Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden in verschiedenen Studien verwendet, um ihr Potenzial als zellfreie Behandlung aufgrund ihrer Ladung aus ihrer zellulären Quelle, wie z.B. Thrombozytenlysat (PL), nachzuweisen. Wenn sie als Behandlung verwendet werden, wird erwartet, dass EVs in die Zielzellen eindringen und eine Reaktion von diesen bewirken. In dieser Forschung wurden PL-abgeleitete EVs als zellfreie Behandlung von Osteoarthritis (OA) untersucht. So wurde eine Methode entwickelt, um EVs zu kennzeichnen und ihre Aufnahme an Knorpelexplantaten zu testen. PL-abgeleitete EVs werden mit dem lipophilen Farbstoff PKH26 markiert, zweimal durch eine Säule gewaschen und dann in einem in vitro entzündungsgetriebenen OA-Modell für 5 h nach Partikelquantifizierung durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) getestet. Stündlich werden Knorpelexplantate fixiert, paraffiniert, in 6-μm-Abschnitte geschnitten, um sie auf Objektträgern zu montieren, und unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob EVs während dieser Zeit in die Zielzellen (Chondrozyten) gelangen und ihre direkte Wirkung zu analysieren.
Introduction
Osteoarthritis (OA) ist eine artikuläre degenerative Erkrankung, die eine fortschreitende und irreversible Entzündung und Zerstörung der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpelsimpliziert 1. Obwohl verschiedene Formen der Arthritis zahlreiche Behandlungenhaben 2,3,4, sind diese durch ihre Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit eingeschränkt. Tissue-Engineering-Techniken unter Verwendung der autologen Chondrozytenimplantation werden routinemäßig zur regenerativen Behandlung von verletztem Knorpel bei frühen OA-Knorpelläsionen angewendet4. Zellbasierte Therapien sind vor allem aufgrund der begrenzten Anzahl von phänotypisch stabilen Chondrozyten oder Chondroprogenitoren eingeschränkt, die in der Lage sind, den Knorpel effektiv zu reparieren3. Daher ist die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Verhinderung des Fortschreitens der Krankheit und zur Regeneration großer Knorpelläsionen von größter Bedeutung.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden von verschiedenen Autoren als Behandlung für OA vorgeschlagen5,6. EVs sind membranöse Körper, die von der Mehrheit der Zelltypen sezerniert werden, an der interzellulären Signalgebung beteiligt sind und nachweislich die therapeutische Wirkung von Stammzellen ausüben7,8,9, wodurch sie kürzlich Interesse an der regenerativen Medizin geweckt haben10. EVs, die von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) abgeleitet sind, sind die wichtigsten therapeutischen EVs, die für OA untersucht wurden, obwohl andere gelenkbezogene Zellen als EV-Quellen verwendet wurden, z. B. Chondroprogenitoren oder Immunzellen11,12.
Thrombozytenkonzentrate, wie Thrombozytenlysate (PLs), werden verwendet, um die Wundheilung bei verschiedenen Verletzungen, wie Hornhautgeschwüren13 , 14,15 oder bei der Sehnengewebsregeneration16zu verbessern , aufgrund der Hypothese, dass die EV-Komponente von Thrombozytenkonzentraten für diese Effekte verantwortlich sein kann17 . Einige Studien im Zusammenhang mit Gelenkerkrankungen verwenden thrombozytenbasierte EVs (PL-EVs) zur Behandlung, um osteoarthritische Zustände zu verbessern. PL-EVs verbessern die Chondrozytenproliferation und Zellmigration, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg18aktivieren, die Expression chondogener Marker in osteoarthritischen Chondrozytenfördern 19oder höhere Konzentrationen chondogener Proteine und weniger tissuläre Anomalien bei osteoarthritischen Kaninchen zeigen, die mit PL-EVs behandelt wurden18.
EVs enthalten Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die an die Zielzelle abgegeben werden, wodurch eine Zell-zu-Zell-Kommunikation hergestellt wird, die das Hauptmerkmal im Zusammenhang mit ihren therapeutischen Anwendungen ist20. Die Auswirkungen von Elektrofahrzeugen hängen von ihren erreichenden Zellen und der anschließenden Freisetzung von Fracht ab. Dieser Effekt kann indirekt durch Veränderungen in Zellen bestätigt werden, wie z.B. Stoffwechselaktivität oder Genexpressionsmodifikation. Diese Methoden erlauben jedoch nicht die Visualisierung, wie EVs Zellen erreichen, um ihre Funktion auszuüben. Daher stellt dieses Papier eine Methode zur Kennzeichnung dieser PL-abgeleiteten EVs vor, die zur Behandlung von entzündungsbedingten OA-Knorpel-Explantaten eingesetzt werden sollen. Die konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die EV-Aufnahme und das Fortschreiten zu den in den Explantaten vorhandenen Chondrozyten in einem Zeitraffer von 5 h zu überwachen.
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Protocol
HINWEIS: Knorpelexplantaten wurden von der IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien nach ethischer Genehmigung des Projekts durch die CEI-IB (IB 3656118 PI) bezogen.
1. Säulenvorbereitung
- Setzen Sie die Spalten gemäß den Anweisungen des Herstellers oder wie folgt aus:
- Entfernen Sie die Spaltenkappe, und gleichen Sie die Spalte aus. Entfernen Sie den Speicherpuffer durch Elution.
- Waschen Sie die Säule 3 mal mit 2,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Warten Sie bei jeder Wäsche, bis die Säule das gesamte Volumen absorbiert hat.
HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht trocknen. - Decken Sie die Säule nach der letzten Wäsche und bis zur Probenvorbereitung mit der Kappe ab.
2. EV-Kennzeichnung
HINWEIS: Dieses EV-Kennzeichnungsprotokoll verwendet eine PL-EV-Probe, die zuvor durch Größenausschlusschromatographie (SEC) mit den zuvor beschriebenenBedingungen 21,22isoliert wurde. Jede EV-Probe aus einer beliebigen Quelle kann jedoch mit diesem Protokoll verwendet werden.
- Konzentrieren Sie die EV-Probe und die Steuerung (PBS) mit einem konzentrierenden Röhrchen.
- Legen Sie die Proben in ein 15 mL oder 500 μL konzentrierendes Röhrchen, abhängig vom Startvolumen der EV-Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers, bis eine fast trockene Probe erhalten ist.
HINWEIS: Die Kontrollprobe ist notwendig, um nach Farbstoffhintergrund zu suchen. Obwohl diese Methode kein spezifisches Anfangsvolumen erfordert, sollte berücksichtigt werden, dass während der Reinigungsschritte etwa 10% der Partikel verloren gehen.
- Legen Sie die Proben in ein 15 mL oder 500 μL konzentrierendes Röhrchen, abhängig vom Startvolumen der EV-Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers, bis eine fast trockene Probe erhalten ist.
- Resuspendieren Sie die konzentrierten Proben mit Verdünnungsmittel C. Resuspend EV Proben mit 200 μL und die Kontrollgruppe mit 100 μL und übertragen Sie sie auf neue 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
- Trennen Sie die EV-Probe in zwei Aliquots von 100 μL. Markieren Sie eine mit Farbstoff und verwenden Sie sie als Behandlung (PKH-PL-EV); Lassen Sie die andere unmarkiert, aber verarbeiten Sie sie (NTA-PL-EV) wie die EV-Probe und verwenden Sie sie, um die EV-Konzentration durch NTA zu quantifizieren.
- 2x Farbstofflösung herstellen, was zu 8 μM PKH26 Lösung in Verdünnungsmittel C führt.
- Mischen Sie 1 μL 1 mM PKH26 Linker pro 125 μL Verdünnungsmittel C in der Probe. Bereiten Sie ein Volumen vor, das erforderlich ist, um die Proben im Verhältnis 1: 1 hinzuzufügen.
- Fügen Sie PKH-PL-EV 2x Farbstofflösung hinzu und kontrollieren Sie Proben im Verhältnis 1: 1, um eine 1x Farbstoffkonzentration und eine 4 μM PKH26-Konzentration zu erreichen. Fügen Sie der NTA-PL-EV-Probe das gleiche PBS-Volumen hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Geben Sie 5% ige Rinderserumalbumin-PBS-Lösung im Verhältnis 1: 1 zu den Proben und stellen Sie sicher, dass das Endvolumen ~ 400 μL beträgt.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von unspezifischen Farbstoffwechselwirkungen oder ungebundenen Farbstoffen. - Trennen Sie die markierten EVs vom ungebundenen Farbstoff und den unspezifischen Wechselwirkungen des Farbstoffs mit der Säule.
3. Gekennzeichnete EV-Isolierung
- Entfernen Sie die Kappe aus der Säule, fügen Sie 400 μL der Probe hinzu (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV oder Kontrolle) und verwerfen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit.
- Warten Sie, bis das Beispiel vollständig in die Spalte gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und verwerfen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit.
- Warten Sie, bis der PBS die Spalte vollständig aufgerufen hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 μL in einem 1,5. ml Zentrifugenröhrchen (EVs oder Steuerung).
HINWEIS: Diese Schritte sind erforderlich, um den überschüssigen Farbstoff aus den Proben zu entfernen. Eine weitere Trennung nach Säulen ist erforderlich, um reinere EVs zu erhalten. Daher sollten die folgenden Schritte in einer neuen äquilibrierten Spalte (Schritt 4.1.) oder derselben Spalte nach einem ersten Waschschritt (Schritt 4.2) durchgeführt werden. - Bereiten Sie die Säule für einen neuen EV-Trennschritt vor, um reinere EVs zu erhalten. Wenn es sich um eine neue Spalte handelt, wiederholen Sie die Schritte 2.1. und 2.2. Wenn es sich um dieselbe Säule handelt, waschen Sie die Säule mit 2,5 ml 20% Isopropanol und wiederholen Sie dann die Schritte 2.1 und 2.2.
- Fügen Sie 600 μL der zuvor eluierten EVs, die in Schritt 2.5 erhalten wurden, in die Spalte und verwerfen Sie das eluierte Volumen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit vollständig in die Säule gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Fügen Sie 400 μL PBS hinzu und verwerfen Sie das gesamte eluierte Volumen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit vollständig in die Säule gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 μL in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie die EVs und Kontrollproben für weitere Analysen oder lagern Sie sie über Nacht bei 4 oC.
- Speichern Sie die verwendeten Spalten für die zukünftige Verwendung.
- Waschen Sie die Säule mit 25 ml 20% Isopropanol und verwerfen Sie das eluierte Volumen. Waschen Sie die Säule 3 mal mit 2,5 ml PBS.
- Fügen Sie den in Schritt 1.1.1 entfernten Speicherpuffer hinzu, und warten Sie, bis der Puffer in die Spalte gelangt ist. Decken Sie die Säule mit der Kappe ab und lagern Sie sie bis zum späteren Gebrauch bei 4 oC.
4. EV-Quantifizierung
- Bereiten Sie 1:1.000 Verdünnungen der NTA-PL-EV-Probe und der anfänglichen PL-EV-Probe vor, wie in den folgenden zwei Schritten beschrieben.
- Bereiten Sie 1 ml 1:10 verdünntes NTA-PL-EV und 1 ml 1:10 verdünntes anfängliches PL-EV mit PBS vor, das durch einen 0,2 μm-Filter filtriert wird.
- Bereiten Sie 1 ml einer 1:100-Verdünnung der zuvor verdünnten Proben mit PBS vor, das durch einen 0,2 μm-Filter filtriert wird.
- Injizieren Sie die 1:1.000 verdünnte NTA-PL-EV-Probe oder die anfängliche PL-EV-Probe mit einer sterilen Spritze in die NTA-Pumpe. Befolgen Sie die Anweisungen und Empfehlungen des Herstellers zur Bestimmung der Partikelkonzentration und der Größenverteilung.
HINWEIS: Da die EV-Konzentration vom Probenstartervolumen abhängt, kann es erforderlich sein, Zwischenverdünnungen abzulesen und Anpassungen vorzunehmen, um eine korrekte NTA-Bestimmung zu erhalten.
5. EVs zur Behandlung von entzündungsbedingter OA
- Waschen Sie den Knorpel zweimal mit PBS und schneiden Sie ihn mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von 3 mm unter sterilen Bedingungen aus.
HINWEIS: Führen Sie das Verfahren aus den Schritten 5.1 bis 5.6 in einer Zellkulturhaube aus. - Legen Sie die Explantate in 96-Well-Kulturplatten mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 oC, 5%CO2und 80% Luftfeuchtigkeit.
- Um ein entzündungsgetriebenes OA-Modell zu etablieren, ergänzen Sie das Zellkulturmedium mit 10 ng/ml Oncostatin M und 2 ng/ml Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα).
- Behandeln Sie die Explantate mit 1 × 109 Partikeln/Well von markierten EVs (PKH-PL-EV) oder kontrollieren Sie sie in einem Zellkulturmedium, das mit Oncostatin M und TNFα ergänzt wird.
ANMERKUNG: Messen Sie das Volumen der Probe, die 1 × 109 Partikel/Vertiefung enthält, und verwenden Sie das gleiche Volumen für die Kontrolle. - Entfernen Sie das Medium von den 96-Well-Zellkulturplatten, die Knorpel-Explantate enthalten. Zu jeder Vertiefung werden 200 μL des in Schritt 5.3 beschriebenen Zellkulturmediums gegeben.
HINWEIS: Wenn die 96-Well-Platten mit fetalem Rinderserum (FBS) in Kontakt gekommen sind, waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 μL PBS, um EVs aus dem FBS zu entfernen. - Stoppen Sie den In-vitro-Test zu verschiedenen Zeiten: 0, 1, 2, 3, 4 und 5 h.
- Waschen Sie die Zellkulturtöpfe, die die Knorpelexplantate enthalten, zweimal mit 200 μL PBS.
- Geben Sie 100 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) in das Gewebe, um es für 3 h bei 4 oC zu fixieren.
HINWEIS: Schritte mit PFA sollten in einem Abzug gemäß den Empfehlungen des Sicherheitsdatenblatts durchgeführt werden. - Entfernen Sie die PFA, geben Sie 100 μL PBS hinzu, lagern Sie das fixierte Gewebe bei 4 °C und verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 48 h.
6. Vorbereitung und Visualisierung der Mikroskopie
HINWEIS: Dieses histologische Verfahren besteht aus Dehydratisierung, Paraffineinbettung und Rehydratationsschritten. Diese Schritte können die Gesamtfluoreszenz des Farbstoffs reduzieren (eine Einschränkung, die im Datenblatt für PKH26 erwähnt wird). Daher können andere Verfahren, wie z. B. gefrorene Schnitte, für die EV-Visualisierung durch konfokale Mikroskopie besser geeignet sein.
- Betten Sie die fixierten Gewebe in Paraffinblöcke ein. Schneiden Sie das Gewebe in 6 μm dicke Abschnitte.
- Entparaffinisieren Sie die Gewebeschnitte.
HINWEIS: Alle Schritte mit Xylol sollten in einem Abzug durchgeführt werden.- Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 30 min in Xylol, 2 min in 100% Ethanol, 2 min in 96% Ethanol, 1 min in 75% Ethanol und schließlich 30 s in destilliertes Wasser.
- Permeabilisieren Sie die Gewebeschnitte.
- Bereiten Sie eine 0,1% ige Triton-0,1% Natriumcitratlösung vor, um das Gewebe zu permeabilisieren. Geben Sie einen 20 μL Tropfen zu jedem Gewebeabschnitt und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie jeden Abschnitt zweimal mit 20 μL PBS.
- Auf einem mikroskopisch kleinen Objektträger wird ein Tropfen Montagemedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) mit einem wässrigen Montagemedium zur Erhaltung der Fluoreszenz gegeben. Bedecken Sie das Objektträger mit 3 Gewebeschnitten aus Schritt 6.3.1.
- Inkubieren Sie die Dias über Nacht bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.
- Bis zur konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt bei 4 °C lagern.
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Representative Results
Eine schematische Übersicht für die EV-Kennzeichnung und die Überwachung der Aufnahme ist in Abbildung 1 dargestellt. Die von NTA in Tabelle 1 detektierte Partikelkonzentration und EV-Größe zeigen, dass die EV-Konzentration während des Prozesses aufgrund des nach der Markierung mit der Säule zweimal durchgeführten Reinigungsschritts abnimmt. Die erhaltene Menge liegt jedoch im optimalen Bereich der Anzahl der für die Behandlung zu verwendenden Partikel. Diese Partikelkonzentration wird verwendet, um das Volumen von PKH-PL-EV und die Kontrolle zu berechnen, die zur Behandlung von osteoarthritischen Knorpelexplantaten verwendet werden.
Sobald die Knorpelexplantate mit EVs oder der Kontrollgruppe behandelt wurden, werden sie für verschiedene Zeiträume fixiert: 0, 1, 2, 3, 4 und 5 h. Jede Gruppe wird dann paraffinisiert, geschnitten und für die konfokale Mikroskopie mit einem DaPI-haltigen Montagemedium vorbereitet. Repräsentative Bilder für jede Gruppe zu jedem Zeitpunkt sind in Abbildung 2dargestellt und zeigen, wie EVs in das Gewebe eindringen, bis sie die Chondrozyten erreichen und im Laufe der Zeit in sie eindringen.
Wie in Abbildung 2zu sehen ist, sind markierte EVs bereits nach 1 h Inkubation (rot dargestellt mit PKH26-Farbstoff) um Chondrozyten lokalisiert (blau dargestellt mit DAPI-Färbung). Ein gewisser Hintergrund aufgrund von Restfarbstoff kann für die Kontrollgruppe beobachtet werden, die keine EVs hat, aber nach dem gleichen Protokoll wie die EV-Probe verarbeitet wird. Diese Ergebnisse bestätigen den Erfolg des Protokolls zur Kennzeichnung von EVs, mit denen ihre Migration durch Gewebe in In-vitro-Assays, wie hier gezeigt, und in In-vivo-Experimenten überwacht werden kann.
Abbildung 1: Schematische Übersicht für das EV-Kennzeichnungs- und Aufnahmeüberwachungsprotokoll. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; EV = extrazelluläres Vesikel; RT = Raumtemperatur; BSA = Rinderserumalbumin; NTA = Nanopartikel-Tracking-Analyse; OA = Osteoarthritis; TNFα = Tumornekrosefaktor-alpha; PL = Thrombozytenlysat; PFA = Paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der EV-Aufnahme zu verschiedenen Zeiten. Konfokale repräsentative Bilder, die nach 0, 1, 2, 3, 4 und 5 h osteoarthritischer Knorpelexplantaten aufgenommen wurden, die mit PKH-markierten EVs oder mit einer Kontrollgruppe inkubiert wurden. Die Bilder wurden mit 400x aufgenommen. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: OA = Osteoarthritis; PL = Thrombozytenlysat; EV = extrazelluläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Konzentration (Partikel/ml) | Partikelgröße (nm) | |
| PL-EVs (initial) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| NTA-PL-EVs ohne PKH26 (nach dem Protokoll) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
Tabelle 1: Charakterisierung durch Nanopartikel-Tracking-Analyse. Abkürzungen: OA = Osteoarthritis; PL = Thrombozytenlysat; EV = extrazelluläres Vesikel; NTA = Nanopartikel-Tracking-Analyse.
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Discussion
DIE EV-Bildgebung hilft, ev-Eigenschaften zu verstehen, wie z.B. ihre Freisetzungs- und Aufnahmemechanismen. Ihre Bildgebung ermöglicht die Überwachung ihrer Bioverteilung und die Charakterisierung ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften als Wirkstoffvehikel. Die Bildgebung und Verfolgung von Elektrofahrzeugen kann jedoch aufgrund ihrer geringen Größe schwierig sein, obwohl viele bildgebende Geräte und Markierungstechniken entwickelt wurden, um Forschern bei der Überwachung von Elektrofahrzeugen unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen zu helfen23,24,25.
Bei der Verfolgung von Elektrofahrzeugen durch optische Mikroskopie gibt es zwei Möglichkeiten: Biolumineszenz und Fluoreszenzbildgebung. Beide werden verwendet, um EVs innerhalb des sichtbaren Lichtspektrums (390-700 nm) zu erkennen. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die produziert wird, nachdem eine Luciferase die Oxidation ihres Substrats katalysiert hat. Obwohl dieses Signal für die Erkennung eine CCD-Kamera (Ultrasensitive Charge-Coupled Device) erfordert, hat es ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, da das Signal keine externe Lichtquellebenötigt 26.
Die Fluoreszenzbildgebung verwendet Proteine oder organische Farbstoffe, die nach Anregung von einer externen Lichtquelle Signale aussenden. Im Vergleich zur Biolumineszenz ist fluoreszenz von einer CCD-Kamera leichter zu erkennen. Darüber hinaus sollten bei der Biolumineszenz die Substrattoxizität und die Halbwertszeit der Biolumineszenz des Substrats für die Echtzeit-EV-Verfolgung berücksichtigt werden27,28.
Im Gegensatz dazu wurden fluoreszierende Protein- und organische Farbstoff-basierte Markierungen mit ausgezeichneter Auflösung in der optischen Mikroskopie verwendet. Obwohl die Fluoreszenzintensität von der EV-Proteinexpression, der Effizienz der EV-Markierung an Membrandomänen und der Anregungslichtquelle abhängt, liefern Fluoreszenzfarbstoffe stabile und starke Signale für die EV-Bildgebung25. Die meisten organischen Fluoreszenzfarbstoffe wurden ursprünglich für die Zellmembranbildgebung verwendet. Diese Farbstoffe kombinieren im Allgemeinen Fluorophore, die die Lipiddoppelschicht oder Proteine von Interesse auf EVs über verschiedene funktionelle Gruppen markieren29.
Eine organische Fluoreszenzfarbstofffamilie ist die lipophile PKH-Farbstofffamilie, bestehend aus Fluorophoren mit einem lipophilen Carbocyanin, das in der Lipiddoppelschicht für die Fluoreszenzbildgebungverankert ist 30,31. PKH-Farbstoffe wurden für In-vitro- und In-vivo-Studien verwendet, da ihre In-vivo-Halbwertszeit zwischen 5 und >100 Tagen liegt. So kann die Persistenz des Farbstoffs in vivo in Studien mit kürzerer Dauer als der Halbwertszeit des Farbstoffs zu irreführenden Ergebnissen führen. PKH-Farbstoffe sind jedoch als Tracer nützlich, um die EV-Migration32zu zeigen.
PKH26 ist ein Mitglied dieser PKH lipophilen Fluorophorfamilie, die im roten Spektrum mit einem Erregungsmaximum bei 551 nm und einer Emission bei 567 nm vorkommt. Dies macht es kompatibel mit anderen Nachweiskanälen wie Rhodamin, Phycoerythrin oder DAPI33, was den Nachweis von in diesem Fall die Migration von mit PKH26 markierten EVs zu Chondrozyten ermöglicht, die mit DAPI markiert sind. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl PL hier als EV-Quelle verwendet wurde, dieses Protokoll mit EVs aus anderen Quellen und für andere Zwecke verwendet werden kann, z. B. um die in vivo-Verteilung von EVs zu verfolgen.
Dieses Protokoll hat einige Einschränkungen; Zum Beispiel gibt es einige Bedenken, dass PKH26 die EV-Größe erhöht, was ihre Bioverteilung und zelluläre Aufnahme beeinflussen kann. In solchen Fällen, in denen die EV-Größe durch PKH26 erhöht wurde, unterschied sich das Kennzeichnungsverfahren jedoch von dem in diesem Protokoll34beschriebenen. Diese Forscher schlossen die Wasch- und Reinigungsschritte nicht ein, was zu einem höheren Gehalt an freiem Farbstoff führte, der die größere EV-Größe verursachen könnte. Darüber hinaus überwindet das vorliegende Protokoll dieses Problem, indem es eine parallele EV-Reinigung mit und ohne PKH26 durchführt. Dies ermöglicht die Charakterisierung einer unmarkierten EV-Probe, die identisch mit der markierten verarbeitet wurde. Somit kann eine irreführende Quantifizierung aufgrund von verwirrenden nicht spezifisch markierten Partikeln (Lipoprotein- oder Proteinprobenkontaminanten) oder durch das Vorhandensein von Nicht-EV-Partikeln innerhalb des Markierungsgemisches vermieden werden, wie zuvor gezeigt35,36.
In dieser Arbeit wurden zwei Reinigungszyklen durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von Säulen durchgeführt. Die erste kann durch Saccharosegradientenzentrifugation ersetzt werden. Alle EV-Populationen wurden jedoch im selben eluierten Aliquot mit dieser Säule gesammelt und nicht hohen g-Kräften ausgesetzt, die bei der Hochgeschwindigkeitszentrifugation auftreten. Die Vermeidung einer Zentrifugation kann jedoch zu einem langsameren Prozess führen, insbesondere wenn zwischen den Trennzyklen Säulenwäschen erforderlich sind. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die Notwendigkeit einer Probenkonzentration vor Beginn des Etikettierprozesses aufgrund des begrenzten Volumens der Säule. Dieses Handicap kann durch den Einsatz von Säulen mit höherer Tragfähigkeit überwunden werden.
Andere EV-Kennzeichnungsprotokolle beschreiben die Verwendung verschiedener Farbstoffe; Ihre Verwendung von Ultrazentrifugationsschritten kann jedoch die Integrität von Elektrofahrzeugen beeinträchtigen37. Das hier beschriebene Protokoll hat die Überwachung der EV-Migration und -Aufnahme in Knorpelexplantaten mit einem konfokalen Mikroskop ohne besondere Funktion ermöglicht. Darüber hinaus kann dies auf andere Gewebe und Lipidproben oder -bedingungen, wie z. B. einen In-vivo-Assay, extrapoliert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds ESF und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung EFRE (MS16/00124; CP16/00124); durch das PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziert durch die nachhaltige Tourismusabgabe der Balearen; von der Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); durch das FOLIUM-Postdoktorandenprogramm (FOLIUM 17/01) innerhalb der FUTURMed, das zu 50% aus der Nachhaltigen Tourismussteuer der Balearen und zu 50% aus dem ESF finanziert wird; und vom Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
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