液体をすべて捨てます。
- 次の手順に進む前に、PBS が列に完全に入るのを待ちます。600 μL の PBS を加え、1.5 で 600 μL の分数を集める。mL遠心チューブ(EVまたはコントロール)。
注: これらの手順は、サンプルから余分な染料を除去するために必要です。より純粋なEVを得るためには、カラムによる別の分離が必要です。したがって、新規の平衡カラム(ステップ4.1)または初期洗浄ステップ(ステップ4.2)の後の同じカラムで以下のステップを実行する必要があります。 - 新しい EV 分離ステップの列を準備して、より純粋な EV を取得します。新しい列の場合は、手順 2.1 を繰り返します。2.2.同じカラムの場合は、2.5 mLの20%イソプロパノールで洗浄し、ステップ2.1と2.2を繰り返します。
- ステップ2.5で取得した600μLのEVをカラムに追加し、溶出したボリュームを廃棄します。次のステップに進む前に、液体が列に入るのを待ちます。
- 400 μL の PBS を追加し、溶出したボリュームをすべて捨てます。次のステップに進む前に、液体が列に入るのを待ちます。
- 600 μL の PBS を加え、1.5 mL 遠心チューブに600 μLの分画を集める。EVと制御サンプルを使用してさらに解析を行うか、4°Cで一晩保管します。
- 使用する列を後で使用するために保存します。
- 20%イソプロパノールの25 mLでカラムを洗い、溶出したボリュームを捨てます。2.5mLのPBSで3回洗浄してください。
- ステップ 1.1.1 で取り外したストレージ・バッファーを追加し、バッファーが列に入るのを待ちます。列をキャップで覆い、その後使用するまで4oCで保管します。
4. EV定量化
- NTA-PL-EVサンプルの1:1,000希釈液と初期PL-EVサンプルを、以下の2つのステップで説明するとおり準備します。
- 1:10希釈NTA-PL-EVの1 mLと1:10希釈初期PL-EVの1 mLを、PBSを0.2 μmフィルターで濾過して準備します。
- 0.2 μmフィルターを通してPBSを濾過した前の希釈サンプルの1:100希釈液の1 mLを準備しなさい。
- 1:1,000希釈NTA-PL-EVサンプルまたは初期PL-EVサンプルを無菌シリンジを使用してNTAポンプに注入します。粒子濃度とサイズ分布の決定に関するメーカーの指示と推奨事項に従ってください。
注: EV濃度はサンプルスターターの体積に依存するため、中間希釈液を読み取り、正しいNTA判定を行うために調整が必要な場合があります。
5. 炎症を起こすOAの治療薬として使用されるEV
- PBSで軟骨を2回洗浄し、滅菌条件下で3mmの直径の生検パンチを使用して切除します。
メモ:細胞培養フードで手順5.1から5.6までの手順を実行します。 - 37 oC、5%CO2、および湿度80%で1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEM-F12培地を用いて96ウェル培養プレートに外植を入れる。
- 炎症駆動型OAモデルを確立するには、細胞培養培地に10 ng/mLオンコスタチンMおよび2ng/mL腫瘍壊死因子α(TNFα)を添加する。
- 1×119の標識EV(PKH-PL-EV)の粒子/ ウェルを有する外植物を治療するか、またはオンコスタチンMおよびTNFαを添加した細胞培養培地で制御する。
注: 109 パーティクル/ウェル×含むサンプルの体積を測定し、コントロールに同じボリュームを使用します。 - 軟骨外植を含む96ウェル細胞培養プレートから培地を取り除きます。ステップ5.3で説明した細胞培養培地の200μLを各ウェルに加える。
注:96ウェルプレートが牛胎児血清(FBS)と接触している場合は、200 μLのPBSで各井戸を3回洗浄して、FBSからEVを取り除きます。 - 異なる時間 にインビトロ アッセイを停止します: 0,1,2,3,4,および5時間。
- 軟骨外植を含む細胞培養井戸を200μLのPBSで2回洗浄します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の100 μLを組織に加え、4 oCで3時間固定します。
注: PFA に関する手順は、安全データシートの推奨事項に従ってヒュームフードで実行する必要があります。 - PFAを取り出し、PBSを100μL加え、固定組織を4°Cに保存し、48時間以内にサンプルを処理します。
6. 顕微鏡の準備と可視化
注:この組織学的手順は、脱水、パラフィン埋め込み、および水分補給ステップで構成されています。これらのステップは、全体的な色素蛍光を低減する可能性があります (PKH26 のデータシートに記載されている制限)。したがって、凍結断面化などの他の手順は、共焦点顕微鏡によるEV可視化に適している可能性がある。
- 固定組織をパラフィンブロックに埋め込みます。組織を6μmの厚い切片に切り取ります。
- 組織切片を分離します。
注:キシレンを使用するすべてのステップは、ヒュームフードで行う必要があります。- 組織切片を30分間キシレンに、100%エタノールを2分間、96%エタノールで2分間、75%エタノールで1分間、最後に蒸留水で30分間浸します。
- 組織切片を透過させる。
- 0.1%トリトン-0.1%クエン酸ナトリウム溶液を調製し、組織を透過させます。各組織セクションに20μLの滴を加え、室温で10分間インキュベートします。各セクションを20μLのPBSで2回洗浄します。
- 顕微鏡スライド上に、4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含む取り付け媒体の滴を加え、蛍光を保存するための水性取り付け媒体を付けます。ステップ6.3.1の3つの組織セクションを含むスライドを覆います。
- スライドを室温で一晩インキュベートし、光から保護します。
- 4 °Cで保存し、光から共焦点顕微鏡まで保護します。
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Representative Results
図 1に、EV ラベリングと取り込み監視の概略図の概要を示します。 表1 においてNTAによって検出された粒子濃度およびEVサイズは、カラムで標識した後に2回行った精製工程によるプロセス中にEV濃度が低下することを示す。しかし、得られる量は、処理に使用する粒子数の最適な範囲にある。この粒子濃度は、変形性関節症軟骨外植の治療に使用されるPKH-PL-EVおよび制御の体積を計算するために使用されます。
軟骨外植は、EVまたは対照群で処理されると、異なる期間(0、1、2、3、4、および5時間)に固定されます。各グループは、パラフィン化、スライス、DAPIを含む取り付け媒体と共焦点顕微鏡のために調製されます。各時点の各グループの代表的な画像を 図2に示し、EVが軟骨細胞に到達し、時間の経過とともにそれらを入力するまで、EVがどのように組織に入るかを示しています。
図2に示すように、ラベル付きEVは、1時間のインキュベーション(PKH26染料で赤色で示される)の後に既に軟骨細胞(DAPI染色で青色で示される)の周りに局在している。レムナント色素による背景は、EVを持たないが、EVサンプルと同じプロトコルに従って処理される対照群に対して観察することができる。これらの結果は、ここに示すように、インビトロアッセイやインビボ実験で組織を介して彼らの移行を監視するために使用することができるEVにラベルを付けるプロトコルの成功を確認します。
図1: EVラベリングおよび取り込み監視プロトコルの概略図 略語: PBS = リン酸緩衝生理食塩語;EV = 細胞外小胞;RT = 室温;BSA = ウシ血清アルブミン;NTA = ナノ粒子追跡分析;OA = 変形性関節症;TNFα = 腫瘍壊死因子-α;PL =血小板リセート;PFA = パラホルムアルデヒド;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 異なる時期におけるEV取り込みの代表的な画像 PKH標識EVまたは対照群でインキュベートされた変形性関節症軟骨外植の0、1、2、3、4、および5時間後に撮影された共焦点代表画像。画像は400倍で撮影されました。スケールバー= 50 μm略語: OA = 変形性関節症;PL =血小板リセート;EV = 細胞外小胞。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 濃度(粒子/mL) | 粒子サイズ (nm) | |
| PL-EV(初期) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| PKH26 を使用しない NTA-PL-EV (プロトコルの後) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
表1:ナノ粒子追跡解析による特性評価 略語: OA = 変形性関節症;PL =血小板リセート;EV = 細胞外小胞;NTA = ナノ粒子追跡解析
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Discussion
EVイメージングは、EVの放出や取り込みメカニズムなどのEV特性を理解するのに役立ちます。彼らのイメージングは、彼らの生体分布の監視と薬物動態特性の薬剤車としての特徴を可能にする。しかし、EVイメージングおよび追跡は、そのサイズが小さいため困難である可能性がありますが、多くのイメージングデバイスおよびラベリング技術は、研究者がin vitroおよびin vivo条件23、24、25の下でEVを監視するのを助けるために開発されています。
光顕微鏡でEVを追跡する場合、生物発光と蛍光イメージングの2つの可能性があります。どちらも可視光スペクトル(390~700 nm)内のEVを検出するために使用されます。生物発光は、ルシファーゼがその基質の酸化を触媒した後に生成される化学発光の一種です。この信号は検出のために超高感度電荷結合デバイス(CCD)カメラを必要とするが、信号は外付け光源26を必要としないので、信号対雑音比が高い。
蛍光イメージングは、外部光源からの励起後にシグナルを発するタンパク質または有機色素を使用します。生物発光と比較すると、蛍光はCCDカメラで検出しやすくなります。さらに、生物発光では、基質の毒性および基質の生物発光の半減期をリアルタイムEV追跡27、28のために考慮すべきである。
これに対し、蛍光タンパク質および有機色素ベースの標識は、光学顕微鏡における優れた分解能で使用されてきました。蛍光強度はEVタンパク質発現レベルに依存するが、膜領域におけるEV標識の効率、および励起光源、蛍光色素はEVイメージング25に安定した強力な信号を提供する。ほとんどの有機蛍光色素は、細胞膜イメージングに最初に使用されました。これらの色素は一般に、異なる官能基29を介してEV上の目的とする脂質二重層またはタンパク質に標識するフルオロフォアを結合する。
有機蛍光色素ファミリーの1つは、脂質二重層に固定する親油性カルボシアニンを有する蛍光性カルボシアニンを有する蛍光体からなる親油性PKH色素ファミリーである30,31である。PKH色素は、生体外の半減期の範囲としてインビトロおよびインビボ研究に使用されています 5 から >100 日.したがって、インビボでの染料の持続性は、染料の半減期よりも短い期間の研究において誤解を招く結果をもたらす可能性がある。しかし、PKH色素は、EV移行32を示すためにトレーサとして有用である。
PKH26は、このPKHの親油性フルオロフォアファミリーのメンバーであり、551nmで励起のピークと567nmの発光を有する赤色スペクトルに見られる。これにより、ローダミン、フィコエリエリン、DAPI33などの他の検出チャネルと互換性があり、この場合、DAPIでマークされた軟骨細胞に向かってPKH26でマークされたEVの移行を可能にします。PLはEVソースとして使用されていましたが、このプロトコルは他のソースのEVや他の目的、例えば 、EVのin vivo 分布を追跡するために使用できることに注意してください。
このプロトコルには、いくつかの制限があります。例えば、PKH26がEVサイズを増加させ、生体分布や細胞の取り込みに影響を与える可能性があるという懸念があります。しかし、PKH26によりEVサイズが増加したような場合には、このプロトコル34で説明したラベル付け手順とは異なっていた。これらの研究者は、洗浄および精製ステップを含まなかったため、より高いレベルのフリー染料を引き起こし、より大きなEVサイズを引き起こす可能性があります。また、本プロトコルは、PKH26の有無にかかわらず並列EV精製を行うことにより、この問題を克服する。これにより、ラベルなし EV サンプルの特性評価が可能になり、ラベル付けされたものと同じように処理されます。したがって、非特異的に標識された粒子(リポタンパク質またはタンパク質試料汚染物質)または標識混合物内の非EV粒子の存在による誤解を招く定量は、前に35,36に示されるように避けることができる。
本論文では、カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、2サイクルの精製を行った。最初のものは、スクロース勾配遠心分離によって置換され得る。しかし、全てのEV集団は、このカラムと同じ溶出アリコートで収集され、高速遠心分離で遭遇した高 g 力を受けていない。しかし、遠心分離を避けることは、特に分離サイクル間でカラムの打ち上げが必要な場合、プロセスが遅くなる可能性があります。このプロトコルのもう 1 つの制限は、カラムの体積が限られているため、ラベリングプロセスを開始する前にサンプル濃度が必要な点です。このハンディキャップは、より高い積載量の列を使用することで克服できます。
他の EV ラベルプロトコルは、異なる色素の使用を記述します。しかし、超遠心段階の使用は、EVの完全性37を損傷する可能性があります。ここで説明するプロトコルは、特定の機能を持たない共焦点顕微鏡で容易に軟骨外植のEV移動および取り込みのモニタリングを可能にした。さらに、これは生体 内 アッセイなどの他の組織および脂質サンプルまたは条件に外挿されてもよい。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
この研究は、ESF欧州社会基金とERDF欧州地域開発基金(MS16/00124)が共同出資する、インスティトゥート・デ・サルド・カルロス3世、エコノミア・イ・コンペティビビダード大臣(MS16/00124;CP16/00124);プログラムによってジュニアデルプロイエクトタレントプラス,コンストラクションイェルドSALUD, ジェネランドヴァロル (JUNIOR01/18), バレアレス諸島の持続可能な観光税によって資金調達;ディレッキオ・ジェネラル・デインベスティガシオ、コンセラーリア・デ・インベスティガシオ、ガリア統治(FPI/2046/2017);FUTURMed内のFOLIUMポスダリックプログラム(FOLIUM 17/01)によって、バレアレス諸島の持続可能な観光税によって50%、ESFによって50%で賄われた。そして、コミシオ・デ・ドチェンシア・イ・インベスティガシオ・デ・ラ・フンダシオ・バンク・デ・サン・イ・テイシッツ・デ・レ・イレス・バリアーズ(CDI21/03)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
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