Summary
여기서, 죽음을 유도하는 신호 복합체(DISC)에서 직접 카스파제-8 처리를 감지하고 이 복합체의 조성을 결정하는 실험 워크플로우가 제시된다. 이 방법론은 세포 사멸 경로의 분자 메커니즘을 해명에서 세포 사멸 네트워크의 동적 모델링에 이르기까지 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
Abstract
외래 세포멸은 CD95/Fas/APO-1 또는 종양 괴사 인자-유도 리간드(TRAIL)-수용체 1/수용체 2(TRAIL-R1/R2)와 같은 사망 수용체(DRs)의 활성화에 의해 중재된다. 그들의 cognate 리간드로 이 수용체의 자극은 죽음을 유도하는 신호 복합체 (DISC)의 조립으로 이끌어 냅니다. DISC는 DR, 어댑터 단백질 Fas-연관 단백질을 데스 도메인(FADD), procaspases-8/-10, 및 세포 FADD 와 같은 인터류신(IL)-1β 변환 효소 억제 단백질(c-FLIPs)으로 포함한다. DISC는 procaspase-8 처리 및 활성화를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 후자는 디스크에 조립된 데스 이펙터 도메인(DED) 필라멘트의 이질/올리고머화를 통해 발생합니다.
procaspase-8의 활성화는 여러 단계에서 발생하는 처리 뒤에 있습니다. 이 작업에서는 이 컴플렉스에서 DISC 형성 및 프로카스파스-8의 처리를 측정할 수 있는 확립된 실험 워크플로우가 설명되어 있습니다. 워크플로는 서양 얼룩 분석에 의해 지원되는 면역 침전 기술을 기반으로 합니다. 이 워크플로우를 통해 DISC 및 그 처리에 대한 다양한 단계의 procaspase-8 모집을 주의 깊게 모니터링할 수 있으며 외외 세포멸의 분자 메커니즘을 조사하는 데 매우 관련이 있습니다.
Introduction
가장 잘 연구 된 죽음 수용체 중 하나 (DRs) CD95 (Fas, APO-1). 외래 식수 막멸 경로는 COgnate 리간드, 즉 CD95L과 상호 작용하거나 TRAIL-Rs에 결합하는 DR의 상호 작용으로 시작됩니다. 이 결과 해당 DR. DISC에서 디스크의 형성은 CD95, FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP 단백질1,2로구성된다. 더욱이, DISC는 CD95 및 FADD와 같은 데스 도메인(DD)-함유 단백질, 및 FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP(도1)와같은 DED 함유 단백질 간의 상호 작용에 의해 조립된다. Procaspase-8은 DEDs의 협회를 통해 올리고머화를 거치며 DED 필라멘트의 형성을 초래하고 procaspase-8 활성화 및 처리가 뒤따릅니다. 이것은 세포 사멸로 이끌어 내는 caspase 폭포를 트리거합니다(그림 1)3,4. 따라서, procaspase-8은 CD95 또는 TRAIL-Rs에 의해 매개되는 외외 세포사멸 경로의 중앙 시인터 카스파제이며, 해당 거대 분자 플랫폼, DISC에서 활성화된다.
procaspase-8의 2개의 등소 형태, 즉 procaspase-8a (p55) 및 -8b (p53), DISC5에모집되는 것으로 알려져 있습니다. 두 등도 형태 모두 두 개의 DED를 포함한다. DED1 및 DED2는 프로카스파스-8a/b의 N 단말 부분에 위치하고 있으며 촉매 p18 및 p10 도메인이 뒤따릅니다. procaspase-8 DEDs의 상세한 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM) 분석은 DED 필라멘트4,6에게불린 필라멘트 구조물로 procaspase-8 단백질의 조립을 밝혔습니다. 놀랍게도, 선형 procaspase-8 체인은 처음에 DISC에서 procaspase-8 활성화에 선행된 이질에 종사하는 것이 제안되었습니다. 지금, 그 체인은 procaspase-8 DED 필라멘트의 하위 구조, 세 개의 나선으로 조립 된 세 개의 체인을 포함하는 후자는 알려져 있다3,4,6,7.
DED 필라멘트에서 분화하면, 프로카스파스-8a/b의 형성적 변화는 프로카스파스-8의 활성 센터형성과 활성화3,8로이어진다. 이것은 두 개의 경로를 통해 매개되는 procaspase-8 처리에 선행됩니다: 첫번째는 p43/p41 분열 제품의 생성을 통해 가고 p30 분열 제품의 초기 생성을 통해 두 번째. p43/p41 통로는 Asp374에서 procaspase-8a/b의 분열에 의해 개시되어 p43/p41 및 p12 분열제품(그림 2)을초래한다. 또한, 이들 단편은 Asp384 및 Asp210/216에서 자동 촉매로 갈라져 활성 카스파스-8 이테로테트라머, p10 2/p1829,10,11의형성을초래한다. 또한, 처리의 p43/p41 경로에 병행하여, procaspase-8a/b는 또한 아스p216에서 절단되어 C-단말 분열 제품 p30의 형성으로 이어지고, 그 다음으로 p10 및 p1810(도 2)에대한 프로테올리시스가 뒤따랐다.
DED 필라멘트에서 Procaspase-8a/b 활성화는 c-FLIPs12라는단백질에 의해 엄격하게 조절된다. c-FLIP 단백질은 c-FLIP Long(c-FLIP L),c-FLIP Short(c-FLIPS),c-FLIPRaji(c-FLIP R)세 가지 등등형태로 발생합니다. 세 개의 동소형태모두 N단자 지역에 2개의 DED가 포함되어 있습니다. c-FLIPL은 또한 C-단말 촉매 비활성 카스파스와 같은도메인(12,13)을가지고 있다. c-FLIP-c-FLIPS및 c-FLIPR-의짧은 동소형태는모두 DISC6,14,15에서DED 필라멘트 형성을 방해하여 반석멸 방식으로 작용한다. 또한, c-FLIPL은 농도 의존적 방식으로 카스파제-8 활성화를 조절할 수 있다. 이것은 프로- 및 반-apoptotic 효과16,17,18귀착될 수 있다. 촉매 활성 프로카스파스-8/c-FLIPL 이성애를 형성함으로써 c-FLIPL은 프로카스파스-8의 활성 중심의 안정화및 활성화로 이어집니다. c-FLIPL의 프로-또는 반-아포토틱 기능은 DED 필라멘트의 양과 조립된 procaspase-8/c-FLIPL 이종수(19)의 후속 양에 직접적으로 의존한다. 디스크에서 c-FLIPL의 낮거나 중간 농도는 caspase-8의 활성화를 지원하는 DED 필라멘트에서 충분한 양의 procaspase-8/c-FLIPL 이종수의 결과를 초래한다. 대조적으로, c-FLIPL의 증가양은 직접 DISC20에서그것의 반 자멸 효과로 이끌어 내다.
함께 촬영, 활성화 및 디스크에서 procaspase-8a/b의 처리는 여러 단계를 포함하는 매우 규제 과정이다. 이 백서에서는 DISC에서 직접 프로카스파스-8 처리의 측정과 이 복합체의 조성에 대한 분석에 대해 설명합니다. 이것은 모범적인 DR 복합체로 CD95 DISC를 사용하여 표시됩니다.
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Protocol
T세포 실험은 윤리적 합의42502-2-1273 유니 MD에 따라 수행되었다.
1. 실험을 위한 세포 준비
참고: 이 면역 침전을 위한 세포의 평균 수는 1 × 107입니다. 부착 된 세포는 실험 당일 1 × 107 세포가 되도록 실험 하루 전에 시드해야합니다.
- 실험을 위한 부착 셀 준비
- 종자 5-8 × 106 부착 세포는 20 mL의 배지에서 (구성을위한 재료의 표 참조) 실험이 시작되기 하루 전에 14.5cm 접시에서 각 조건에 대해.
- 실험 당일, 세포가 80-90% 컨런트와 접시를 부착하고 있는지 확인하십시오. 배지를 버리고 부착 셀에 신선한 배지를 추가합니다.
- 실험을 위한 서스펜션 셀 준비
- 실험이 시작되기 직전 14.5cm 접시에 10mL의 배양 배지에 1× 107 현탁세포(조성물 표 참조)를 신중하게 배치합니다.
- 1 차 세포를 사용하는 경우, 이전에 설명된절차(21)에따라 1차 T 세포를 분리한다. 1일 T 세포를 24시간 동안 1μg/mL 식물성 세포로 처리하고, 6일 동안 25개의 U/mL IL2 치료를 처리합니다.
- 실험이 시작되기 직전 14.5cm 접시에 1개의 ×108개의 1차 T세포를 배양 배지 10mL에 조심스럽게 배치한다(조성물 표 참조).
참고: 이러한 세포가 작기 때문에 이 더 많은 기본 T 세포 수가 권장됩니다.
2. CD95L 자극
- CD95L로 세포를 자극하십시오(이전에 설명된 대로생산된 20 또는 시판가능(재료표 참조).
참고: CD95L의 농도와 자극 의 시간은 세포형 의존13,15,22,23,24,25이다. 하나의 자극 조건을 두 번 준비하여 '비드 컨트롤' 샘플을 병렬로 생성합니다.- CD95L의 선택된 농도로 부착 세포를 자극한다. 플레이트를 비스듬히 잡고 리간드를 부착 셀에 닿지 않고 매체에 파이프합니다.
- 리간드 용액을 셀 서스펜션으로 배관하여 CD95L로 서스펜션 셀을 자극합니다.
3. 세포 수확 과 리시스
- 셀 접시를 얼음 위에 놓습니다.
참고: 매체를 폐기하지 마십시오. 죽어가는 세포는 매체에 떠 있고 분석에 중요합니다. - 10mL의 차가운 인산염 완충식식염(PBS)을 세포 현탁액에 넣고 부착된 세포를 플레이트에서 긁어냅니다. 50mL 튜브에서 셀 서스펜션을 수집합니다.
- 차가운 PBS 10mL로 셀 접시를 두 번 씻고 워시 용액을 동일한 50mL 튜브에 넣습니다. 5분, 4°C에 대해 500 g ×의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 상체를 버리고 차가운 PBS의 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮기십시오.
- 5분, 4°C에 대해 500 g ×의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 차가운 PBS의 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
- 5분, 4°C에 대해 500 g ×의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 용해 버퍼 1mL (4 % 프로테아제 억제제 칵테일 포함)으로 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 얼음에 30 분 동안 배양.
- 15분, 4°C의 최대 속도(~17,000×g)로 리세지를 원심분리합니다.
- 상체(lysate)를 깨끗한 튜브로 옮기십시오. 펠릿을 버리십시오. 다른 튜브에 있는 lysate의 50 μL를 가져 가라. 브래드포드 분석에 의한 단백질 농도를 분석하고 바이알에서 단백질의 25 μg에 해당하는 용액의 양을 섭취한다. 바이알에 로딩 버퍼(컴포지션의 재료 표 참조)을 추가합니다. -20°C에 보관하여 용하 제어로 보관합니다.
4. 면역 강수량 (IP)
- 항 APO-1 항체2 μL과 단백질 A 세파로즈 구슬 10 μL을 용액에 넣습니다. '비드 컨트롤'을 생성하기 위해 lysate (자극 된 샘플)를 포함하는 별도의 튜브에 비드의 10 μL만 추가합니다.
참고: 단백질 A 세파로즈 구슬을 취급하는 동안 팁을 자르거나 IP에 대한 특별한 팁을 구입하여 넓은 오리피스가 있는 파이펫 팁을 사용하십시오. - 4°C에서 하룻밤 동안 부드러운 혼합으로 항체/단백질 A 세파로즈 구슬과 lysate의 혼합물을 배양합니다. 원심분리는 항체/단백질A 세파로즈 구슬을 4분, 4°C에 대해 500 g에서 ×. 상체를 버리고, 차가운 PBS 1mL을 구슬에 넣고, 이 단계를 적어도 세 번 반복한다.
- 상부체를 폐기합니다. 바람직하게는 50 μL 해밀턴 주사기로 구슬을 흡인한다.
5. 웨스턴 블롯
- 구슬에 4x 로딩 버퍼의 20 μL을 추가하고 구슬에 넣고 10분 동안 95°C에서 가열합니다. 용액 컨트롤을 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 12.5% 나트륨 도데실 황산염(SDS) 젤(젤 준비를 위한 재료표 참조)에 용액, IP 및 단백질 표준을 적재하고 80V의 일정한 전압으로 실행한다.
- SDS 젤에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다.
참고: 여기서, 관심 있는 단백질에 최적화된 반건조 기술은 12분 이상(25V; 2.5A= 상수)를 통해 전송하는 데 사용되었다. 니트로셀룰로오스 멤브레인과 전기 포근 버퍼에 두 개의 미니 크기 이송 스택을 담그십시오 (구성을위한 재료 표 참조, 제조업체의 지시에 따라 준비) 서쪽 블로팅 전에 몇 분 동안. - 상자에 블로티드 멤브레인을 놓고 블로킹 용액 (PBS (PBST) + 5 % 우유에서 0.1 % Tween-20)에 1 h로 차단하십시오. 부드러운 동요 하에서 차단 용액으로 멤브레인을 배양합니다.
- PBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.
6. 웨스턴 블롯 감지
- 표시된 희석에 제1 차 일차 항체를 추가 (재료의 표참조) 막에 부드러운 동요와 함께 4 °C에서 하룻밤 을 배양.
- PBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.
- 20mL의 이차 항체(PBST + 5% 우유에서 희석)로 멤브레인을 1시간 동안 부드럽게 흔들어 보습합니다.
- PBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.
- PBST를 폐기하고 멤브레인에 고추냉이 과산화기기류 의 약 1 mL을 추가합니다.
- 화학 발광 신호를 감지합니다(재료 표참조).
참고: 노출 시간 및 캡처된 이미지의 수는 세포내 단백질의 양과 사용된 항체의 특이성에 달려 있습니다. 검출에 사용되는 각 항체에 대해 경험적으로 확립되어야 한다.
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Representative Results
CD95 DISC에서 DISC및 해당 처리를 위해 caspase-8 채용을 분석하기 위해 CD95 DISC의 IP와 서부 블롯 분석을 결합한 고전적인 워크플로우를 설명합니다. 이를 통해 DISC에서 caspase-8 활성화의 몇 가지 주요 기능을 검출할 수 있습니다: caspase-8-활성화 매크로 분자 플랫폼의 조립, DISC에 procaspase-8의 모집, 그리고 이 시터 카스파제의처리(도 1 및 도 2). 이러한 워크플로우는 CD95L을 이용한 민감한 세포의 치료를 시간 의존적 방식으로, 그들의 용해, 항 CD95(anti-APO-1) 항체를 이용한 면역침전, 그리고 후속 서부 얼룩분석(도 3)을포함한다.
자궁 경부암 HeLa-CD95 세포는 DISC형성(26)을분석하는 예로 사용되었다. CD95L을 가진 이들 세포의 자극은 CD95-면역 침전(도4)을 통해 모니터링되는 높은 수준의 CD95 DISC 형성을 초래하였다. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 및 c-FLIP는 이 CD95-면역 침전물에서 관찰되었다, 효율적인 디스크 형성을 나타내는. 중요한 것은, procaspase-8a/b의 골짜기 제품: p43/p41, p30 및 p18은 PROcaspase-8및 그 후속 처리의 활성화를 나타내는 DISC에서 검출되었다. 특히, 프로카스파스-8 p43/p41 및 p18의 골짜기 제품이 검출되어 앞서 언급한 두 단계의 p43 처리 경로를 나타낸다. 또한, p30 제품이 검출되어 caspase-8 처리의 대체 경로를 나타낸다. 더욱이, DISC에서 프로카스파스-8의 활성화는 c-FLIP 단백질과 같은 기판의 분열에 선행된다.
실제로, c-FLIP-p43-FLIP 및 p22-FLIP-의 골짜기 제품은 면역 침전물에서 검출되었고, 이는 카스파제-8활성화(도 4)를나타낸다. 중요한 것은, FADD, procaspase-8, procaspase-10 및 c-FLIPs, 또는 그들의 분열 제품은 DISC-면역 침전의 특이성을 강조하는 처리되지 않은 세포에서 면역 침전 시료에서 검출되지 않았다(도 4). 중요한 정보는 procaspase-8의 상이한 분열 제품에 대응하는 대역을 정량화함으로써 이러한 실험으로부터 얻을 수있다(도 4). 이 정보는 apoptosis 네트워크의 수학적 모델링에 사용할 수 있으며 경로 조절에 대한 정량적 통찰력을 제공합니다.
DISC에서 caspase-8 활성화 의 수준은 c-FLIP에 의해 변조된다. 따라서, C-FLIP L(HeLa-CD95-FL)15를 과발현하는 HeLa-CD95 셀이 두 번째 예(도 5)로선택되었다. 이러한 실험에서 c-FLIPL 동위원소의 효과를 관찰할 수 있으며, 힐레트 외에서 설명한 바와 같이, 힐레트 외 세포에서 디스크에서 프로카스파제-8의 상응하는 프로테올리시스에 비해 DISC에서 p43/p41에 대한 프로카스파스-8a/b 처리의 상이한 비율로 생성될 수 있다. 도 4의관측과 유사하게, FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP 단백질의 모집이 없고, 이들의 분열 제품은 이러한 면역 침전의 특이성을 지원하는 CD95L 처리 없이 HeLa-CD95-FL 세포로부터의 면역 침전물에서 검출되었다. 면역침전의 특이성에 대한 더 많은 증거는 CD95L 처리면역침전(도5)에서관찰된 DISC에 프로카스파제-3 및 폴리(ADP-ribose)의 모집이 없다는 것이다. 이러한 단백질은 복합체의 일부가 아니며 면역 침전 신호에 있는 그들의 부재는 풍부한 세포 단백질의 비특이적 결합의 부재를 위한 증거로 작용할 수 있습니다.
마지막으로, 서스펜션 세포로부터의 CD95 DISC의 면역 침전은 제3의 예로, 예를 들어, 활성화된 1차 T 세포(도6)로수행되었다. 이들 세포는 또한 높은 수준의 CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 및 c-FLIP의 상부를 특징으로 하며, 이는 그들의 분열 제품과 함께 항 CD95-면역침전에서 관찰되었다(그림6). 면역 침전물에서 procaspase-8 분열 제품의 검출은 1 차적인 T 세포에서 DISC-면역 침전물에서 이 개시자 caspase의 활성화 및 처리를 나타냅니다. 이러한 실험은 DISC가 많은 부착 및 현탁액 세포로부터 면역침전될 수 있으며 caspase-8 처리 및 활성화가 서양 블롯 분석에 의해 검증될 수 있음을 나타냅니다.
그림 1: CD95 신호 경로의 회로도 프리젠 테이션. CD95L은 DISC 어셈블리를 트리거합니다. 디스크는 CD95, FADD, 프로카스파스-8/-10 및 c-FLIP로 구성됩니다. FADD는 DD를 통해 CD95에 결합하는 반면 procaspase-8, procaspase-10 및 c-FLIP는 DED를 통해 상호 작용하여 DED 필라멘트를 형성합니다. DED 필라멘트의 형성은 procaspase-8 이질화, 처리 및 후속 활성화를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 활성 caspase-8 heterotetramer, p18 2/p102,아멸에 이르게 분열에 의해 caspase-3을 활성화. 약어: CD = 차별화 클러스터; CD95L = CD95 리간드; DISC = 죽음을 유도하는 신호 복합체; DD = 데스 도메인; FADD = Fas 관련 사망 도메인; c-FLIP = 세포 FADD 유사 인터류빈 (IL)-1β 변환 효소 억제 단백질; DED = 사망 효과기 도메인; c-FLIPL = c-FLIP롱. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 디스크에서 Procaspase-8 처리. DISC에서 procaspase-8a/b 처리의 두 가지 방법이 표시됩니다. 첫 번째 방법은 p43/p41 생성이 p18 형성에 뒤따릅니다. 두 번째 방법은 p18 및 p10에 처리 한 다음 p30 세대를 포함한다. 잔류물은 procaspase-8a의 순서에 따라 번호가 매겨져 있습니다. 약어: DED = 데스 이펙터 도메인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DISC-IP의 실험 설정의 회로도 프리젠 테이션. 세포는 CD95L로 자극됩니다. 자극 후, 세포는 수확및 수집되고, 다른 세척 단계를 따릅니다. 그런 다음 세포가 lysed되고 lysates가 수집됩니다. 이어서, 단백질 A-세파로즈 구슬 및 항-APO-1(anti-CD95) 항체를 용액에 첨가하고 하룻밤 사이에 배양하였다. 여러 세척 단계 후, 면역 침전은 서쪽 블로팅에 의해 분석되었다. 약어: DISC = 죽음을 유발하는 신호 복합체; IP = 면역 침전; CD95L = CD95 리간드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: HeLa-CD95 세포에서 CD95 디스크 형성. HeLa-CD95 세포는 항체 를 사용하여 30 분 또는 1 시간 CD95 DISC-IP에 대해 125 ng /mL CD95L로 자극되었다. IP의 조성물은 표시된 단백질에 대한 항체를 사용하여 서양 블롯 분석에 의해 검사되었다. 액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 입력이 표시됩니다. DISC에서 프로카스파스-8 분열 제품의 정량화는 CD95 신호로 표시 및 정규화된다. 약어: l.e. = 긴 노출; s.e. = 짧은 노출; BC = 항체의 첨가 없이 '비즈 전용'으로 IP를 제어; CD95L = CD95 리간드; DISC = 죽음을 유도하는 신호 복합체; IP = 면역 침전; FADD = Fas 관련 사망 도메인; c-FLIP = 세포 FADD 유사 인터류빈 (IL)-1β 변환 효소 억제 단백질; c-FLIPL = c-FLIP롱; c-FLIPS = c-FLIP짧은; 킬로달튼(kDa)의 M = 분자량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: c-FLIP L-과발현 헬라-CD95 셀에서 CD95 디스크 형성. HeLa-CD95-FL 세포는 표시된 시간 점(1-3 h)에 대해 250 ng/mL CD95L로 자극하였다. CD95 DISC-IP는 항APO-1(anti-CD95) 항체를 사용하여 수행되었다. IP의 조성물은 서쪽 얼룩 분석에 의해 검사되고 표시된 단백질을 위해 분석되었다. 액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 입력이 표시됩니다. DISC에서 프로카스파스-8 분열 제품의 정량화는 CD95 신호로 표시및 정규화된다. 2개 중 하나의 대표적인 실험이 표시됩니다. 약어: l.e. = 긴 노출; s.e. = 짧은 노출; BC = 항체의 첨가 없이 '비즈 전용'으로 IP를 제어; CD95L = CD95 리간드; DISC = 죽음을 유도하는 신호 복합체; IP = 면역 침전; FADD = Fas 관련 사망 도메인; c-FLIP = 세포 FADD 유사 인터류빈 (IL)-1β 변환 효소 억제 단백질; c-FLIPL = c-FLIP롱; PARP1 = 폴리(ADP-리보제)폴리머라제 1; 킬로달튼(kDa)의 M = 분자량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 1차 T 셀에서 CD95 DISC 형성. 1차 활성화 된 T 세포는 15 분 및 30 분 동안 500 ng /mL CD95L로 자극되었다. CD95 DISC-IP는 항 APO-1 (anti-CD95) 항체를 사용하여 수행되었다. IP의 조성물은 서쪽 얼룩 분석에 의해 검사되고 표시된 단백질을 위해 분석되었다. 액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. DISC에서 프로카스파스-8 분열 제품의 정량화는 CD95 신호로 표시및 정규화된다. 입력이 표시됩니다. 약어: l.e. = 긴 노출; s.e. = 짧은 노출; ; CD95L = CD95 리간드; DISC = 죽음을 유도하는 신호 복합체; IP = 면역 침전; FADD = Fas 관련 사망 도메인; c-FLIP = 세포 FADD 유사 인터류빈 (IL)-1β 변환 효소 억제 단백질; c-FLIPL = c-FLIP롱; 킬로달튼(kDa)의 M = 분자량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 접근법은 Kischkel 외27에 의해 처음 설명되었으며 여러 그룹에 의해 그 이후로 성공적으로 개발되었습니다. 이 복합체에서 효율적인 DISC 면역 침전 및 모니터링 caspase-8 처리를 위해 몇 가지 중요한 문제를 고려해야 합니다.
첫째, 면역 침전 중에 모든 세척 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 특히 중요한 것은 세파로즈 구슬의 최종 세척 단계와 세파로즈 구슬의 건조입니다. 이는 면역침전의 신호/잡음 비율을 높이기 위해 올바르게 수행되어야 하며, DISC에서 caspase-8 모집 및 처리를 감지할 수 있도록 허용합니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 이 사전 정리 단계가 서쪽 blotting7,23에의하여 DISC에 caspase-8 모집의 검출을 위해 필수적이지 않다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 언급했듯이, 면역 강수량의 끝에 있는 구슬의 세척은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 필수적이다. 세파로즈 비드에 풍부한 세포 단백질의 비특이적 결합은 본질적으로 코어 DISC 성분의 특정 신호를 감소시킬 수 있다. 비특이적 결합의 부재에 대한 중요한 대조군으로서, DISC에 존재하지 않는 것으로 보고된 단백질의 서부 얼룩 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석의 예는 도 5에서주어지며, 이는 DISC-면역 침전증에 대한 PARP1 및 caspase-3의 모집이 관찰되지 않았다. 이는 실험 중 패혈증 구슬의 특정 면역 침전 및 충분한 세척의 특이성을 나타낸다.
둘째, 면역침전증에 사용되는 항체와 동일한 동면형을 가진 항체를 이용한 구슬 전용 대조군 또는 면역침전 대조군과 같은 음의 대조를 수행하는 것이 중요하다. 항-APO-1 항체의 경우, 항마우스 IgG3 항체는 동종형 대조군으로 사용될 수 있다. 셋째, CD95만 관찰해야 하는 처리되지 않은 샘플로부터의 면역 침전 결과를 모니터링하는 것이 중요하다. 이러한 샘플에서 FADD, c-FLIP 또는 procaspase-8의 검출은 전형적으로 면역 침전 프로토콜 또는 세척 단계에서 몇 가지 단점의 존재를 나타냅니다. 이것은 완전히 정확하지 않을 지도 모르다 CD95를 가진 FADD 또는 c-FLIP의 자극 독립적인 협회에 가정을 초래하고, 대신 면역 침전증에 있는 결점을 나타낼 수 있었습니다. 넷째, 각 면역 침전에 대해, 입력 또는 용액은 면역 침전에 의해 분석된 핵심 단백질의 발현 및 후번역 변형을 측정하기 위해 병렬로 신중하게 분석되어야 한다.
다섯째, 시간 의존적 분석은 시간이 지남에 따라 복합체의 변화를 따를 수 있게 해주며, 복합체에 채용된 단백질의 특이성에 대한 또 다른 중요한 확인을 제공한다. 이와 관련하여, 중요한 문제는 각 세포주CD95 발현의 다른 수준과 이 복합체의 세포내 구성 요소의 이다. 따라서, CD95 DISC 형성의 정확한 타이밍은 각 특정 세포 유형에 대해 신중하게 확립되어야 한다. 마지막으로, DISC 역학의 분석을 위한 중요한 문제점은 각 면역 침전량에 있는 단백질의 양을 비교하는 것입니다. 반대로 APO-1 항체를 사용하여 수행된 CD95 DISC-면역침전의 경우, CD95의 양은 비교되는 복합체의 동등한 양의 핵심 척도이다. 이는 면역 침전물에서 CD95 신호의 강도가 상대적으로 높기 때문에 어려울 수 있다. 그러나 해당 서부 블롯 신호를 측정하기 위한 최적의 시간 간격을 찾아야 합니다. 또 다른 장애물은 CD95가 매우 글리코화 된 단백질이며, 이는 또한 여러 '흐릿한'밴드(28)의특정 패턴의 존재로 인해 면역 침전증의 검출에 어려움에 기여한다는 것입니다.
DISC-면역 침전 분석은 caspase 활성화 및 처리를 검출하기 위한 최적의 기초를 제공합니다. 실제로, 서부 블로팅과 결합된 면역 침전은 procaspase-8a/b: p43/p41, p30 및 p18의 분열 제품의 정량적 검출을 허용합니다(그림4, 도 5,및 도 6). 이를 통해 실험자는 시간이 지남에 따라 procaspase-8a/b 처리의 변화를 따르고 procaspase-8의 다른 골짜기 단계를 구별할 수 있습니다. 이러한 접근법은 수학적 모델에서 caspase-8 활성화를설명하고 DISC7,20,29에서분자 내-8 처리를 구별하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 더욱이, 서양 블로팅에 의한 카스파제-8 골짜기 제품을 측정하는 것은 IETD 기판을 기반으로 하는 기존의 caspase-8 활동 소술에 비해 뚜렷한 장점이 있다. 후자의 경우, IETD는 또한 다른 카스파제의 기판 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있다. 따라서 IETD 활동의 검출이 세포내의 카스파제 활동의 일반적인 증가를 나타낸다는 증거가 증가하고 있다. 대조적으로, 웨스턴 블롯 분석을 사용하면 특히 서쪽 블롯의 해당 밴드를 caspase-8에 할당하는 데 도움이 될 수 있으므로 연구원은 caspase-8이 이 단지에서 활성화된다는 확신을 가질 수 있습니다. 또한, 위에서 언급했듯이, DISC에서 caspase-8 처리를 측정하는 것은 수학 모델링 및 시스템 생물학 연구를위한 훌륭한 도구를 제시한다. 종합하면, 세포 사멸의 분자 메커니즘을 해명하는 데 필수적인 procaspase-8 활성화 및 처리의 다른 단계의 모니터링을 허용하기 위하여 고전적인 워크플로우가 제시됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 빌헬름 산더 재단 (2017.008.02), 다이나믹 시스템 센터 (CDS), 우리의 작업을 지원하기위한 유럽 프로그램 ERDF (유럽 지역 개발 기금)와 DFG (LA 2386)에 의해 투자 인정. 우리는 우리의 실험을 지원 카리나 Guttek 감사합니다. 우리는 우리에게 1 차적인 T 세포를 제공하기 위한 더크 Reinhold 교수 (OvGU, Magdeburg)를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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