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Biology

वयस्क माउस तालु से प्राथमिक मौखिक केराटिनोसाइट्स का अलगाव और संस्कृति

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/62820
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 4, 1,5, 4, 1,3
1Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 4Division of Biomimetics, Faculty of Dentistry and Graduate School of Medical and Dental Sciences, Niigata University, 5Faculty of Medicine, University of Tsukuba

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क माउस तालू से व्युत्पन्न मौखिक केराटिनोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करता है। इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके एक मूल्यांकन विधि की भी सूचना दी गई है।

Abstract

वर्षों से, केराटिनोसाइट्स से जुड़े अधिकांश अध्ययन मानव और माउस त्वचा एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं। हाल ही में, मौखिक केराटिनोसाइट्स ने अपने अद्वितीय कार्य और विशेषताओं के कारण ध्यान आकर्षित किया है। वे मौखिक उपकला के होमोस्टैसिस को बनाए रखते हैं और पुनर्योजी उपचारों में अनुप्रयोगों के लिए संसाधनों के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, इन विट्रो अध्ययन जो वयस्क चूहों से मौखिक प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग करते हैं, एक कुशल और अच्छी तरह से स्थापित संस्कृति प्रोटोकॉल की कमी के कारण सीमित हैं। यहां, मौखिक प्राथमिक केराटिनोसाइट्स को वयस्क चूहों के तालू के ऊतकों से अलग किया गया था और एक वाणिज्यिक कम-कैल्शियम माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था जो एक चेलेक्स-सीरम के साथ पूरक था। इन स्थितियों के तहत, केराटिनोसाइट्स को प्रोलिफेरेटिव या स्टेम सेल जैसी स्थिति में बनाए रखा गया था, और बढ़े हुए मार्गों के बाद भी उनके भेदभाव को रोक दिया गया था। मार्कर अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि सुसंस्कृत मौखिक केराटिनोसाइट्स ने बेसल सेल मार्करों p63, K14, और α6-integrin को व्यक्त किया और भेदभाव मार्कर K13 और फाइब्रोब्लास्ट मार्कर PDGFRα के लिए नकारात्मक थे। इस विधि ने विट्रो में मौखिक उपकला स्टेम सेल कार्यों के अध्ययन में डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त व्यवहार्य और कृषि योग्य कोशिकाओं का उत्पादन किया।

Introduction

मौखिक उपकला रासायनिक या शारीरिक क्षति और जीवाणु और वायरल संक्रमण 1,2 सहित पर्यावरणीय तनाव से शरीर की रक्षा करने में पहली बाधा के रूप में कार्य करता है। मौखिक म्यूकोसा में स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम की एक बाहरी परत होती है जिसमें केराटिनोसाइट्स और अंतर्निहित संयोजी ऊतक होते हैं जिन्हें लैमिना प्रोपरिया कहा जाता है, जिसमें मुख्य रूप से फाइब्रोब्लास्ट और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स होते हैं। माउस मौखिक म्यूकोसा को मोटे तौर पर तीन उपप्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: मैस्टिकेटरी (हार्ड तालू और मसूड़े), विशेष (पृष्ठीय जीभ), और अस्तर (बुक्कल म्यूकोसा, वेंट्रल जीभ, नरम तालु, होंठ) म्यूकोसा 2,3 (चित्रा 1 ए)। मौखिक उपकला masticatory और विशेष mucosa में keratinized है और अस्तर म्यूकोसा में गैर keratinized. अपने शारीरिक स्थान के बावजूद, मौखिक उपकला त्वचा एपिडर्मिस के समान है जिसमें इसमें भेदभाव की अलग-अलग डिग्री के साथ कसकर पैक की गई उपकला कोशिकाएं होती हैं: बेसल परतें जिनमें अविभाजित कोशिकाएं होती हैं; spinous, दानेदार, और cornified परतें जो केराटिनाइज्ड एपिथेलियम, या मध्यवर्ती और सतही परतें बनाती हैं जो गैर-केराटिनाइज्ड एपिथेलियम बनाती हैं। ट्रांसजेनिक माउस मॉडल ने तालु, बुक्कल म्यूकोसा, जीभ और मसूड़े में मौखिक उपकला स्टेम कोशिकाओं की सेलुलर और आणविक विशेषताओं के अध्ययन की सुविधा प्रदान की है5,6,7,8,9,10,11। हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययन मुख्य रूप से विवो माउस प्रयोगों में उपयोग किए जाते हैं। सेल संस्कृति प्रणालियों को आमतौर पर स्थापित और कुशल प्रोटोकॉल की कमी के कारण नियोजित नहीं किया गया था।

एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली का उपयोग स्टेम सेल नियामकों, सेल-आधारित assays, और दवा स्क्रीनिंग के आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। वर्तमान में, त्वचा एपिडर्मिस के प्राथमिक केराटिनोसाइट्स की संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं, जिसमें बेसल केराटिनोसाइट्स को नैदानिक और अनुसंधान उद्देश्यों के लिए सफलतापूर्वक अलग और सुसंस्कृत किया जा सकता है12,13,14,15। 1980 में, हेनिंग्स एट अल ने दिखाया कि संस्कृति माध्यम में एक कम कैल्शियम एकाग्रता (< 0.09 mM Ca2 +) ने प्रसार की सुविधा प्रदान की और एक अविभाजित राज्य में कोशिकाओं को बनाए रखा। कैल्शियम के एक उच्च स्तर ने सेल भेदभाव को बढ़ावा दिया और प्रसार को कम कर दिया। इसके बाद, नवजात और वयस्क मुरीन एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स के लिए संस्कृति के तरीकों को स्थापित किया गया है और इन विट्रो अध्ययनों के लिए विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले कई माउस मॉडलों पर व्यापक रूप से लागू किया गया है17,18,19। यद्यपि त्वचा और मौखिक एपिथेलिया सामान्य विशेषताओं को साझा करते हैं, वे आंतरिक अंतर भी दिखाते हैं, उदाहरण के लिए, उनकी केराटिनाइजेशन स्थिति, टर्नओवर दर, जीन अभिव्यक्ति, और घाव भरने की क्षमता 3,11,20,21,22,23,24,25,26 में।

यद्यपि मानव मौखिक केराटिनोसाइट संस्कृति को सफलतापूर्वक 27,28,29 किया गया है, माउस मौखिक केराटिनोसाइट संस्कृति 30,31,32 पर प्रकाशन लक्ष्य ऊतक के छोटे आकार और त्वचा एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स की तुलना में कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताओं के कारण सीमित हैं। यह प्रोटोकॉल माउस प्राथमिक मौखिक केराटिनोसाइट्स के अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति तकनीकों का वर्णन करता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोग कुमामोटो विश्वविद्यालय और त्सुकुबा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु प्रयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।

1. अभिकर्मकों और संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. केराटिनोसाइट संस्कृति माध्यम के 40 मिलीलीटर तैयार करें जिसमें कैल्शियम के 60 μM और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के 600 μL शामिल हैं। 0.025% ट्रिप्सिन के 20 मिलीलीटर और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के 400 μL तैयार करें।
    1. ट्रिप्सिन निषेध समाधान को कमरे के तापमान पर पिघलाएं और चरण 4.1 में उपयोग करने तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: अलगाव अभिकर्मक पांच चूहों के ऊतक अलगाव के लिए तैयार किया जाता है।
  2. संस्कृति मीडिया तैयार करने के लिए, 500 मिलीलीटर माध्यम लें और एक विकास पूरक समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) (इसके बाद पूर्ण माध्यम के रूप में संदर्भित) और 20% कैल्शियम-समाप्त चेलेक्स-भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) 33 (इसके बाद चेलेक्स्ड-एफबीएस के रूप में संदर्भित)।

2. वयस्क माउस से तालु ऊतक का विच्छेदन

  1. पशु कल्याण से संबंधित सुविधा के नियमों के अनुपालन में गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा एक वयस्क C57BL / 6J माउस (या तो पुरुष या महिला) का बलिदान करें।
    1. मुंह के आस-पास के बालों को शेवर से हटा दें। कैंची का उपयोग करते हुए, गाल से जबड़े की ओर काटें, दोनों तरफ।
      नोट: माउस बलिदान से पहले anesthetized किया जा करने के लिए की जरूरत है। मेडेटोमिडिन, मिडाज़ोलम और ब्यूटोर्फेनॉल के एक संवेदनाहारी मिश्रण का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. मुंह को चौड़ा खोलने और कपास झाड़ू का उपयोग करके किसी भी रक्त को अवशोषित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। तालु को कीटाणुरहित करने के लिए, 10% पोविडोन-आयोडीन युक्त कपास झाड़ू के साथ मुंह के अंदर पोंछें।
  3. माउस तालू की कटाई के लिए, सबसे पहले, मैक्सिलरी दांतों के तालु पक्ष के साथ एक पूर्ण मोटाई सीमांत चीरा बनाने के लिए एक सर्जिकल स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। फिर, सावधानीपूर्वक एक रास्पेटोरियम का उपयोग करके पूरे तालु को विच्छेदित करें।
    नोट: एक raspatorium एक उपकरण एक mucoperiosteal प्रालंब ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 1B) को ऊपर उठाने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  4. तालु ऊतक को जल्दी से 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्ण माध्यम + एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के 4 एमएल होते हैं। ऊतकों को इनक्यूबेशन के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
    नोट: एकाधिक चूहों से संग्रह के लिए, तालु ऊतकों को बर्फ पर 4 घंटे तक रखा जा सकता है।

3. तालु ऊतक के Pretreatment

  1. एक लैमिनर फ्लो हुड में, ऊतकों को 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 4 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम + एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान होता है।
  2. छोटे, कुंद संदंश और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके, ऊतकों से किसी भी रक्त को धीरे से हटा दें। ऊतकों को पूर्ण माध्यम में 10 बार धोएं।
  3. ऊतकों को 0.025% ट्रिप्सिन के 4 एमएल + एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान वाले 35 मिमी डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें उपकला सतह नीचे का सामना कर रही है।
    नोट: उपकला सतह, जो अंदर की ओर घटता है, ट्रिप्सिन समाधान में भिगोया जाना चाहिए; लामिना propria ऊपर का सामना करना चाहिए. ऊतक को ट्रिप्सिन समाधान में पूरी तरह से इनक्यूबेट करने के लिए जितना संभव हो उतना चपटा किया जाना चाहिए।
  4. संस्कृति हुड में कमरे के तापमान पर ~ 16 ज के लिए 0.025% ट्रिप्सिन में ऊतकों को इनक्यूबेट करें।

4. संग्रह और प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति

  1. कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, ट्रिप्सिन समाधान (35 मिमी डिश में) से ऊतक को हटा दें और उपकला सतह का सामना करने वाले 60 मिमी डिश (4 एमएल प्रति डिश) में ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान में स्थानांतरित करें।
  2. तालु के किनारे पर पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करना, धीरे से एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके अंतर्निहित लामिना प्रोपरिया से उपकला परत को स्क्रैप करें।
    नोट: संयोजी ऊतक ट्रिप्सिन द्वारा पचा नहीं है, इसलिए यह स्क्रैपिंग के दौरान छील नहीं करता है।
  3. ऊतकों से उपकला कोशिकाओं की अधिकतम मात्रा को इकट्ठा करने के लिए, ऊतक को 4 एमएल पूर्ण माध्यम के साथ एक और 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें और स्क्रैपिंग चरण को दोहराएं।
    नोट: ब्लेड की नोक के साथ ऊतक को स्क्रैप करने से बचने के लिए सुनिश्चित करें; इसके बजाय ब्लेड के किनारे का उपयोग करें। स्क्रैपिंग प्रति ऊतक 5-10 मिनट के लिए किया जाता है।
  4. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक बाँझ 100 μm सेल छलनी रखें।
  5. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करते हुए, अपनी सतह को गीला करने के लिए छलनी में ट्रिप्सिन समाधान (चरण 4.1 से) के 2 मिलीलीटर स्थानांतरित करें।
  6. एक पिपेट का उपयोग करके, 60 मिमी डिश (चरण 4.2-4.3 से) में सेल निलंबन को कुछ बार मिलाएं और चरण 4.4-4.5 में तैयार 100 μm सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  7. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। ट्रिपैन नीले समाधान के 15 μL तैयार करें और सेल निलंबन के 15 μL जोड़ें (चरण 4.6)। एक हेमोसाइटोमीटर के लिए सेल-ट्रिपैन नीले मिश्रण के 10 μL को स्थानांतरित करें और कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    नोट: माउस तालू का एक टुकड़ा 1 मिलियन कोशिकाओं तक उपज कर सकता है।
  8. गिनती करते समय, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100 x g पर ट्यूब (चरण 4.6 से) को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. एक पिपेट के साथ supernatant aspirate. ट्यूब में पूर्ण माध्यम + chelexed-FBS के 2 mL जोड़ें। एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके कई बार triturating द्वारा सेल गोली resuspend.
  10. प्लेट 2-5 x 105 कोशिकाओं को एक माउस से कोलेजन प्रकार I के साथ लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेट पूर्व-लेपित के एक कुएं में ( सामग्री की तालिका देखें)।
  11. माध्यम को बदलने के बिना 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  12. सीडिंग के दो दिन बाद, संस्कृति माध्यम के आधे हिस्से को पूर्ण माध्यम + चेलेक्स्ड-एफबीएस के साथ बदलें। माइक्रोस्कोप के नीचे सेल आकृति विज्ञान की जांच करें। हर 2 दिनों में पूर्ण माध्यम + chelexed-FBS के साथ फ़ीड कोशिकाओं।
    नोट: सीडिंग के बाद, विभिन्न आकारों की कोशिकाओं को देखा जाएगा। सीडिंग के लगभग 3-5 दिनों के बाद, एक कोबलस्टोन आकृति विज्ञान (चित्रा 2) के साथ केराटिनोसाइट्स को देखा जा सकता है। पहले मार्ग को आयोजित करने से पहले 1-2 सप्ताह की संस्कृति लग जाएगी और कोशिकाओं को दूसरे और तीसरे मार्ग के लिए तैयार होने से पहले बाद के 1-2 सप्ताह आवश्यक हैं। उसके बाद, कोशिकाएं तेजी से बढ़ेंगी और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए तैयार हो सकती हैं। कोशिकाओं को क्रमशः पहले और दूसरे मार्ग में एक अच्छी तरह से (24-अच्छी तरह से प्लेट) और 6-अच्छी तरह से प्लेट पर फिर से चढ़ाया जा सकता है। बाद का मार्ग सेल वृद्धि और घनत्व पर निर्भर करेगा। तीसरे मार्ग के बाद 1: 2 या 1: 3 के सेल विभाजन अनुपात का उपयोग किया जा सकता है।

5. केराटिनोसाइट मार्ग

  1. संस्कृति पकवान से supernatant के 2 मिलीलीटर ले लीजिए और एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब (बर्फ पर) में वितरित करें। बाँझ 1x PBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
    नोट: जब कक्ष लगभग 70% -80% confluency तक पहुँचते हैं, तो वे पारित होने के लिए तैयार होते हैं।
  2. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में पकवान में 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 1 एमएल जोड़ें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें; 5 मिनट के बाद जांचें कि क्या कोशिकाएं पकवान से अलग होती हैं।
  4. ट्रिप्सिन निषेध समाधान के 1 एमएल और पूर्ण संस्कृति माध्यम के 2 एमएल का उपयोग करके प्रतिक्रिया को बेअसर करें + कोमल पिपेटिंग द्वारा चेलेक्स-एफबीएस। इसके बाद, चरण 5.1 के रूप में एक ही 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 x g पर सेल निलंबन centrifuge. एक पिपेट के साथ supernatant aspirate और पूर्ण संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  6. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। अगला, एक नए 24- या 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में सेल निलंबन की प्लेट 1 मिलीलीटर।
    नोट: शुरुआती मार्ग से कुछ कोशिकाओं को 70% पूर्ण संस्कृति माध्यम + 20% चेलेक्स्ड-एफबीएस + 10% डीएमएसओ के मिश्रण में जमे हुए किया जा सकता है। कोशिकाओं के 1-2 क्रायोल को एक confluent संस्कृति प्लेट से एकत्र किया जा सकता है।

6. क्रायोप्रिजर्वेशन और केराटिनोसाइट्स की वसूली

  1. सेल फ्रीजिंग
    1. केराटिनोसाइट्स को 80% -90% confluency तक बढ़ाएं।
      नोट: कोशिकाओं को अधिक वृद्धि करने की अनुमति न दें, क्योंकि यह उनकी प्रसार स्थिति और व्यवहार्यता को कम कर सकता है।
    2. 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ डिश में केराटिनोसाइट्स का इलाज करें, जैसा कि चरण 5.1-5.5 में वर्णित है।
    3. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके केराटिनोसाइट्स की गणना करें। प्रत्येक शीशी के लिए 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के हस्तांतरण के लिए अनुमति देने के लिए परिकलित सेल संख्याओं के आधार पर क्रायोवल तैयार करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 x g पर सेल निलंबन centrifuge. supernatant को त्यागें और 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% पूर्ण संस्कृति माध्यम (पूर्ण माध्यम के 9 mL + chelexed-FBS और DMSO के 1 mL) के 10 mL समाधान में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. प्रति शीशी निलंबन के 1 मिलीलीटर पर क्रायोवियल्स में कोशिकाओं को वितरित करें। शीशियों को क्रायोजेनिक स्टोरेज कंटेनर में रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले दिन शीशियों को एक तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
  2. सेल पुनर्प्राप्ति
    1. तरल नाइट्रोजन टैंक से एक क्रायोवियल निकालें और कमरे के तापमान पर आंशिक रूप से पिघल जाएं। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर को 3 मिलीलीटर पूर्ण संस्कृति माध्यम + चेलेक्स्ड-एफबीएस के साथ मिलाएं।
    2. 100 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant त्यागें और पूर्ण संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend + chelexed-FBS.
    3. प्लेट सेल निलंबन नए 60 मिमी कोलेजन मैं लेपित संस्कृति व्यंजन में. हर 2-3 दिनों में संस्कृति माध्यम को बदलें और एक बार confluent कोशिकाओं को पारित करें।

7. Immunofluorescent धुंधला

  1. 2 दिनों के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेटों (5 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में वर्ग coverslips (22 मिमी x 22 मिमी) पर संस्कृति मौखिक केराटिनोसाइट्स।
  2. 1x PBS के साथ तीन बार धोने से पहले कमरे के तापमान पर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (PFA) और पीबीएस के समाधान में 20 मिनट के लिए केराटिनोसाइट्स को ठीक करें।
  3. PBS में 0.1% Triton के समाधान में कोशिकाओं permeabilize. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध अभिकर्मक (2.5% बकरी सीरम, 2.5% गधा सीरम) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ रात भर की इनक्यूबेशन।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग निम्नलिखित dilutions पर किया गया था: खरगोश विरोधी K14 (1: 1000), चूहा α6-integrin (1: 100), खरगोश विरोधी p63 (1: 500), खरगोश विरोधी K13 (1: 100), और बकरी विरोधी PDGFRα (1: 100).
  4. पीबीएस में 0.1% ट्राइटन के समाधान में नमूनों को धोएं, इसके बाद कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन।
    नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी (एलेक्सा 488 या 555) का उपयोग 1:300 कमजोर पड़ने पर किया गया था।
  5. 10 मिनट के लिए Hoechst समाधान के साथ सभी नमूनों counterstain और कांच स्लाइड पर कोशिकाओं माउंट.
    नोट: Hoechst समाधान कोशिकाओं के नाभिक दाग करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  6. एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूना इमेजिंग प्रदर्शन.
    नोट:: चमक और कंट्रास्ट छवि संपादन सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर समान तीव्रता के लिए समायोजित कर रहे हैं।

Representative Results

विच्छेदन प्रक्रिया और वयस्क माउस तालू से मौखिक केराटिनोसाइट्स के अलगाव का अवलोकन
विघटित मौखिक केराटिनोसाइट्स को वयस्क माउस तालू से एकत्र किया गया था और एक अनुकूलित 20% चेलेक्स्ड-एफबीएस में सुसंस्कृत किया गया था। माउस तालू में कठोर तालु और नरम तालु (चित्रा 1 सी) होते हैं। माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स के अलगाव के लिए प्रक्रिया को चित्र 1 डी में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। तालु ऊतक को विच्छेदित किया जाता है और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.025% ट्रिप्सिन समाधान में इनक्यूबेट होने से पहले एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान वाले मीडिया में स्थानांतरित कर दिया जाता है। अगले दिन, तालु ऊतक को ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान और समान मात्रा में पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ इलाज किया जाता है। इसके बाद, मौखिक केराटिनोसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए एक सर्जिकल स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ऊतकों को स्क्रैप किया जाता है। सेल निलंबन एक 100 μm सेल छलनी और centrifuged के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। कोशिकाओं को तब कोलेजन I-लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेटों में बीजित किया जाता है जिसमें 2 मिलीलीटर पूर्ण संस्कृति माध्यम + चेलेक्स्ड-एफबीएस होता है।

माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स के सफल अलगाव के प्रतिनिधि परिणाम
प्राथमिक मौखिक केराटिनोसाइट्स एक मोनोलेयर के रूप में बढ़े और एक कोबलस्टोन आकृति विज्ञान (चित्रा 2) प्रदर्शित किया। छोटे केराटिनोसाइट उपनिवेश 3-5 दिनों में दिखाई दे रहे थे (चित्रा 2 ए, बी); ये बड़े हो गए और इनक्यूबेशन के 1 सप्ताह में तंग उपनिवेशों का गठन किया (चित्रा 2 सी)। केराटिनोसाइट उपनिवेशों ने बेसल केराटिनोसाइट्स की विशिष्ट रूपात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित किया, जो उनकी स्वस्थ स्थितियों का संकेत देते हैं। मानव मौखिक केराटिनोसाइट्स 0.06 mM Ca2 + 16,28 युक्त पूर्ण संस्कृति माध्यम में कई मार्गों के लिए अविभाजित रहे। पहला मार्ग प्रारंभिक चढ़ाना (चित्रा 2 डी) से लगभग 2 सप्ताह के लिए किया गया था। बाद के मार्गों में, केराटिनोसाइट्स ने संस्कृति की एक छोटी अवधि के साथ स्थिर विकास का प्रदर्शन किया (चित्रा 2ई-जी)। केराटिनोसाइट्स बढ़ना बंद हो गया यदि अलगाव प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण फाइब्रोब्लास्ट संदूषण हुआ (चित्रा 2 एच)।

पृथक माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स बेसल सेल मार्करों को व्यक्त करते हैं
प्राथमिक मौखिक केराटिनोसाइट्स की स्थिति की पुष्टि करने के लिए, इम्युनोस्टेनिंग बेसल सेल मार्करों केराटिन 14 (K14) और α6-integrin34 का उपयोग करके किया गया था। K14 और α6-integrin को कल्चरिंग के बाद केराटिनोसाइट्स में व्यक्त किया गया था (चित्रा 3ए, बी)। कोशिकाओं को उनके स्टेमनेस की पुष्टि करने के लिए स्टेम सेल मार्कर p63 के साथ भी दाग दिया गया था। प्रारंभिक मार्ग (मार्ग 4) और देर से मार्ग (मार्ग 7) कोशिकाओं ने p63 (चित्रा 3C, D) की समान अभिव्यक्ति दिखाई। इसके विपरीत, उच्च कैल्शियम (2 दिनों के लिए 1.2 एमएम प्रेरण) के साथ इलाज किए गए केराटिनोसाइट्स ने पी 63 अभिव्यक्ति (चित्रा 3 ई) में कमी का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि उच्च कैल्शियम उपचार प्राथमिक केराटिनोसाइट्स में स्टेम सेल से संबंधित जीन को दबा देता है जैसा कि पहले बताया गया था। विभेदन मार्कर केराटिन 13 (K13) ने उच्च कैल्शियम उपचार (चित्रा 3 F-H) के तहत प्रारंभिक और देर से मार्ग और महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति दोनों में दुर्लभ या कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखाई। केराटिनोसाइट संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण की संभावना का परीक्षण करने के लिए, फाइब्रोब्लास्ट मार्कर PDGFRα का उपयोग करके धुंधला माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) की तुलना में केराटिनोसाइट्स के एक ही सेट के साथ किया गया था। एमईएफ कोशिकाओं में देखी गई उच्च अभिव्यक्ति की तुलना में केराटिनोसाइट संस्कृति में पीडीजीएफआरα की कोई अभिव्यक्ति नहीं थी (चित्रा 3I-3L)। इन परिणामों ने संकेत दिया कि यह प्रोटोकॉल बेसल केराटिनोसाइट्स को सफलतापूर्वक अलग कर सकता है और इन कोशिकाओं को अविभाजित अवस्था में बनाए रख सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन प्रक्रिया और माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स के अलगाव का अवलोकन। (ए) माउस मौखिक गुहा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) तालु को विच्छेदित करने और माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण। (C) माउस तालु की ब्राइटफील्ड छवि. स्केल बार: 100 μm. (डी) प्रोटोकॉल का सारांश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स के सफल अलगाव के प्रतिनिधि परिणाम। (A-G) अलगाव के बाद 3 दिन (ए), 5 दिन (बी), 1 सप्ताह (सी), और 2 सप्ताह (डी) की संस्कृति में सुसंस्कृत प्राथमिक मौखिक केराटिनोसाइट्स की समय-पाठ्यक्रम छवियां। माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स के आकारिकी पहले (ई), दूसरे (एफ), और तीसरे (जी) मार्ग के बाद दिखाए गए हैं। (एच) माउस मौखिक केराटिनोसाइट संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण का उदाहरण। स्केल बार: 400 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पृथक माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स बेसल सेल मार्करों को व्यक्त करते हैं। (A-B) मार्ग 4 में K14 (ए; लाल) और α6-integrin (बी; हरा) के immunofluorescent धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। (C-E) मार्ग 4 (सी), मार्ग 7 (डी), और उच्च कैल्शियम उपचार (ई) में पी 63 (हरे) के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग की प्रतिनिधि छवियां। (F-H) मार्ग 4 (एफ), मार्ग 7 (जी), और उच्च कैल्शियम उपचार (एच) में K13 (हरे रंग) की immunostaining छवियों। (I-L) PDGFRα (लाल) की immunostaining छवियों के मार्ग 4 (I), मार्ग 7 (जे), उच्च कैल्शियम उपचार (कश्मीर), और MEFs (एल) में. नाभिक Hoechst (नीले) के साथ दाग कर रहे हैं। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

मानव या माउस त्वचा एपिडर्मिस से अलग किए गए प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों में कई वर्षों से किया गया है12,13,15,18,27,28,29। इसके विपरीत, वयस्क चूहों 30,31,32 से प्राथमिक मौखिक केराटिनोसाइट्स को अलग करने और संस्कृति करने के लिए कुछ प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं। वर्तमान अध्ययन ने एक प्रोलिफेरेटिव या स्टेम सेल जैसी स्थिति में केराटिनोसाइट्स को बनाए रखने के लिए एक वाणिज्यिक पूर्ण संस्कृति माध्यम और चेलेक्स्ड-एफबीएस का उपयोग किया। इस संस्कृति प्रणाली को मौखिक उपकला स्टेम कोशिकाओं और उनके संबंधित रोगों की विशेषताओं को समझने के लिए आणविक और जैव रासायनिक assays में नियोजित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। सबसे पहले, ट्रिप्सिन एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय बाद की संस्कृतियों के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं के उत्पादन में आवश्यक हैं। हमने लगातार कमरे के तापमान पर कक्ष हुड में 0.025% ट्रिप्सिन समाधान और 16 ज इनक्यूबेशन अवधि का उपयोग किया। यदि पर्याप्त समय के लिए ऊष्मायन नहीं किया जाता है, तो केराटिनोसाइट्स ऊतक से ठीक से अलग नहीं होंगे, जिसके परिणामस्वरूप कम अंतिम सेल उपज होगी। दूसरे, दूसरे दिन सेल निलंबन की कोमल पिपेटिंग विशेष रूप से सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करती है। स्क्रैपिंग को धीरे-धीरे उपकला पक्ष से शुरू करना चाहिए और प्रति ऊतक नमूने के 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। अंत में, पहले पृथक सेल निलंबन में फाइब्रोब्लास्ट और अन्य सेल प्रकार होते हैं; ये अवांछित कोशिकाएं आमतौर पर बाद की संस्कृतियों में गायब होना शुरू हो जाएंगी।

सेल अलगाव और संस्कृति के दौरान संभावित सीमाओं की पहचान की गई थी। दुर्लभ मामलों में, अलगाव प्रक्रिया के दौरान फाइब्रोब्लास्ट दूषित हो सकते हैं, और फाइब्रोब्लास्ट बाद के मार्गों में केराटिनोसाइट्स के विकास को रोक सकते हैं (चित्रा 2 एच)। एक वाणिज्यिक माध्यम का चयन करना आवश्यक है जिसमें संस्कृति में इस तरह के संदूषण को खत्म करने के लिए एक फाइब्रोब्लास्ट विकास अवरोधक होता है। क्योंकि माउस तालु और अन्य मौखिक म्यूकोसा में अपेक्षाकृत छोटे आकार होते हैं, इसलिए एक माउस से प्रारंभिक सेल उपज कम हो सकती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल की पूरी संस्कृति अवधि- जब तक क्रायोप्रिजर्वेशन चरण-प्राथमिक त्वचा केराटिनोसाइट्स की तुलना में अधिक है। अलग मौखिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग 10 मार्गों के भीतर सबसे अच्छा किया जाता है, क्योंकि अधिक विस्तारित संस्कृति अवधि सेल गुणों को बदल सकती है और स्टेम कोशिकाओं की संख्या को कम कर सकती है।

वर्तमान विधि से पता चला है कि माउस मौखिक केराटिनोसाइट्स ने एक कसकर पैक, कोबलस्टोन आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और प्रोलिफेरेटिव परिस्थितियों में मोनोलेयर कॉलोनियों का गठन किया। उन्होंने बेसल मार्करों α6-integrin, K14, और स्टेम सेल मार्कर p63 की उच्च अभिव्यक्ति भी दिखाई। भविष्य के अध्ययनों में, इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के अलावा, आरएनए-अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग मौखिक केराटिनोसाइट्स की सेलुलर विषमता और शुद्धता को सत्यापित करने के लिए किया जाएगा, जो इन कोशिकाओं की प्रकृति की हमारी समझ को और बढ़ाएगा।

2-3 मार्गों के बाद, मौखिक केराटिनोसाइट्स आगे के कार्यात्मक प्रयोगों में उपयोग करने के लिए पर्याप्त स्थिर थे। महत्वपूर्ण रूप से, इस संस्कृति प्रोटोकॉल को ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के साथ जोड़ा जा सकता है, जिसमें जीन नॉकआउट, क्रे-लोक्सपी और टेट-इनड्यूसिबल सिस्टम शामिल हैं, और इसका उपयोग सेलुलर और आणविक assays में भी किया जा सकता है। इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को एक मौलिक और कुशल विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग मौखिक केराटिनोसाइट स्टेम सेल जीव विज्ञान को आगे समझने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (20H03266) (एएस के लिए), प्रारंभिक कैरियर वैज्ञानिकों (18K14709) (ए.एस.) के लिए अनुदान-इन-एड, अनुदान संख्या JP21gm6110016 और 21bm0704067 (ए.एस. के लिए) के तहत AMED द्वारा समर्थित किया गया था, और टेकेडा साइंस फाउंडेशन (ए.एस. के लिए) से अनुसंधान अनुदान। हम कुमामोटो विश्वविद्यालय में पशु संसाधन और विकास के लिए केंद्र और उनकी उत्कृष्ट माउस देखभाल के लिए त्सुकुबा विश्वविद्यालय में पशु संसाधन केंद्र को धन्यवाद देते हैं। हम confocal इमेजिंग में अपने समर्थन के लिए Kumamoto University में IRCMS कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.025% Trypsin/EDTA Gibco R001100
0.05% Trypsin/EDTA, phenol red Gibco 25300062
0.4w/v% Trypan Blue solution Wako 207-17081
10 mL Serological pipet Falcon 357551
100 µm Nylon cell strainer Falcon 352360
15 mL sterile conical tube Falcon 352096
2 mL Aspirating pipet Falcon 357558
35 mm Cell culture dish Corning 353801
50 mL sterile conical tube Falcon 352070
60 mm Cell culture dish Corning 353802
6-well Tissue Culture plate Falcon 353046
96 Well Culture plate (U bottom) Falcon 353077
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
Biocoat Collagen I cellware 60mm dish Corning 356401
Blunt Forceps AS ONE 1-8187-03
Butorphanol Meiji Seika Pharma Vetorphale
CoolCell LX Corning 432002 Cryogenic storage
Cotton AS ONE 63-1452-97
Cover slips 22 x 22 μm square Matsunami Glass Ind. C022221
Cryogenic Vial 1.2 mL Thermo Scientific 5000-0012
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R007100
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855-100ML
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 Invitrogen A31572
Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A21208
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663-10ML
EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) Gibco S0120
EpiLife, with 60 µM calcium Gibco MEPI500CA
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079
Fine forceps BRC Bio Research Center PRI13-3374
Goat anti-PDGF Receptor α R&D Systems AF1062
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10ML
Half-curved forceps BRC Bio Research Center PRI13-3376
Hemocytometer Hirschmann Laborgeräte 8100204
Hoechst Sigma-Aldrich B2261
Iris Scissors Muromachi Kikai 14090-09
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Domitor
Midazolam Astellas Pharma Dormicum
No.15 Disposable scalpel Feather 219AABZX00136000
Paraformaldehyde Wako 162-16065
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 Gibco 10010049
Povidone-iodine Y's Square 872612
Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody Abcam ab92551
Rabbit anti-K14 BioLegend 905301
Rabbit anti-p63 antibody Abcam ab124762
Raspatorium #14 AS ONE 8-4599-01
Rat α6-integrin BD Biosciences 553745
Triton X-100 Wako 581-81705
Type I Collagen coated 24-well plate Corning 354408
Type I Collagen coated 60mm dish Corning 356401
Type I Collagen coated 6-well plate Corning 355400

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References

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Xuan Ngo, Y., Haga, K., Suzuki, A., Kato, H., Yanagisawa, H., Izumi, K., Sada, A. Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate. J. Vis. Exp. (175), e62820, doi:10.3791/62820 (2021).

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