Summary
El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de queratinocitos orales derivados del paladar del ratón adulto. También se informa de un método de evaluación mediante inmunotinción.
Abstract
Durante años, la mayoría de los estudios que involucran queratinocitos se han realizado utilizando queratinocitos epidérmicos de piel humana y de ratón. Recientemente, los queratinocitos orales han atraído la atención debido a su función y características únicas. Mantienen la homeostasis del epitelio oral y sirven como recursos para aplicaciones en terapias regenerativas. Sin embargo, los estudios in vitro que utilizan queratinocitos primarios orales de ratones adultos han sido limitados debido a la falta de un protocolo de cultivo eficiente y bien establecido. Aquí, los queratinocitos primarios orales se aislaron de los tejidos del paladar de ratones adultos y se cultivaron en un medio comercial bajo en calcio suplementado con un suero queloexado. En estas condiciones, los queratinocitos se mantuvieron en un estado proliferativo o similar al de las células madre, y su diferenciación se inhibió incluso después del aumento de los pasajes. El análisis de la expresión de marcadores mostró que los queratinocitos orales cultivados expresaron los marcadores de células basales p63, K14 y α6-integrina y fueron negativos para el marcador de diferenciación K13 y el marcador de fibroblastos PDGFRα. Este método produjo células viables y cultivables adecuadas para aplicaciones posteriores en el estudio de las funciones de las células madre epiteliales orales in vitro.
Introduction
El epitelio oral sirve como primera barrera para proteger al cuerpo de las tensiones ambientales, incluidos los daños químicos o físicos y las infecciones bacterianas y virales1,2. La mucosa oral comprende una capa externa de epitelio escamoso estratificado que consiste en queratinocitos y tejido conectivo subyacente llamado lámina propia, que consiste principalmente en fibroblastos y la matriz extracelular. La mucosa oral del ratón se puede dividir ampliamente en tres subtipos: mucosa masticatoria (paladar duro y encía), especializada (lengua dorsal) y de revestimiento (mucosa bucal, lengua ventral, paladar blando, labios)2,3 (Figura 1A). El epitelio oral es queratinizado en la mucosa masticatoria y especializada y no queratinizado en la mucosa de revestimiento. A pesar de su ubicación anatómica, el epitelio oral es similar a la epidermis de la piel en que consiste en células epiteliales apretadas con diversos grados de diferenciación: capas basales que contienen células indiferenciadas; capas espinosas, granulares y cornificadas que forman epitelio queratinizado, o capas intermedias y superficiales que forman epitelio no queratinizado4. Los modelos de ratón transgénico han facilitado el estudio de las características celulares y moleculares de las células madre epiteliales orales en el paladar, la mucosa bucal, la lengua y la encía5,6,7,8,9,10,11. Sin embargo, la mayoría de estos estudios utilizaron principalmente experimentos con ratones in vivo. Los sistemas de cultivo celular no se empleaban típicamente debido a la falta de protocolos establecidos y eficientes.
Se puede utilizar un sistema de cultivo in vitro para el análisis molecular y bioquímico de reguladores de células madre, ensayos basados en células y detección de fármacos. Actualmente, se han desarrollado protocolos para el cultivo de queratinocitos primarios de la epidermis cutánea, en los que los queratinocitos basales pueden ser aislados y cultivados con éxito con fines clínicos y de investigación12,13,14,15. En 1980, Hennings et al. demostraron que una baja concentración de calcio (< 0,09 mM Ca2+) en el medio de cultivo facilitaba la proliferación y mantenía las células en un estado indiferenciado. Un mayor nivel de calcio promovió la diferenciación celular y redujo la proliferación16. Posteriormente, se han establecido metodologías de cultivo para queratinocitos epidérmicos murinos neonatales y adultos y se han aplicado ampliamente a numerosos modelos de ratón con diferentes antecedentes genéticos para estudios in vitro17,18,19. Aunque la piel y los epitelios orales comparten características comunes, también muestran diferencias intrínsecas, por ejemplo, en su estado de queratinización, tasa de renovación, expresión génica y capacidad de cicatrización de heridas3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Aunque el cultivo oral de queratinocitos humanos se ha realizado con éxito27,28,29, las publicaciones sobre el cultivo de queratinocitos orales en ratones30,31,32 son limitadas debido al pequeño tamaño del tejido diana y a las características distintivas de las células en comparación con los queratinocitos epidérmicos cutáneos. Este protocolo describe las técnicas de aislamiento y cultivo a largo plazo de queratinocitos orales primarios de ratón.
Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Experimentación con Animales de la Universidad de Kumamoto y la Universidad de Tsukuba.
1. Preparación de reactivos y medios de cultivo
- Preparar 40 ml de medio de cultivo de queratinocitos que contenga 60 μM de calcio y 600 μL de solución antibiótico-antimicótica. Preparar 20 ml de tripsina al 0,025% y 400 μL de solución antibiótico-antimicótica.
- Descongele la solución de inhibición de tripsina a temperatura ambiente y manténgala a 4 °C hasta su uso en el paso 4.1.
NOTA: El reactivo de aislamiento está preparado para el aislamiento tisular de cinco ratones.
- Descongele la solución de inhibición de tripsina a temperatura ambiente y manténgala a 4 °C hasta su uso en el paso 4.1.
- Para preparar el medio de cultivo, tome 500 ml de medio y agregue 5 ml de una solución de suplemento de crecimiento (consulte la Tabla de materiales) (en adelante, medio completo) y suero bovino quelexo fetal (FBS) con 20% de calcio agotado(FBS)33 (en adelante, chelexed-FBS).
2. Disección del tejido del paladar del ratón adulto
- Sacrificar un ratón adulto C57BL / 6J (ya sea macho o hembra) por luxación cervical de conformidad con las regulaciones de la instalación relacionadas con el bienestar animal.
- Retire el vello alrededor de la boca con una afeitadora. Usando tijeras, corte desde la mejilla hacia la mandíbula, en ambos lados.
NOTA: El ratón necesita ser anestesiado antes del sacrificio. Se utiliza una mezcla anestésica de medetomidina, midazolam y butorfanol (ver Tabla de Materiales).
- Retire el vello alrededor de la boca con una afeitadora. Usando tijeras, corte desde la mejilla hacia la mandíbula, en ambos lados.
- Use fórceps para abrir la boca de par en par y absorber la sangre con un hisopo de algodón. Para desinfectar el paladar, limpie el interior de la boca con un hisopo de algodón que contenga 10% de povidona yodada.
- Para cosechar el paladar del ratón, primero, use una cuchilla de bisturí quirúrgica para hacer una incisión marginal de espesor completo a lo largo del lado del paladar de los dientes maxilares. Luego, diseccione cuidadosamente todo el paladar usando un raspatorium.
NOTA: Un raspatorium es una herramienta utilizada para elevar un colgajo mucoperiosteal (ver Tabla de Materiales) (Figura 1B). - Transfiera rápidamente el tejido del paladar a un tubo de 15 ml que contenga 4 ml de medio completo + solución antibiótico-antimicótica. Mantenga los tejidos en hielo hasta que estén listos para la incubación.
NOTA: Para la recolección de múltiples ratones, los tejidos del paladar pueden mantenerse en hielo hasta 4 h.
3. Pretratamiento del tejido del paladar
- En una campana de flujo laminar, transfiera los tejidos a un plato de 60 mm que contenga 4 ml de solución completa de medio + antibiótico-antimicótico.
- Usando fórceps cortos y contundentes y una cuchilla de bisturí, retire suavemente la sangre de los tejidos. Lave los pañuelos 10 veces en medio completo.
- Transfiera los tejidos a un plato de 35 mm que contenga 4 ml de tripsina al 0,025% + solución antibiótico-antimicótica, con la superficie epitelial hacia abajo.
NOTA: La superficie epitelial, que se curva hacia adentro, debe empaparse en la solución de tripsina; la lámina propia debe estar boca arriba. El tejido debe aplanarse tanto como sea posible para incubarse completamente en la solución de tripsina. - Incubar los tejidos en tripsina al 0,025% durante ~16 h a temperatura ambiente en la campana de cultivo.
4. Recolección y cultivo de células primarias
- Usando un par de fórceps contundentes, retire el tejido de la solución de tripsina (en el plato de 35 mm) y transfiéralo a la solución inhibidora de tripsina en un plato de 60 mm (4 ml por plato) con la superficie epitelial hacia arriba.
- Usando fórceps para sujetarse al borde del paladar, raspe suavemente la capa epitelial de la lámina propia subyacente con una cuchilla de bisturí.
NOTA: El tejido conectivo no es digerido por la tripsina, por lo que no se desprende durante el raspado. - Para recolectar la cantidad máxima de células epiteliales de los tejidos, transfiera el tejido a otro plato de 60 mm con 4 ml de medio completo y repita el paso de raspado.
NOTA: Asegúrese de evitar raspar el tejido con la punta de la cuchilla; en su lugar, utilice el borde de la hoja. El raspado se realiza durante 5-10 minutos por tejido. - Coloque un colador de células estéril de 100 μm en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml.
- Usando una pipeta estéril, transfiera 2 ml de solución de tripsina (a partir del paso 4.1) al colador para humedecer su superficie.
- Usando una pipeta, mezcle la suspensión celular en el plato de 60 mm (de los pasos 4.2-4.3) varias veces y filtre las celdas a través del colador de células de 100 μm preparado en los pasos 4.4-4.5.
- Cuente el número de células usando un hemocitómetro. Preparar 15 μL de solución de azul de tripano y añadir 15 μL de suspensión celular (paso 4.6). Transfiera 10 μL de la mezcla de azul célula-tripano a un hemocitómetro y cuente el número de células.
NOTA: Una pieza de paladar de ratón puede producir hasta 1 millón de células. - Mientras cuenta, centrifugue el tubo (a partir del paso 4.6) a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspira el sobrenadante con una pipeta. Añadir 2 mL de medio completo + chelexed-FBS al tubo. Resuspend el pellet celular triturando varias veces usando una pipeta de 5 mL.
- Placa 2-5 x 105 células de un ratón en un pozo de una placa de 24 pocillos pre-recubierta con colágeno tipo I (ver Tabla de materiales).
- Incubar las células a 37 °C durante 2 días sin cambiar el medio.
- Dos días después de la siembra, reemplace la mitad del medio de cultivo con el medio completo + chelexed-FBS. Compruebe la morfología celular bajo el microscopio. Células de alimentación con medio completo + chelexed-FBS cada 2 días.
NOTA: Después de la siembra, se observarán células de diferentes tamaños. Aproximadamente 3-5 días después de la siembra, se pueden observar queratinocitos con una morfología de adoquín (Figura 2). Tomará 1-2 semanas de cultivo antes de que se pueda realizar el primer pasaje y se necesitarán 1-2 semanas posteriores antes de que las células estén listas para el segundo y tercer pasaje. Después de eso, las células crecerán más rápido y pueden estar preparadas para la criopreservación. Las células se pueden volver a enchapar a un pozo (de una placa de 24 pocillos) y una placa de 6 pocillos en el primer y segundo pasaje, respectivamente. El paso posterior dependerá del crecimiento y la densidad celular. Se puede usar una relación de división de celdas de 1: 2 o 1: 3 después del tercer pasaje.
5. Paso de queratinocitos
- Recoger 2 ml del sobrenadante del plato de cultivo y dispensar en un tubo cónico de 15 ml (sobre hielo). Lave las células con 1x PBS estéril dos veces.
NOTA: Cuando las células alcanzan aproximadamente el 70% -80% de confluencia, están listas para el paso. - Agregue 1 ml de tripsina-EDTA al 0.05% al plato al pozo de un plato de 6 pocillos.
- Incubar durante 5-15 min a 37 °C; compruebe después de 5 minutos si las células se desprenden del plato.
- Neutralizar la reacción utilizando 1 mL de solución de inhibición de tripsina y 2 mL de medio de cultivo completo + chelexed-FBS mediante pipeteo suave. A continuación, transfiera la suspensión celular al mismo tubo cónico de 15 ml que en el paso 5.1.
- Centrifugar la suspensión celular a 100 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y resuspendir el pellet celular en 1 mL de medio de cultivo completo.
- Cuente las células usando un hemocitómetro. A continuación, coloque 1 ml de la suspensión celular en una nueva placa de cultivo de 24 o 6 pocillos.
NOTA: Algunas de las células de los primeros pasajes se pueden congelar en una mezcla de 70% de medio de cultivo completo + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. Se pueden recolectar 1-2 crioviales de células de una placa de cultivo confluente.
6. Criopreservación y recuperación de queratinocitos
- Congelación celular
- Cultivar queratinocitos a 80% -90% de confluencia.
NOTA: No permita que las células crezcan en exceso, ya que esto podría reducir su estado de proliferación y viabilidad. - Trate los queratinocitos en el plato con tripsina-EDTA al 0,05%, como se describe en los pasos 5.1-5.5.
- Cuente los queratinocitos usando un hemocitómetro. Preparar crioviales basados en números de células calculados para permitir la transferencia de 1 x 106 células/ml a cada vial.
- Centrifugar la suspensión celular a 100 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en una solución de 10 mL de DMSO al 10% + 20% chelexed-FBS + 70% de medio de cultivo completo (9 mL de medio completo + chelexed-FBS y 1 mL de DMSO).
- Dispensar las células en crioviales a 1 ml de suspensión por vial. Coloque los viales en un recipiente de almacenamiento criogénico durante la noche a -80 °C. Transfiera los viales a un tanque de nitrógeno líquido al día siguiente.
- Cultivar queratinocitos a 80% -90% de confluencia.
- Recuperación celular
- Retire un criovial del tanque de nitrógeno líquido y descongele parcialmente a temperatura ambiente. En un tubo de 15 ml, mezcle 1 ml de la suspensión celular con 3 ml de medio de cultivo completo + chelexed-FBS.
- Centrifugar la mezcla durante 5 min a 100 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 1 mL de medio de cultivo completo + chelexed-FBS.
- Coloque las suspensiones celulares en nuevos platos de cultivo recubiertos de colágeno I de 60 mm. Reemplace el medio de cultivo cada 2-3 días y pase las células una vez confluidas.
7. Tinción inmunofluorescente
- Cultive queratinocitos orales en hojas cuadradas (22 mm x 22 mm) en placas de 6 pocillos (5 x 105 células/pocillo) durante 2 días.
- Fije los queratinocitos en una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) y PBS durante 20 min a temperatura ambiente antes de lavar tres veces con 1x PBS.
- Permeabilizar las células en una solución de Tritón al 0,1% en PBS. Incubar células en reactivo bloqueador (2,5% suero de cabra, 2,5% de suero de burro) durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de incubación durante la noche con anticuerpos primarios (ver Tabla de Materiales) a 4 °C.
NOTA: Se utilizaron anticuerpos primarios en las siguientes diluciones: conejo anti-K14 (1:1000), α6-integrina de rata (1:100), conejo anti-p63 (1:500), conejo anti-K13 (1:100) y anti-PDGFRα de cabra (1:100). - Lavar las muestras en una solución de Tritón al 0,1% en PBS, seguido de incubación con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Los anticuerpos secundarios (Alexa 488 o 555) se utilizaron en una dilución de 1:300. - Contramante todas las muestras con la solución Hoechst durante 10 minutos y monte celdas en portaobjetos de vidrio.
NOTA: La solución de Hoechst se utiliza para teñir los núcleos de las células. - Realice imágenes de muestra utilizando un microscopio confocal.
NOTA: El brillo y el contraste se ajustan a la misma intensidad utilizando el software de edición de imágenes.
Representative Results
Descripción general del proceso de disección y aislamiento de queratinocitos orales del paladar del ratón adulto
Los queratinocitos orales disociados se recolectaron del paladar del ratón adulto y se cultivaron en un FBS chelexed-FBS personalizado al 20%. El paladar del ratón consiste en el paladar duro y el paladar blando (Figura 1C). El procedimiento para el aislamiento de queratinocitos orales de ratón se resume en la Figura 1D. El tejido del paladar se disecciona y se transfiere a un medio que contiene una solución antibiótica-antimicótica antes de incubarse en una solución de tripsina al 0,025% a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, el tejido del paladar se trata con solución inhibidora de tripsina y medio de cultivo completo en volúmenes iguales. Posteriormente, los tejidos se raspan utilizando una cuchilla de bisturí quirúrgica para recolectar queratinocitos orales. La suspensión celular se filtra a través de un colador celular de 100 μm y se centrifuga. Las células se siembran en placas de 24 pocillos recubiertas de colágeno I que contienen 2 ml de medio de cultivo completo + chelexed-FBS.
Resultados representativos del aislamiento exitoso de queratinocitos orales de ratón
Los queratinocitos orales primarios crecieron como una monocapa y mostraron una morfología de adoquines (Figura 2). Pequeñas colonias de queratinocitos fueron visibles a los 3-5 días (Figura 2A,B); estos crecieron más grandes y formaron colonias apretadas a la 1 semana de incubación (Figura 2C). Las colonias de queratinocitos mostraron las características morfológicas típicas de los queratinocitos basales, lo que indica sus condiciones saludables. Los queratinocitos orales humanos permanecieron indiferenciados durante varios pasajes en el medio de cultivo completo que contenía 0,06 mM Ca2+16,28. El primer pasaje se realizó aproximadamente 2 semanas desde el emplatado inicial (Figura 2D). En pasajes posteriores, los queratinocitos exhibieron un crecimiento estable con un período de cultivo más corto (Figura 2E-G). Los queratinocitos dejaron de crecer si se produjo una contaminación significativa de fibroblastos durante el proceso de aislamiento (Figura 2H).
Queratinocitos orales aislados de ratón expresan marcadores de células basales
Para confirmar el estado de los queratinocitos orales primarios, se realizó inmunotinción utilizando los marcadores de células basales Keratin 14 (K14) y α6-integrin34. K14 y α6-integrina se expresaron en queratinocitos después del cultivo (Figura 3A,B). Las células también se tiñeron con el marcador de células madre p63 para confirmar su tallo. Las células de paso temprano (pasaje 4) y pasaje tardío (pasaje 7) mostraron una expresión uniforme de p63 (Figura 3C, D). Por el contrario, los queratinocitos tratados con alto contenido de calcio (inducción de 1,2 mM durante 2 días) mostraron una disminución de la expresión de p63 (Figura 3E), lo que indica que el tratamiento con alto contenido de calcio suprime los genes relacionados con las células madre en los queratinocitos primarios como se informó anteriormente16. El marcador de diferenciación Queratina 13 (K13) mostró una expresión rara o nula en los pasajes tempranos y tardíos y una expresión significativa bajo tratamiento con alto contenido de calcio (Figura 3F-H). Para probar la posibilidad de contaminación por fibroblastos en el cultivo de queratinocitos, se realizó la tinción utilizando el marcador de fibroblastos PDGFRα con el mismo conjunto de queratinocitos en comparación con los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). No hubo expresión de PDGFRα en el cultivo de queratinocitos, en comparación con la alta expresión observada en células MEF (Figura 3I-3L). Estos resultados indicaron que este protocolo podría aislar con éxito los queratinocitos basales y mantener estas células en el estado indiferenciado.
Figura 1: Descripción general del procedimiento de disección y aislamiento de queratinocitos orales de ratón. (A) Representación esquemática de la cavidad oral del ratón. (B) Instrumentos utilizados para diseccionar el paladar y aislar queratinocitos orales de ratón. (C) Imagen de campo brillante del paladar del ratón. Barra de escala: 100 μm. (D) Resumen del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos del aislamiento exitoso de queratinocitos orales de ratón. (A-G) Imágenes de curso temporal de queratinocitos orales primarios cultivados a los 3 días (A), 5 días (B), 1 semana (C) y 2 semanas (D) de cultivo después del aislamiento. Se muestran las morfologías de los queratinocitos orales de ratón después de los pasajes primero (E), segundo (F) y tercero (G). (H) Ejemplo de contaminación por fibroblastos en cultivo oral de queratinocitos de ratón. Barra de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Queratinocitos orales aislados de ratón expresan marcadores de células basales. (A-B) Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente de K14 (A; rojo) y α6-integrina (B; verde) en el pasaje 4. (C-E) Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente de p63 (verde) en el pasaje 4 (C), el pasaje 7 (D) y el tratamiento con alto contenido de calcio (E). (F-H) Imágenes inmunotintivas de K13 (verde) en el pasaje 4 (F), el pasaje 7 (G) y el tratamiento con alto contenido de calcio (H). (I-L) Imágenes inmunotintivas de PDGFRα (rojo) en los pasajes 4 (I), 7 (J), tratamiento con alto contenido de calcio (K) y MEFs (L). Los núcleos se tiñen con Hoechst (azul). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los queratinocitos primarios aislados de la epidermis de la piel humana o de ratón se han utilizado durante muchos años en investigaciones y aplicaciones clínicas12,13,15,18,27,28,29. Por el contrario, se han establecido pocos protocolos para aislar y cultivar queratinocitos orales primarios de ratones adultos30,31,32. El presente estudio utilizó un medio de cultivo comercial completo y chelexed-FBS para mantener los queratinocitos en un estado proliferativo o similar al de las células madre. Este sistema de cultivo se puede emplear en ensayos moleculares y bioquímicos para comprender mejor las características de las células madre epiteliales orales y sus enfermedades relacionadas.
Varios pasos críticos están incluidos en este protocolo. En primer lugar, la concentración de tripsina y el tiempo de incubación son esenciales para producir células viables para cultivos posteriores. Utilizamos consistentemente soluciones de tripsina al 0,025% y períodos de incubación de 16 h en la campana de la cámara a temperatura ambiente. Si no se incuban durante un período de tiempo suficiente, los queratinocitos no se disociarían adecuadamente del tejido, lo que resultaría en un menor rendimiento celular final. En segundo lugar, el pipeteo suave de la suspensión celular en el segundo día afecta notablemente la viabilidad celular. El raspado debe comenzar suavemente desde el lado epitelial y no exceder los 10 minutos por muestra de tejido. Finalmente, la primera suspensión celular aislada contiene fibroblastos y otros tipos de células; estas células no deseadas generalmente comenzarán a desaparecer en cultivos posteriores.
Se identificaron limitaciones potenciales durante el aislamiento y cultivo celular. En casos raros, los fibroblastos pueden estar contaminados durante el proceso de aislamiento, y los fibroblastos pueden inhibir el crecimiento de queratinocitos en pasajes posteriores (Figura 2H). Es necesario seleccionar un medio comercial que contenga un inhibidor del crecimiento de fibroblastos para eliminar dicha contaminación en el cultivo. Debido a que el paladar del ratón y otras mucosas orales tienen tamaños relativamente pequeños, el rendimiento celular inicial de un ratón puede ser bajo. Por lo tanto, todo el período de cultivo de este protocolo, hasta la etapa de criopreservación, es más largo que el de los queratinocitos primarios de la piel. Los queratinocitos orales aislados se utilizan mejor dentro de 10 pasajes, ya que períodos de cultivo más prolongados podrían cambiar las propiedades celulares y reducir el número de células madre.
El método actual mostró que los queratinocitos orales de ratón exhibieron una morfología de adoquines apretado y formaron colonias monocapa en condiciones proliferativas. También mostraron una alta expresión de los marcadores basales α6-integrina, K14 y el marcador de células madre p63. En estudios futuros, además de la tinción por inmunofluorescencia, la secuenciación de ARN, la RT-PCR y los análisis de western blot se utilizarán para verificar la heterogeneidad celular y la pureza de los queratinocitos orales, lo que mejorará aún más nuestra comprensión de la naturaleza de estas células.
Después de 2-3 pasajes, los queratinocitos orales fueron lo suficientemente estables como para ser utilizados en experimentos funcionales adicionales. Es importante destacar que este protocolo de cultivo se puede combinar con líneas de ratones transgénicos, incluidos los sistemas knockout de genes, Cre-loxP y tet-inducibles, y también se puede usar en ensayos celulares y moleculares. Por lo tanto, el presente protocolo proporciona a los investigadores un método fundamental y eficiente que podría usarse para comprender mejor la biología de las células madre de queratinocitos orales.
Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Subvención en Ayuda para la Investigación Científica (B) (20H03266) (a A.S.), La Subvención en Ayuda para Científicos de Carrera Temprana (18K14709) (a A.S.), AMED bajo el número de subvención JP21gm6110016 y 21bm0704067 (a A.S.), y becas de investigación de la Fundación de Ciencias De Takeda (a A.S.). Agradecemos al Centro de Recursos y Desarrollo Animal de la Universidad de Kumamoto y al Centro de Recursos Animales de la Universidad de Tsukuba por su excelente cuidado del ratón. Agradecemos a las instalaciones centrales de IRCMS en la Universidad de Kumamoto por su apoyo en imágenes confocales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
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