Summary
Här presenteras ett experimentellt arbetsflöde som möjliggör detektion av caspase-8-bearbetning direkt vid det dödsframkallande signalkomplexet (DISC) och bestämmer sammansättningen av detta komplex. Denna metodik har breda tillämpningar, från att riva upp de molekylära mekanismerna för celldödsvägar till dynamisk modellering av apoptosnätverk.
Abstract
Extrinsisk apoptos förmedlas av aktivering av dödsreceptorer (DR) såsom CD95/Fas/APO-1 eller tumörnekrosfaktorrelaterad apoptos-inducerande ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av dessa receptorer med deras cognate ligands leder till monteringen av det dödsframkallande signalkomplexet (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-associerat protein med dödsdomän (FADD), procaspases-8/-10 och cellulära FADD-liknande interleukin (IL)-1β-konvertera enzymhämmande proteiner (c-FLIPs). DISC fungerar som en plattform för procaspase-8 bearbetning och aktivering. Den senare sker via dess dimerization/oligomerization i död verkställer domänen (DED) filament monterade på DISC.
Aktivering av procaspase-8 följs av dess bearbetning, som sker i flera steg. I detta arbete beskrivs ett etablerat experimentellt arbetsflöde som möjliggör mätning av DISC-bildning och bearbetning av procaspase-8 i detta komplex. Arbetsflödet är baserat på immunoprecipitationstekniker som stöds av western blot analys. Detta arbetsflöde möjliggör noggrann övervakning av olika steg av procaspase-8 rekrytering till DISC och dess bearbetning och är mycket relevant för att undersöka molekylära mekanismer för extrinsic apoptos.
Introduction
En av de bäst studerade dödsreceptorerna (DR) är CD95 (Fas, APO-1). Den extrinsiska apoptotiska vägen börjar med interaktionen mellan DR och dess cognate ligand, dvs CD95L interagerar med CD95 eller TRAIL binder till TRAIL-Rs. Detta resulterar i bildandet av skivan vid motsvarande DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP proteiner1,2. Dessutom monteras skivan genom interaktioner mellan DD-innehållande proteiner (Death Domain) som CD95 och FADD, och DED-innehållande proteiner som FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP (figur 1). Procaspase-8 genomgår oligomerization via associering av dess DED, vilket resulterar i bildandet av DED filament, följt av procaspase-8 aktivering och bearbetning. Detta utlöser en kaskadkad, vilket leder till celldöd (figur 1)3,4. Procaspase-8 är således en central initiator caspase av extrinsic apoptos utbildningsavsnitt medierad av CD95 eller TRAIL-Rs, aktiveras på motsvarande makromolekylära plattform, DISC.
Två isoformer av procaspase-8, nämligen procaspase-8a (p55) och -8b (p53), är kända för att rekryteras till DISC5. Båda isoformerna består av två DED. DED1 och DED2 finns vid N-terminaldelen av procaspase-8a/b följt av de katalytiska p18- och p10-domänerna. Detaljerad kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analys av procaspase-8 DEDs visade monteringen av procaspase-8 proteiner i filamentösa strukturer som kallas DED filament4,6. Anmärkningsvärt, den linjära procaspase-8 kedjor föreslogs ursprungligen att vara engagerad i dimerization följt av procaspase-8 aktivering på DISC. Det är nu känt att dessa kedjor bara är en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, den senare består av tre kedjor monterade i en trippel helix3,4,6,7.
Vid dimerisering vid DED-filamentet leder konformationsförändringar i procaspase-8a/b till bildandet av det aktiva mitten av procaspase-8 och dess aktivering3,8. Detta följs av procaspase-8-bearbetning, som förmedlas via två vägar: den första går via generering av en p43/ p41 klyvningsprodukt och den andra via den första generationen av en p30 klyvningsprodukt. P43/p41-vägen initieras genom klyvning av procaspase-8a/b vid Asp374, vilket resulterar i p43/p41 och p12 klyvningsprodukter(figur 2). Vidare är dessa fragment automatiskt katalytiskt klyvade vid Asp384 och Asp210/216, vilket ger upphov till bildandet av den aktiva caspase-8 heterotetramer, p102/ p1829,10,11. Dessutom visade det sig att parallellt med p43/p41-bearbetningsvägen klyvs även procaspase-8a/b vid Asp216, vilket leder till bildandet av C-terminalens klyvningsprodukt p30, följt av dess proteolys till p10 och p1810 (figur 2).
Procaspase-8a/b aktivering vid DED-filamentet regleras strikt av proteiner som heter c-FLIPs12. C-FLIP-proteinerna förekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS) och c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alla tre isoformerna innehåller två DEDs i deras N-terminal region. c-FLIPL har också en C-terminal katalytiskt inaktiv caspase-liknande domän12,13. Båda korta isoformerna av c-FLIP-c-FLIPS och c-FLIPR-verkar på ett antiapoptotiskt sätt genom att störa DED-filamentbildningen vid DISC6,14,15. Dessutom kan c-FLIPL reglera caspase-8 aktivering på ett koncentrationsberoende sätt. Detta kan resultera i både pro- och anti-apoptotiska effekter16,17,18. Genom att bilda den katalytiskt aktiva procaspase-8/c-FLIPL heterodimer leder c-FLIPL till stabilisering av det aktiva centrumet av procaspase-8 och dess aktivering. Den pro- eller antiapoptotiska funktionen hos c-FLIPL är direkt beroende av dess mängd vid DED-filamenten och den efterföljande mängden monterade procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Låga eller mellanliggande koncentrationer av c-FLIPL vid DISC resulterar i tillräckliga mängder procaspase-8/c-FLIPL heterodimerer vid DED-filamentet, vilket stöder aktivering av caspase-8. Däremot leder ökade mängder c-FLIPL direkt till dess anti-apoptotiska effekter vid DISC20.
Sammantaget är aktivering och bearbetning av procaspase-8a/b vid DISC en starkt reglerad process som omfattar flera steg. Detta dokument diskuterar mätningen av procaspase-8 bearbetning direkt på DISC samt analysen av sammansättningen av detta komplex. Detta kommer att presenteras med CD95 DISC som det exemplariska DR-komplexet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
T-cellsexperiment utfördes enligt det etiska avtalet 42502-2-1273 Uni MD.
1. Förbereda celler för experimentet
OBS: Det genomsnittliga antalet celler för denna immunprecipitation är 1 × 107. Vidhäftande celler måste sås en dag före experimentet så att det finns 1 × 107 celler på experimentdagen.
- Förbereda vidhäftande celler för experimentet
- Frö 5-8 × 106 vidhäftande celler i 20 ml medium (se materialtabellen för kompositionen) för varje tillstånd i 14,5 cm rätter en dag innan experimentet börjar.
- På experimentdagen, se till att cellerna är 80-90% sammanflöde och vidhäftande till skålen. Kassera mediet och tillsätt färskt medium till de vidhäftande cellerna.
- Förbereda suspensionsceller för experimentet
- Placera försiktigt 1 × 107 suspensionsceller i 10 ml odlingsmedium (se materialtabellen för kompositionen) per tillstånd i 14,5 cm rätter omedelbart innan experimentet börjar.
- Om du använder primärceller isolerar du primära T-celler enligt den tidigare beskrivna proceduren21. Behandla primära T-celler med 1 μg/mL fytohemagglutinin i 24 timmar, följt av 25 U/ml IL2-behandling i 6 dagar.
- Placera försiktigt 1 × 108 primära T-celler i 10 ml odlingsmedium (se materialtabellen för kompositionen) per tillstånd i 14,5 cm rätter omedelbart innan experimentet börjar.
OBS: Detta högre antal primära T-celler rekommenderas, eftersom dessa celler är mindre.
2. CD95L stimulering
- Stimulera cellerna med CD95L (framställd som tidigare20 eller kommersiellt tillgänglig (se materialförteckningen)).
OBS: Koncentrationen av CD95L och tidpunkten för stimulering är celltypberoende13,15,22,23,24,25. Förbered ett stimuleringstillstånd två gånger för att generera ett "pärlkontroll"-prov parallellt.- Stimulera vidhäftande celler med den valda koncentrationen av CD95L. Håll plattan i en vinkel och rör liganden i mediet utan att vidröra vidhäftande celler.
- Stimulera suspensionsceller med CD95L genom att pipettera ligandlösningen i cellupphängningen.
3. Cellskörd och lys
- Lägg cellrätterna på is.
OBS: Kassera inte mediet. Döende celler flyter i mediet och är viktiga för analysen. - Tillsätt 10 ml kallfosfatbuffrad saltlösning (PBS) till cellupphängningen och skrapa bort de bifogade cellerna från plattan. Samla cellfjädringen i ett 50 ml-rör.
- Tvätta cellformen med 10 ml kall PBS två gånger och placera tvättlösningen i samma 50 ml-rör. Centrifugera cellfjädringen vid 500 × g i 5 min, 4 °C.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten med 1 ml kall PBS. Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör.
- Centrifugera cellfjädringen vid 500 × g i 5 min, 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten med 1 ml kall PBS.
- Centrifugera cellfjädringen vid 500 × g i 5 min, 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten med 1 ml lysbuffert (innehållande 4% proteashämmare cocktail). Inkubera det i 30 minuter på is.
- Centrifugera lysat med maximal hastighet (~17 000 × g)i 15 min, 4 °C.
- Överför supernatanten (lysate) till ett rent rör. Kasta pelleten. Ta 50 μL av lysat i ett annat rör. Analysera proteinkoncentrationen med Bradford-analys och ta mängden lysat motsvarande 25 μg protein i en flaska. Lägg till lastbuffert (se materialförteckningen för kompositionen) i injektionsflaskan. Förvara den vid -20 °C som lysatekontroll.
4. Immunoprecipitation (IP)
- Tillsätt 2 μL anti-APO-1-antikroppar och 10 μL protein A sefarospärlor (beredda enligt tillverkarens rekommendationer) till lysat. Tillsätt endast 10 μL av pärlorna till ett separat rör som innehåller lysate (stimulerat prov) för att generera en "pärlkontroll".
OBS: Använd rörspetsar med breda öppningar antingen genom att skära spetsarna eller köpa speciella tips för IP medan du hanterar proteinet A sefarospärlor. - Inkubera blandningen av lysate med antikroppar/protein A sefarospärlor med skonsam blandning över natten vid 4 °C. Centrifugera lysatesna med antikroppar/protein A sefarospärlor vid 500 × g i 4 min, 4 °C. Kassera supernatanten, tillsätt 1 ml kall PBS till pärlorna och upprepa detta steg minst tre gånger.
- Kasta supernatanten. Aspirera pärlor helst med en 50 μL Hamilton spruta.
5. Västerländsk fläck
- Tillsätt 20 μL 4x lastbuffert (se materialtabellen för kompositionen) till pärlorna och värm vid 95 °C i 10 min. Värm lysatkontrollerna vid 95 °C i 5 min.
- Ladda lysates, IPs och en proteinstandard på en 12,5% natrium dodecylsulfatgel (SDS) gel (se tabellen över material för gelberedningen) och kör med en konstant spänning på 80 V.
- Överför proteinerna från SDS-gelen till ett nitrocellulosamembran.
OBS: Här användes halvtorrtekniken, optimerad för proteiner av intresse, för överföringen över 12 min (25 V; 2,5 A = konstant). Blötlägg nitrocellulosamembranet och två ministora överföringsstackar i elektroforesbuffert (se materialtabellen för kompositionen, förbered enligt tillverkarens instruktioner) i några minuter före western blotting. - Placera det blottade membranet i en låda och blockera det i 1 h i blockeringslösning (0,1% Tween-20 i PBS (PBST) + 5% mjölk). Inkubera membranet med blockeringslösningen under skonsam omrörning.
- Tvätta membranet tre gånger med PBST i 5 min varje tvätt.
6. Western blot upptäckt
- Tillsätt den första primära antikroppen vid den angivna utspädningen (se materialregistret)till membranet och inkubera den över natten vid 4 °C med mild omrörning.
- Tvätta membranet tre gånger med PBST i 5 min varje tvätt.
- Inkubera membranet med 20 ml sekundär antikropp (utspädd 1:10 000 i PBST + 5% mjölk) med mild skakning i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet tre gånger med PBST i 5 min varje tvätt.
- Kassera PBST och tillsätt cirka 1 ml pepparrotperoxidassubstrat till membranet.
- Detektera den chemoluminescenta signalen (se materialförteckningen).
OBS: Exponeringstiden och antalet tagna bilder beror på mängden protein i cellen och specificiteten hos de antikroppar som används. Det måste fastställas empiriskt för varje antikropp som används för detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att analysera caspase-8 rekrytering till DISC och dess bearbetning på CD95 DISC, beskriver detta dokument ett klassiskt arbetsflöde, som kombinerar IP av CD95 DISC med western blot analys. Detta gör det möjligt att upptäcka flera viktiga egenskaper hos caspase-8-aktivering vid DISC: montering av den caspase-8-aktiverande makromolekylära plattformen, rekrytering av procaspase-8 till DISC och bearbetning av denna initiator caspase (figur 1 och figur 2). Detta arbetsflöde innebär behandling av känsliga celler med CD95L på ett tidsberoende sätt, följt av deras lys, immunoprecipitation med anti-CD95 (anti-APO-1) antikroppar och efterföljande western blot analys(figur 3).
Livmoderhalscancer HeLa-CD95 celler användes som ett exempel för att analysera DISC-formationen26. Stimulering av dessa celler med CD95L resulterade i en hög nivå av CD95 DISC-bildning, övervakad via CD95-immunoprecipitation(figur 4). CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 och c-FLIPs observerades i dessa CD95-immunoprecipitations, vilket indikerar effektiv DISC bildas. Viktigt är att klyvningsprodukterna av procaspase-8a/b: p43/p41, p30 och p18 upptäcktes vid DISC, vilket indikerar aktivering av procaspase-8 och dess efterföljande bearbetning. I synnerhet upptäcktes klyvningsprodukterna av procaspase-8 p43/p41 och p18, vilket anger de två ovannämnda stegen i p43 bearbetningsvägen. Dessutom upptäcktes p30-produkten, vilket indikerar den alternativa vägen för caspase-8 bearbetning. Dessutom följs aktivering av procaspase-8 vid DISC av klyvning av dess substrat såsom c-FLIP-proteiner.
Urringningsprodukterna från c-FLIP-p43-FLIP och p22-FLIP-upptäcktes i immunoprecipitations, vilket indikerar caspase-8 aktivering(figur 4). Viktigt är att varken FADD, procaspase-8, procaspase-10 och c-FLIPs eller deras klyvningsprodukter upptäcktes i immunprecipitationsproverna från obehandlade celler, vilket understryker specificiteten hos DISC-immunoprecipitation (figur 4). Viktig information kan erhållas från dessa experiment genom att kvantifiera banden som motsvarar de olika klyvningsprodukterna i procaspase-8 (figur 4). Denna information kan användas i matematisk modellering av apoptosnätverk och ger kvantitativa insikter om vägreglering.
Nivån på caspase-8-aktiveringen vid DISC moduleras av c-FLIPs. Därför valdes HeLa-CD95-celler som överuttrycker c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 som det andra exemplet (figur 5). Effekterna av c-FLIP L-isoformen i dessa experiment kunde observeras, vilket resulterade i en annan hastighet av procaspase-8a/b bearbetning än p43/p41 vid DISC jämfört med motsvarande proteolys av procaspase-8 vid DISC i föräldrarnas HeLa-CD95 celler, som beskrivs av Hillert et al. 15. I likhet med observationerna i figur 4upptäcktes ingen rekrytering av FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP-proteiner och deras klyvningsprodukter i immunprecipitationerna från HeLa-CD95-FL-celler utan CD95L-behandling, vilket stöder specificiteten hos dessa immunprecipitationer. Mer bevis för immunprecipitationernas specificitet är frånvaron av rekrytering av procaspase-3 och poly(ADP-ribose)polymeras 1 (PARP1) till DISC, som observerades i CD95L-behandlade immunprecipitationer (figur 5). Dessa proteiner är inte en del av komplexet, och deras frånvaro i immunprecipitationssignalerna kan tjäna som bevis för frånvaron av ospecificerad bindning av rikliga cellulära proteiner.
Slutligen utfördes immunprecipitationer av CD95 DISC från suspensionsceller som ett tredje exempel, t.ex. aktiverade primära T-celler(figur 6). Dessa celler kännetecknas också av höga nivåer av CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 och c-FLIPs som observerades i anti-CD95-immunoprecipitations tillsammans med deras klyvningsprodukter (figur 6). Påvisande av procaspase-8 klyvningsprodukter i immunoprecipitations indikerar aktivering och bearbetning av denna initiator caspase i DISC-immunoprecipitation från primära T-celler. Dessa experiment indikerar att DISC kan immunoprecipitated från många vidhäftande och suspension celler och att caspase-8 bearbetning och aktivering kan valideras genom västra blot analys.
Bild 1: Schematisk presentation av CD95-signalvägen. CD95L utlöser DISC-enheten. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 och c-FLIP. FADD binder till CD95 via sin DD, medan procaspase-8, procaspase-10 och c-FLIPs interagerar via sina DED och bildar DED-filament. Bildandet av DED-filamenten fungerar som en plattform för procaspase-8 dimerization, bearbetning och efterföljande aktivering. Den aktiva caspase-8 heterotetramer, p182/ p102, aktiverar caspase-3 genom klyvning, vilket leder till apoptos. Förkortningar: CD = differentieringskluster; CD95L = CD95 ligand; DISC = dödsframkallande signalkomplex; DD = dödsdomän; FADD= Fasassocierad dödsdomän; c-FLIP = cellulärt FADD-liknande interleukin (IL)-1β-omvandlande enzymhämmande protein; DED = dödseffektordomän; c-FLIPL = c-FLIPLång. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Procaspase-8-bearbetning vid disken. Två sätt att procaspase-8a/b bearbetning på DISC visas. Det första sättet innebär p43/p41-generation följt av p18-formation. Det andra sättet innebär p30-generering följt av dess bearbetning till p18 och p10. Resterna numreras enligt sekvensen av procaspase-8a. Förkortningar: DED = death effector domain. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Schematisk presentation av den experimentella installationen av DISC-IP. Cellerna stimuleras med CD95L. Efter stimulering skördas och samlas cellerna, följt av olika tvättsteg. Cellerna lyses sedan och lysat samlas in. Därefter tillsattes protein A-sepharose pärlor och anti-APO-1 (anti-CD95) antikroppar till lysat och inkuberas över natten. Efter flera tvätt steg analyserades immunoprecipitations av västra blotting. Förkortningar: DISC = dödsframkallande signalkomplex; IP = immunoprecipitation; CD95L = CD95 ligand. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: CD95 DISC-formation i HeLa-CD95-celler. HeLa-CD95 celler stimulerades med 125 ng/mL CD95L för 30 min eller 1 h. CD95 DISC-IPs utfördes med anti-APO-1 (anti-CD95) antikroppar. Sammansättningen av IPs undersöktes av western blot analys med hjälp av antikropparna för de angivna proteinerna. Actin användes som lastkontroll. Indata visas. Kvantifiering av procaspase-8 klyvningsprodukter vid DISC visas och normaliseras till CD95-signal. Förkortningar: dvs. = lång exponering; s.e. = kort exponering; BC = kontroll IP med endast pärlor, utan tillsats av antikroppar; CD95L = CD95 ligand; DISC = dödsframkallande signalkomplex; IP = immunoprecipitation; FADD = Fasassocierad dödsdomän; c-FLIP = cellulärt FADD-liknande interleukin (IL)-1β-omvandlande enzymhämmande protein; c-FLIPL = c-FLIPLång; c-FLIPS = c-FLIPKort; M = molekylvikt i kiloDalton (kDa). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5:CD95 DISC-formation i c-FLIPL-överuttryckande HeLa-CD95-celler. HeLa-CD95-FL celler stimulerades med 250 ng/mL CD95L för de angivna tidspunkterna (1-3 h). CD95 DISC-IPs utfördes med anti-APO-1 (anti-CD95) antikroppar. Sammansättningen av IPs undersöktes av western blot analys och analyseras för de anges proteiner. Actin användes som lastkontroll. Indata visas. Kvantifiering av procaspase-8 klyvningsprodukter vid DISC visas och normaliseras till CD95-signalen. Ett representativt experiment av två visas. Förkortningar: dvs. = lång exponering; s.e. = kort exponering; BC = kontroll IP med endast pärlor, utan tillsats av antikroppar; CD95L = CD95 ligand; DISC = dödsframkallande signalkomplex; IP = immunoprecipitation; FADD = Fasassocierad dödsdomän; c-FLIP = cellulärt FADD-liknande interleukin (IL)-1β-omvandlande enzymhämmande protein; c-FLIPL = c-FLIPLång; PARP1 = poly(ADP-ribose)polymeras 1; M = molekylvikt i kiloDalton (kDa). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6:CD95 DISC-bildning i primära T-celler. Primära aktiverade T celler stimulerades med 500 ng/mL CD95L för 15 min och 30 min. CD95 DISC-IPs utfördes med anti-APO-1 (anti-CD95) antikroppar. Sammansättningen av IPs undersöktes av western blot analys och analyseras för de anges proteiner. Actin användes som lastkontroll. Kvantifiering av procaspase-8 klyvningsprodukter vid DISC visas och normaliseras till CD95-signalen. Indata visas. Förkortningar: dvs. = lång exponering; s.e. = kort exponering; CD95L = CD95 ligand; DISC = dödsframkallande signalkomplex; IP = immunoprecipitation; FADD = Fasassocierad dödsdomän; c-FLIP = cellulärt FADD-liknande interleukin (IL)-1β-omvandlande enzymhämmande protein; c-FLIPL = c-FLIPLång; M = molekylvikt i kiloDalton (kDa). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta tillvägagångssätt beskrevs först av Kischkel et al.27 och har framgångsrikt utvecklats sedan dess av flera grupper. Flera viktiga frågor måste övervägas för effektiv DISC-immunoprecipitation och övervakning caspase-8 bearbetning i detta komplex.
För det första är det viktigt att följa alla tvättsteg under immunoprecipitation. Särskilt viktiga är de sista tvättstegen i sefarospärlorna och torkningen av sefarospärlor. Detta måste göras korrekt för att öka signal/brusförhållandet för immunoprecipitation, vilket möjliggör detektion av caspase-8 rekrytering och bearbetning vid DISC. Flera studier har dock visat att detta preclearing steg inte är nödvändigt för att upptäcka caspase-8 rekrytering till DISC genom västra blotting7,23. Men som nämnts är tvättning av pärlor i slutet av immunprecipitation avgörande för att få tillförlitliga resultat. Ospecificerad bindning av rikliga cellulära proteiner till sefarospärlor kan i huvudsak minska de specifika signalerna från kärn-DISC-komponenterna. Som en viktig kontroll för frånvaron av den ospecificerade bindningen kan western blot analys av proteinerna, som rapporteras inte vara närvarande vid DISC, utföras. Ett exempel på denna analys ges i figur 5, där rekryteringen av PARP1 och caspase-3 till DISC-immunoprecipitation inte observerades. Detta indikerar specificiteten hos den särskilda immunoprecipitationen och tillräcklig tvättning av sefarospärlor under experimentet.
För det andra är det viktigt att utföra negativa kontroller såsom en kontroll endast för pärlor eller en immunoprecipitationskontroll med en antikropp med samma isotyp som den antikropp som används för immunprecipitation. För anti-APO-1-antikroppar kan antimus-IgG3-antikroppar användas som en isotypkontroll. För det tredje är det viktigt att övervaka resultaten av immunprecipitationen från obehandlade prover, där endast CD95 bör observeras. Detektion av FADD, c-FLIP eller procaspase-8 i dessa prover indikerar vanligtvis förekomsten av vissa brister i immunprecipitation protokollet eller tvätt steg. Detta kan ge upphov till antaganden om stimulering-oberoende associering av FADD eller c-FLIP med CD95, som kanske inte är helt korrekt, och istället indikera brister i immunoprecipitation. För det fjärde, för varje immunoprecipitation, måste ingångarna eller lysaterna noggrant analyseras parallellt för att mäta uttrycket och posttranslational modifieringar av kärnproteiner analyseras genom immunoprecipitation.
För det femte tillåter tidsberoende analys förändringar i komplexet att följas över tid och ger ännu en viktig bekräftelse på specificiteten hos de proteiner som rekryteras till komplexet. I detta avseende är en viktig fråga att varje cellinje har olika nivåer av CD95-uttryck och av intracellulära komponenter i detta komplex. Följaktligen måste den exakta tidpunkten för CD95 DISC-bildandet noggrant fastställas för varje enskild celltyp. Slutligen är den avgörande frågan för analysen av DISC-dynamiken jämförelsen av mängden protein i varje immunprecipitation. För CD95 DISC-immunoprecipitationer som utförs med anti-APO-1 antikroppar, mängden CD95 är ett nyckelmått på lika mycket av de komplex som jämförs. Detta kan vara svårt eftersom intensiteten av CD95 signalen i immunoprecipitations är relativt hög. Man måste dock hitta det optimala tidsintervallet för att mäta motsvarande västra fläcksignal. Ett annat hinder är att CD95 är ett mycket glykosylerat protein, vilket också bidrar till svårigheterna att upptäcka det vid immunprecipitation på grund av närvaron av ett visst mönster av flera "suddiga" band28.
DISC-immunoprecipitation analys ger en optimal grund för att upptäcka caspase aktivering och bearbetning. Immunoprecipitation i kombination med western blotting möjliggör kvantitativ detektion av klyvningsprodukter av procaspase-8a/b: p43/p41, p30 och p18, vilket framgår av denna studie (figur 4, figur 5och figur 6). Detta gör det i sin tur möjligt för experimenterare att följa förändringar i procaspase-8a/b bearbetning över tid och skilja olika klyvning steg av procaspase-8. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att beskriva caspase-8 aktivering i matematiska modeller och skilja mellan inter- och intramolekylär procaspase-8-bearbetning vid DISC7,20,29. Dessutom har mätning av caspase-8 klyvningsprodukter genom western blotting tydliga fördelar jämfört med konventionella caspase-8 aktivitetsanalyser baserade på IETD-substrat. I det senare fallet är det väl fastställt att IETD också fungerar som substrat för de andra caspaserna. Därför finns det allt fler bevis för att detektion av IETD-aktivitet indikerar en allmän ökning av kaspaseaktiviteten i cellen. Däremot kan användning av western blot-analys hjälpa till att specifikt tilldela motsvarande band i den västra bloten till caspase-8, så att forskaren kan vara säker på att caspase-8 aktiveras i detta komplex. Som nämnts ovan är dessutom mätning av caspase-8-bearbetning vid DISC ett utmärkt verktyg för matematisk modellering och systembiologiska studier. Sammantaget presenteras ett klassiskt arbetsflöde för att möjliggöra övervakning av olika steg för aktivering och bearbetning av procaspase-8, vilket är viktigt för att riva upp de molekylära mekanismerna för celldöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppmärksammar Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansierat av EU-programmet ERUF (Europeiska regionala utvecklingsfonden) och DFG (LA 2386) för att stödja vårt arbete. Vi tackar Karina Guttek för att hon stöttar våra experiment. Vi bekräftar prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) för att ge oss primära T-celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
