Summary
본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.
Abstract
수년 동안, 각질 세포와 관련 된 대부분의 연구는 인간과 마우스 피부 표피 각질 각질 세포를 사용 하 여 실시 되었습니다. 최근에는 구강 각질 세포가 독특한 기능과 특성때문에 주목을 받고 있습니다. 그(것)들은 경구 상피의 항상성을 유지하고 재생 치료에 있는 신청을 위한 자원으로 봉사합니다. 그러나, 성인 마우스에서 경구 1차 각질 세포를 사용하는 체외 연구에서는 효율적이고 잘 확립된 배양 프로토콜의 부족으로 인해 제한되었다. 여기서, 경구 원발성 각질세포는 성인 마우스의 구개 조직에서 분리되고, 첼렉스 세럼으로 보충된 상업적인 저칼슘 배지에서 배양되었다. 이러한 조건하에서, 각질세포는 증식 또는 줄기 세포 같이 상태에서 유지되었고, 그들의 분화는 증가한 통로 후에도 억제되었다. 마커 발현 분석은 배양된 경구 각질 세포 마커 p63, K14 및 α6-integrin을 발현하고 분화 마커 K13 및 섬유아세포 마커 PDGFRα에 대해 부정적이었다는 것을 보여주었다. 이 방법은 시험관내 경구 상피 줄기 세포 기능 연구에서 다운스트림 응용 분야에 적합한 실행 가능한 컬터성 세포를 생산하였다.
Introduction
경구 상피는 화학적 또는 물리적 손상 및 세균 및 바이러스 감염을 포함한 환경 스트레스로부터 신체를 보호하는 첫 번째 장벽역할을합니다1,2. 경구 점막은 주로 섬유아세포와 세포외 매트릭스로 구성된 라미나 프로프리아(lamina propria)라고 불리는 각질 세포및 기본 결합 조직으로 구성된 계층화된 편평상피의 외부 층을 포함한다. 마우스 구강 점막은 3가지 아유형으로 광범위하게 나눌 수 있다: 매스틱(단단한 입맛 과 치지바), 전문(등쪽 혀), 및 안감(부칼 점막, 복부 혀, 부드러운 입맛, 입술) 점막2,3(도 1A). 경구 상피는 매스틱 및 전문 점막에서 각질화되고 안감 점막에서 비 각질화된다. 그것의 해부학적 위치에도 불구하고, 경구 상피는 차별화의 다양한 정도를 가진 단단히 포장 된 상피 세포로 구성되어 있다는 점에서 피부 표피와 유사하다 : 미분화 세포를 포함하는 기저 층; 각질화 된 상피, 또는 비 각질화 된 상피를 형성하는 중간 및 피상층을 형성하는 가시, 세분화 된 및 옥수수 화 층4. 형질전환 마우스 모델은 구취, 부칼 점막, 혀 및 치그기바5,6,7,8,9,10,11에서 구강 상피 줄기 세포의 세포 및 분자 특징의 연구를 촉진했다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 주로 생체 내 마우스 실험에 사용. 세포 배양 시스템은 확립되고 효율적인 프로토콜의 부족으로 인해 일반적으로 사용되지 않았습니다.
체외 배양 시스템은 줄기 세포 조절기, 세포 기반 분석 및 약물 스크리닝의 분자 및 생화학 적 분석에 사용될 수 있습니다. 현재, 피부 표피의 1 차각 세포배양에 대한 프로토콜이 개발되었으며, 기저 각질 세포는 임상 및 연구 목적을 위해 성공적으로 분리되고 배양 될 수 있습니다12,13,14,15. 1980년, 헤닝스 외는 배양 배지에서 낮은 칼슘 농도(< 0.09mM Ca2+)가 미분화 상태에서 증식 및 유지세포를 용이하게 하는 것으로 나타났다. 칼슘의 높은 수준은 세포 분화를 촉진하고 감소 된 증식16. 그 후, 신생아및 성인 뮤린 표피 각질 세포에 대한 배양 방법론이 확립되어 시험관 내 연구를 위한 다른 유전적 배경을 가진 수많은 마우스 모델에 널리 적용되었다17,18,19. 피부와 구강 상피는 일반적인 특성을 공유하지만, 그들은 또한 각질화 상태, 이직률, 유전자 발현 및 상처 치유 능력3,11,20,21,22,22,24,25,26에서 본질적인 차이를 보여줍니다.
인간의 구강 각질 세포 배양이 성공적으로 수행되었지만 27,28,29, 마우스 구강 각질 세포 배양에 대한 간행물30,31,32는 피부 표피 각질 세포에 비해 표적 조직의 작은 크기와 세포의 뚜렷한 특성으로 인해 제한된다. 이 프로토콜은 마우스 기본 구강 각질 세포의 격리 및 장기 배양 기법을 설명합니다.
Protocol
모든 동물 실험은 구마모토 대학과 츠쿠바 대학의 기관 동물 실험 위원회 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 시약 및 문화 매체 의 준비
- 칼슘 60 μM 및 항생제 항mycotic 용액600 μL을 포함하는 각질 세포 배양 배지 40mL를 준비하십시오. 항생제 항mycotic 용액의 0.025 % 트립신과 400 μL의 20 mL을 준비합니다.
- 트립신 억제 용액을 실온에서 해동하고 4.1 단계에서 사용할 때까지 4 °C에서 유지하십시오.
참고: 격리 시약은 5마리의 마우스의 조직 격리를 위해 준비됩니다.
- 트립신 억제 용액을 실온에서 해동하고 4.1 단계에서 사용할 때까지 4 °C에서 유지하십시오.
- 문화 매체를 준비하려면 500mL의 배지를 가지고 5mL의 성장 보충제 용액(이하 재료표 참조)과 20% 칼슘 고갈된 첼렉스-태아 소 혈청(FBS)33 (이하 첼렉스-FBS라고 함)을 추가한다.
2. 성인 마우스에서 미각 조직의 해부
- 동물 복지와 관련된 시설의 규정에 따라 자궁 경부 탈구로 성인 C57BL/6J 마우스(남성 또는 여성)를 희생하십시오.
- 면도기로 입 주위의 머리카락을 제거합니다. 가위를 사용하여 뺨에서 턱쪽으로 양쪽으로 자른다.
참고: 마우스는 희생하기 전에 마취해야 합니다. 메데토미딘, 미다졸람 및 부안소올의 마취 혼합물이 사용됩니다( 재료표 참조).
- 면도기로 입 주위의 머리카락을 제거합니다. 가위를 사용하여 뺨에서 턱쪽으로 양쪽으로 자른다.
- 집게를 사용하여 입을 넓게 열고 면봉을 사용하여 혈액을 흡수하십시오. 입맛을 소독하려면 10% 포비도요오드가 들어있는 면봉으로 입 안을 닦아냅니다.
- 마우스 입맛을 수확하려면 먼저 외과용 메스 블레이드를 사용하여 상악 치아의 입맛을 따라 전체 두께 한계 절개를 합니다. 그런 다음, 조심스럽게 raspatorium을 사용하여 전체 미각을 해부.
참고: raspatorium은 무코피리오스토프 플랩을 높이는 데 사용되는 도구입니다( 재료 표 참조) (그림 1B 참조). - 완전한 배지 + 항생제 항mycotic 용액의 4 mL을 포함하는 15 mL 튜브로 입맛 조직을 신속하게 전달합니다. 잠복이 준비될 때까지 조직을 얼음 위에 두십시오.
참고: 여러 마우스의 수집을 위해, 구개 조직은 최대 4시간 동안 얼음 위에 보관될 수 있다.
3. 입맛 조직의 전처리
- 라미나르 플로우 후드에서 조직을 완전한 배지 + 항생제 항mycotic 용액 4mL를 포함하는 60mm 접시로 이송합니다.
- 짧고 무딘 집게와 메스 블레이드를 사용하여 조직에서 혈액을 부드럽게 제거합니다. 전체 매체로 조직을 10번 씻으시면 됩니다.
- 조직을 0.025% 트립신 + 항생제 항진성 용액의 4mL를 함유한 35mm 접시로 옮기고 상피 표면이 아래로 향합니다.
참고: 안쪽으로 구부러진 상피 표면은 트립신 용액에 담가야 합니다. 라미나 프로프리아는 얼굴을 맞대고 있어야 합니다. 조직은 트립신 용액에서 완전히 배양될 수 있도록 가능한 한 평평하게해야합니다. - 배양 후드의 실온에서 ~16h의 트립신은 0.025%로 조직을 배양한다.
4. 1차 세포의 수집 및 배양
- 무딘 집게 한 켤레를 사용하여 트립신 용액 (35mm 접시)에서 조직을 제거하고 상피 표면이 위로 향하는 60mm 접시 (접시 당 4 mL)로 트립신 억제제 용액으로 옮습니다.
- 포셉을 사용하여 입맛의 가장자리를 잡고 메스 블레이드를 사용하여 근본적인 라미나 프로프리아에서 상피 층을 부드럽게 긁어냅니다.
참고 : 결합 조직은 트립신에 의해 소화되지 않으므로 긁는 동안 벗겨지지 않습니다. - 조직에서 상피 세포의 최대 량을 수집하려면 조직을 4mL 의 완전한 배지로 다른 60mm 접시로 옮기고 스크래핑 단계를 반복합니다.
참고 : 블레이드의 끝으로 조직을 긁어 하지 않도록해야합니다; 대신 블레이드의 가장자리를 사용합니다. 스크래핑은 조직 당 5-10 분 동안 수행됩니다. - 멸균 100 μm 세포 스트레이너를 50mL 원문 튜브 위에 놓습니다.
- 멸균 파이펫을 사용하여 트립신 용액 2mL(4.1단계에서)를 스트레이너로 옮겨 표면을 적시십시오.
- 파이펫을 사용하여 60mm 접시(4.2-4.3단계)에서 셀 서스펜션을 몇 번 혼합하고 4.4-4.5 단계로 준비된 100μm 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
- 혈종계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 트라이판 블루 용액 15μL을 준비하고 셀 서스펜션 15μL(단계 4.6)를 추가합니다. 세포-트라이판 블루 믹스의 10 μL을 혈류계로 옮기고 세포 수를 계산합니다.
참고: 마우스 입맛 한 조각은 최대 100만 개의 셀을 생성할 수 있습니다. - 계산하는 동안, 원심 분리튜브 (단계 4.6에서) 실온에서 5 분 동안 100 x g 에서.
- 피펫으로 슈퍼네티를 흡인합니다. 튜브에 완전한 매체 + chelexed-FBS 2mL을 추가합니다. 5mL 파이펫을 사용하여 여러 번 트리튜레이션하여 셀 펠릿을 다시 중단합니다.
- 1 마우스에서 2-5 x 105 셀을 콜라겐 타입 I로 미리 코팅한 24웰 플레이트의 한 우물로 플레이트 2-5 x 105 셀( 재료 표 참조).
- 배지를 변경하지 않고 2 일 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다.
- 시드 후 2일 후, 배양 매체의 절반을 완전한 매체 + chelexed-FBS로 교체하십시오. 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오. 2일마다 완전한 배지 + chelexed-FBS로 셀을 공급합니다.
참고: 시드에 따라 크기가 다른 셀이 관찰됩니다. 파종 후 약 3-5일 후, 조약돌 형태가 있는 각질 세포(도 2)를 관찰할 수 있다. 첫 번째 통로를 실시하기 전에 1-2 주가 걸리며 세포가 두 번째 및 세 번째 구절을 준비하기 전에 1-2 주가 필요합니다. 그 후, 세포는 더 빨리 성장하고 냉동 보존을 위해 준비 될 수있다. 세포는 각각 1회 및 제2 통로에서 하나의 우물(24웰 플레이트)과 6웰 플레이트로 재도금될 수 있다. 후속 통로는 세포 성장 및 밀도에 의존할 것입니다. 세포 분할 비율은 1:2 또는 1:3의 세포 분할 비율을 제 3 통로 후에 사용할 수 있다.
5. 각막세포 통로
- 문화 접시에서 상체 2mL를 수집하고 15 mL 원색 튜브 (얼음)로 분배하십시오. 멸균 1x PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다.
참고: 세포가 약 70%-80%의 합류에 도달하면 통과할 준비가 되어 있습니다. - 접시에 0.05% 트립신-EDTA의 1mL을 6웰 플레이트의 우물에 넣습니다.
- 37 °C에서 5-15 분 동안 배양; 5 분 후에 세포가 접시에서 분리되는지 확인하십시오.
- 트립신 억제 용액 1mL및 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 2mL을 사용하여 반응을 부드럽게 배관하여 중화한다. 다음으로, 5.1단계와 동일한 15mL 원문 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.
- 4°C에서 5분 동안 100 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 피펫으로 상류체를 흡인하고 완전한 배양 배지의 1 mL에서 셀 펠릿을 재놓습니다.
- 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 다음으로, 새로운 24- 또는 6-웰 배양 판으로 셀 서스펜션의 플레이트 1 mL.
참고: 초기 통로에서 세포의 일부는 70% 완전 배양 배지 + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO의 혼합물로 냉동될 수 있다. 세포의 1-2 극저온은 하나의 컨실리 배양 플레이트로부터 수집될 수 있다.
6. 각질 세포의 냉동 보존 및 복구
- 셀 동결
- 각질 세포를 80%-90%로 증가시면 됩니다.
참고: 세포가 과도하게 증가하는 것을 허용하지 마십시오. - 5.1-5.5 단계에 설명된 대로 요리의 각질 세포가 0.05% 트립신-EDTA로 처리합니다.
- 혈종계를 사용하여 각질 세포를 계산합니다. 각 유리병에 1 x 106 세포/mL의 전송을 허용하기 위하여 계산된 세포 수에 근거를 둔 극저온을 준비합니다.
- 4°C에서 5분 동안 100 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 10 % DMSO + 20 % 첼렉스 -FBS + 70 % 완전한 배양 배지 (9 mL + chelexed-FBS 및 DMSO 1 mL)의 10 mL 용액에서 셀 펠릿을 다시 분리하십시오.
- 유리병 당 서스펜션의 1 mL에서 극저온으로 세포를 분배. 바이알을 밤새 극저온 저장 용기에 -80°C로 놓습니다. 다음 날 유리병을 액체 질소 탱크로 옮기.
- 각질 세포를 80%-90%로 증가시면 됩니다.
- 세포 복구
- 액체 질소 탱크에서 극저온을 제거하고 실온에서 부분적으로 해동하십시오. 15mL 튜브에서 셀 서스펜션의 1mL을 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 3mL와 혼합한다.
- 100 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 혼합물을 원심 분리합니다. 상체를 버리고 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 셀 서스펜션을 새로운 60mm 콜라겐 I 코팅 배양 접시에 접시를 접시에 넣습니다. 배양 배지를 2-3일마다 교체하고 한 번 수렴한 세포를 통과한다.
7. 면역형광 염색
- 정사각형 커버의 배양 구강 각질은 2 일 동안 6 웰 플레이트 (5 x 105 세포 / 웰)의 입술 (22mm x 22mm)입니다.
- 각질 세포는 4% 파라포름알데히드(PFA)와 PBS를 실온에서 20분 동안 수정한 후 PBS1x로 세 번 세척합니다.
- PBS에서 0.1% 트리톤의 용액에서 세포를 페메아빌화합니다. 실온에서 1시간 동안 시약(염소 세럼 2.5%, 당나귀 세럼 2.5%) 차단세포를 배양한 다음, 4°C에서 1차 항체를 가진 야간 배양( 재료표 참조)을 갖는다.
참고: 1차 항체는 토끼 항K14(1:1000), 랫트 α6-integrin(1:100), 토끼 안티-p63(1:500), 토끼 안티-K13(1:100), 염소 안티 PDGFRα(1:100)에서 사용되었다. - PBS에서 0.1% 트리톤의 용액으로 샘플을 세척하고 실온에서 1 시간 동안 이차 항체로 배양합니다.
참고: 이차 항체(Alexa 488 또는 555)는 1:300 희석에서 사용되었다. - 10 분 동안 Hoechst 용액을 가진 모든 샘플을 카운터 스테인하고 유리 슬라이드에 셀을 장착합니다.
참고 : Hoechst 용액은 세포의 핵을 얼룩시키는 데 사용됩니다. - 공초점 현미경을 사용하여 샘플 이미징을 수행합니다.
참고: 밝기와 콘트라스트는 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 동일한 강도로 조정됩니다.
Representative Results
성인 마우스 입맛에서 구강 각질 세포의 해부 과정 및 격리개요
해리된 구강 각질 세포는 성인 마우스 입맛에서 수집되어 맞춤형 20% 첼렉스-FBS로 배양되었습니다. 마우스 입맛은 단단한 입맛과 부드러운 입맛(도 1C)으로 구성됩니다. 마우스 구강 각질 세포의 분리 절차는 도 1D로 요약됩니다. 미각 조직은 해부되고 항생제 항mycotic 용액을 함유하는 매체로 옮겨져 0.025% 트립신 용액을 하룻밤 사이에 4°C로 배양한다. 다음 날, 입맛 조직은 트립신 억제제 용액으로 치료되고 동일한 볼륨으로 완전한 배양 배지를 갖는다. 그 후, 조직은 구강 각질 낭종을 수집하기 위해 외과 메스 블레이드를 사용하여 긁어. 세포 현탁액은 100 μm 세포 스트레이너를 통해 여과되고 원심분리된다. 세포는 그 때 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 2 mL를 포함하는 콜라겐 I 코팅 24 웰 판에서 시드됩니다.
마우스 구강 각질 세포의 성공적인 격리의 대표적인 결과
1차 경구 각질세포는 단층으로 성장하여 조약돌 형태를 보였다(도 2). 작은 각질 세포 식민지는 3-5 일에 보였다 (그림 2A, B); 이들은 더 크고 인큐베이션의 1 주에 단단한 식민지를 형성했습니다 (그림 2C). 각질 세포 식민지는 기저 각질 세포의 전형적인 형태학적 특징을 표시하여 건강한 상태를 나타냅니다. 인간 구강 각질세포는 0.06 mMM Ca2+16,28를 포함하는 완전한 배양 배지에서 여러 구절에 대해 미분화되어 있었습니다. 첫 번째 구절은 초기 도금에서 약 2주 동안 수행하였다(도 2D). 나중에 목막세포는 문화의 짧은 기간으로 안정적인 성장을 나타냈다(그림 2E-G). 각질 세포는 격리 과정에서 상당한 섬유아세포 오염이 발생하면 성장을 멈췄다(도 2H).
분리 된 마우스 구강 각질 세포 표현 기저 세포 마커
1차 경구 각질세포의 상태를 확인하기 위해, 면역염색은 기저세포 마커 케라틴(14)(K14) 및 α6-integrin34를 사용하여 수행하였다. K14 및 α6-인테그린은 배양 후 각질세포로 발현되었다(그림 3A, B). 세포는 또한 줄기 세포 마커 p63로 염색되어 줄기를 확인하였다. 조기 통로(통로 4)와 후기 통로(passage 7) 세포는 p63(도 3C, D)의 균일한 발현을 보였다. 대조적으로, 높은 칼슘(2일 동안 1.2 mM 유도)으로 취급된 각질 세포는 p63 발현(도 3E)을 나타내며, 이는 높은 칼슘 치료가 이전에 보고된 바와 같이 1차 각질 세포에서 줄기 세포 관련 유전자를 억제한다는 것을 나타낸다16. 분화 마커 케라틴(13)은 높은 칼슘 처리 하에서 조기 및 후기 구절 모두에서 희귀하거나 발현이 없는 것으로 나타났다(도 3F-H). 각질 세포 배양에서 섬유아세포 오염가능성을 테스트하기 위해, 섬유아세포 마커 PDGFRα를 사용하여 염색하는 것은 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)와 비교하여 동일한 각질 세포세트로 수행되었다. MEF 세포에서 관찰된 높은 발현에 비해 각질 세포 배양에서 PDGFRα의 발현이 없었다(도 3I-3L). 이러한 결과는 이 프로토콜이 기저 각질 세포를 성공적으로 분리하고 미분화 상태에서 이러한 세포를 유지할 수 있음을 나타냈다.
그림 1: 마우스 구강 각질 세포의 해부 절차 및 격리개요. (A) 마우스 구강의 회로도 표현. (B) 마우스 구강 각질 세포와 분리하는 데 사용되는 악기. (C) 마우스 입맛의 브라이트필드 이미지. 배율 막대: 프로토콜의 100 μm. (D) 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 구강 각질 세포의 성공적인 격리의 대표적인 결과. (A-G) 3일(A), 5일(B), 1주(C), 2주(D)의 배양된 1차 구강 각질 세포의 타임코스 영상. 마우스 구강 각질 세포의 형태는 첫 번째 (E), 두 번째 (F) 및 세 번째 (G) 구절 후 표시됩니다. (H) 마우스 구강 각질 세포 배양에서 섬유아세포 오염의 예. 스케일 바: 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분리된 마우스 구강 각질 세포는 기저 세포 마커를 표현합니다. (A-B) K14(A; 적색) 및 α6-인테그린(B; 녹색)의 면역형 염색의 대표적인 이미지 4. (C-E) 4번(C), 통로 7(D), 고칼슘 처리(E)에서 p63(녹색)의 면역형염색의 대표적인 이미지. (F-H) 4번 통로에서 K13(녹색)의 면역염색 영상, 통로 7(G), 및 높은 칼슘 처리(H). (I-L) 4번 통로에서 PDGFRα(빨간색)의 면역염색 영상, 통로 7(J), 고칼슘 처리(K), 및 MEF(L). 핵은 Hoechst (파란색)로 얼룩져 있습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
인간 또는 마우스 피부 표피로부터 분리된 1차 각질 세포는 연구 및 임상 응용 분야에서 수년 동안 활용되어 왔습니다12,13,15,18,27,28,29. 대조적으로, 몇몇 프로토콜은 성인 마우스30,31,32에서 1 차적인 구강 각질세포를 분리하고 문화하기 위하여 설치되었습니다. 본 연구는 증식 또는 줄기 세포 같이 상태에서 각질 세포를 유지하기 위하여 상업적인 완전한 배양 매체 및 chelexed-FBS를 이용했습니다. 이 배양 시스템은 경구 상피 줄기 세포 및 관련 질병의 특징을 더 이해하기 위해 분자 및 생화학 적 분석을 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫째, 트립신 농도 및 인큐베이션 시간은 후속 배양을 위한 실행 가능한 세포를 생성하는 데 필수적입니다. 우리는 지속적으로 0.025 % 트립신 솔루션과 실온에서 챔버 후드에 16 h 인큐베이션 기간을 사용했다. 충분한 시간 동안 배양하지 않으면 각질 세포가 조직으로부터 제대로 분리되지 않아 최종 세포 수율이 낮아집니다. 둘째, 둘째 날에 셀 서스펜션의 부드러운 파이펫팅은 특히 세포 생존에 영향을 미칩니다. 긁는 것은 상피 측에서 부드럽게 시작되어야하며 조직 샘플 당 10 분이상하지 않아야합니다. 마지막으로, 첫 번째 분리 된 세포 현탁액은 섬유 아세포 및 기타 세포 유형을 포함; 이러한 원치 않는 세포는 일반적으로 후속 배양에서 사라지기 시작합니다.
잠재적인 제한은 세포 격리 및 배양 도중 확인되었습니다. 드문 경우에, 섬유아세포는 격리 과정에서 오염될 수 있고, 섬유아세포는 후속 통로에서 각질 세포의 성장을 억제할 수 있다(도 2H). 배양시 이러한 오염을 제거하기 위해 섬유아세포 성장 억제제가 포함된 상용 배지를 선택해야 한다. 마우스 입맛 및 기타 경구 점막의 크기는 크기가 상대적으로 작기 때문에, 한 마우스에서 초기 세포 수율이 낮을 수 있다. 따라서, 이 프로토콜의 전체 배양 기간은 -냉동 보존 단계까지-1 차적인 피부 각질 세포에 대한 것보다 더 길다. 고립 된 경구 각질 세포는 10 개의 구절 내에서 가장 잘 사용되며, 배양 기간이 연장되면 세포 특성을 변경하고 줄기 세포의 수를 낮출 수 있습니다.
현재 방법은 마우스 구강 각질 세포가 증식 조건 하에서 단단히 포장된 조약돌 형태와 형성된 단층 식민지를 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 또한 기저마커 α6-인테그린, K14 및 줄기세포 마커 p63의 높은 발현을 보였다. 향후 연구에서는 면역 형광 염색, RNA 염기서열 분석, RT-PCR 및 서부 블롯 분석 외에도 경구 각질 세포의 세포 이질성 및 순도를 확인하는 데 사용되어 이러한 세포의 특성에 대한 이해를 더욱 향상시킬 것입니다.
2-3개의 통로 후에, 경구 각질 세포는 추가 기능적인 실험에서 이용될 만큼 충분히 안정하였다. 중요한 것은, 이 배양 프로토콜은 유전자 녹아웃, Cre-loxP 및 tet 유도 가능한 시스템을 포함하여 형질 전환 마우스 라인과 결합될 수 있고, 또한 세포 및 분자 분석에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 프로토콜은 구경 각질 줄기 세포 생물학을 더 이해하는 데 사용될 수 있는 근본적이고 효율적인 방법을 연구원에게 제공한다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 과학 연구를위한 그랜트 인 - 에 이드 (B) (20H03266) (A.S.), 초기 경력 과학자를위한 보조금 지원 (18K14709) (A에 보조금 번호 JP21gm6110016 및 21bm0704067 (A.S.에) 및 다케다 과학 재단 (A.S.에)의 연구 보조금에 따라 AMED. 구마모토대학교 동물자원개발센터와 츠쿠바대학교 동물자원센터의 우수한 마우스관리에 감사드립니다. 구마모토대학의 IRCMS 핵심 시설은 공초점 영상에 대한 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
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